本發(fa)明涉及生物(wu)(wu)工程及生物(wu)(wu)醫藥，尤(you)其涉及一種重組(zu)蛋白及其制備方(fang)法和應(ying)用。

背景技術：

1、蛋白169是由(you)208個(ge)氨基酸殘基組成(cheng)的(de)單鏈多肽(tai)，在n端有一段約40個(ge)氨基酸殘基的(de)疏水信號肽(tai)，成(cheng)熟蛋白含169個(ge)氨基酸(40-208aa)，理(li)論(lun)相(xiang)對(dui)分子質量為(wei)19.3kda。它對(dui)維持皮膚(fu)(fu)屏(ping)障(zhang)、皮膚(fu)(fu)修(xiu)護具(ju)(ju)(ju)有重(zhong)要(yao)作用(yong)，且具(ju)(ju)(ju)有顯(xian)著的(de)促進保(bao)濕因子生成(cheng)、提高皮膚(fu)(fu)屏(ping)障(zhang)保(bao)護具(ju)(ju)(ju)有重(zhong)要(yao)意義，具(ju)(ju)(ju)有廣闊(kuo)的(de)開發和應用(yong)前景。

2、目前(qian)利用(yong)基因(yin)工程技術可以實現(xian)蛋白(bai)原核可溶性表(biao)達(da)并純化，這為獲得大(da)量的蛋白(bai)產(chan)(chan)品提供了(le)基礎(chu)和保(bao)證。雖然重(zhong)(zhong)組蛋白(bai)169已經在多種(zhong)宿主中(zhong)成(cheng)功表(biao)達(da)，但是大(da)腸桿菌(jun)(jun)(jun)作為分(fen)子生物(wu)學實驗室(shi)的主力，也是工業上最重(zhong)(zhong)要的生物(wu)之一，具(ju)有易于培養、發(fa)酵周期短、成(cheng)本廉價(jia)等優點(dian)，仍然是基因(yin)工程菌(jun)(jun)(jun)產(chan)(chan)業化的理(li)想宿主。但重(zhong)(zhong)組蛋白(bai)169在大(da)腸桿菌(jun)(jun)(jun)表(biao)達(da)系統中(zhong)能否高度表(biao)達(da)仍受諸多因(yin)素的影響，為了(le)實現(xian)大(da)規模生產(chan)(chan)代謝產(chan)(chan)物(wu)，需(xu)要通過發(fa)酵優化實現(xian)基因(yin)工程菌(jun)(jun)(jun)高生產(chan)(chan)率，進而實現(xian)工業化生產(chan)(chan)代謝產(chan)(chan)物(wu)。

3、目前(qian)重(zhong)組工(gong)程菌的(de)發酵(jiao)優化主要通(tong)過發酵(jiao)條件(jian)(例如ph值、溫度、攪拌速度等)和合適的(de)培(pei)養基成(cheng)(cheng)分(fen)(例如碳、氮源等)來(lai)提高生產(chan)效率(lv)，降(jiang)低生產(chan)成(cheng)(cheng)本(ben)。因此，不斷開發并優化重(zhong)組工(gong)程菌的(de)生產(chan)工(gong)藝以(yi)實(shi)現(xian)減少(shao)培(pei)養體(ti)積、縮短(duan)生產(chan)周期、方便分(fen)離提取、降(jiang)低生產(chan)成(cheng)(cheng)本(ben)等目的(de)，具有重(zhong)大意義。

技術實現思路

1、鑒于現(xian)有蛋(dan)白169的制備方法中存在菌(jun)體發酵密度(du)(du)低、目(mu)標產(chan)(chan)(chan)物產(chan)(chan)(chan)量(liang)不(bu)足(zu)等問題，本發明提供一(yi)種蛋(dan)白169及其制備方法和應用，有效提高(gao)菌(jun)體發酵密度(du)(du)同時增加(jia)目(mu)標產(chan)(chan)(chan)物產(chan)(chan)(chan)量(liang)，一(yi)方面解決(jue)重(zhong)組工程菌(jun)發酵密度(du)(du)和產(chan)(chan)(chan)量(liang)的問題，另一(yi)方面提供具有高(gao)修護和保濕活性的重(zhong)組蛋(dan)白169。

2、為實(shi)現上述目的，本發明采取的技(ji)術方案是：

3、一種(zhong)重組蛋白，所述重組蛋白具有如seq?id?no.1所示的氨(an)基酸序列。

4、本發明(ming)還提供一種載有上述的(de)重組(zu)蛋白(bai)的(de)基因(yin)的(de)表達(da)載體，所(suo)述表達(da)載體是將所(suo)述重組(zu)蛋白(bai)的(de)基因(yin)與空載體質粒連接獲得(de)。

5、進一步的，所(suo)述表達(da)載體(ti)的獲得方法為(wei)：

6、s1.以seq?id?no.2所(suo)示核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為起(qi)始序(xu)列(lie)設計(ji)合成所(suo)述重組(zu)蛋白核苷(gan)酸序(xu)列(lie)；

7、s2.將s1所得重(zhong)(zhong)組(zu)蛋白核苷酸序列與上(shang)游引(yin)物pⅰ和下游引(yin)物pⅱ連接，得到重(zhong)(zhong)組(zu)蛋白成熟肽(tai)全編碼核苷酸序列；

8、所述上游引物pⅰ核苷酸序列seq?id?no.3為：5'tcacatatgcaagcccttggtcaggacatggtgtcac?3'；

9、所述下(xia)游(you)引(yin)物pⅱ核苷酸(suan)序(xu)列(lie)seq?id?no.4為(wei)：5'tcaggatccttatgagtgtaccaccattggaagaaagt3'；

10、s3.采用pcr方(fang)法擴增s2所得重組蛋(dan)白成熟肽全編碼核苷(gan)酸(suan)序列；

11、s4.將s3擴增所(suo)得重組蛋白成熟肽(tai)全編碼核苷(gan)酸序列及(ji)空載(zai)體質粒使用相同的限制性核酸內切(qie)酶進行(xing)雙酶切(qie)；

12、s5.將s4所得的酶切后重(zhong)組蛋(dan)白成熟(shu)肽全編(bian)碼核苷酸序列和酶切后空載體質粒用dna連接酶連接，即(ji)得所述表達(da)載體。

13、進一(yi)步的，所述空載體(ti)質粒選(xuan)自以(yi)下(xia)之一(yi)：pet-3c、pbv220、pqe30、pet22b、pgex-4t-1。

14、本發明(ming)還提(ti)供(gong)一種宿主細胞(bao)，其(qi)細胞(bao)內含有上(shang)述任(ren)一項(xiang)所述的表達載體。

15、本發明還(huan)提(ti)供一種上述(shu)(shu)的重組蛋白的制(zhi)備方法，通過前述(shu)(shu)的宿主(zhu)細胞獲得，所(suo)述(shu)(shu)制(zhi)備方法包括如下步(bu)驟：

16、步驟1，將所(suo)述宿主細胞(bao)加入培(pei)養(yang)基后進行超(chao)聲處理，然后進行初步培(pei)養(yang)；

17、步驟2，將(jiang)初步培養完(wan)畢的(de)細胞進(jin)行發酵培養，培養過程中(zhong)流加(jia)硫(liu)酸(suan)鎂(mei)溶(rong)液和葡萄糖溶(rong)液，發酵培養結(jie)束(shu)后(hou)加(jia)入誘(you)導劑誘(you)導，然后(hou)分離出(chu)菌體；

18、步(bu)驟3，將獲得的菌體稀釋，添加抗壞血酸溶液(ye)，在體系中加壓以持(chi)續形(xing)(xing)成直徑為1-50μm的微泡(pao)并保持(chi)3-6min，瞬(shun)時泄(xie)壓，重復加壓以形(xing)(xing)成微泡(pao)和瞬(shun)時泄(xie)壓的過(guo)程多(duo)次；

19、步驟4，分(fen)離出體系的上清液，進行柱層析(xi)后干燥，得到所述(shu)重組蛋白。

20、進一步(bu)的(de)，所述(shu)步(bu)驟1中(zhong)，超(chao)聲(sheng)(sheng)處理的(de)控(kong)制(zhi)參(can)數為：功率20-30khz，時間50-150s；和/或，所述(shu)初步(bu)培(pei)養過程包括(kuo)：將超(chao)聲(sheng)(sheng)處理后的(de)培(pei)養體系于(yu)37℃、200rpm振蕩培(pei)養12-24h。

21、進一步的，所(suo)(suo)述(shu)步驟2中(zhong)，硫酸(suan)鎂溶液的質量(liang)體(ti)積濃(nong)度為(wei)0.3-0.6％，葡萄(tao)糖(tang)溶液的質量(liang)體(ti)積濃(nong)度為(wei)25-35％；和/或，所(suo)(suo)述(shu)發(fa)酵培(pei)養至a600達到19-21；和/或，所(suo)(suo)述(shu)誘(you)導劑iptg，其在體(ti)系(xi)中(zhong)的終(zhong)濃(nong)度為(wei)0.7mmol/l，誘(you)導時(shi)間(jian)為(wei)3-5h。

22、進(jin)一步(bu)的(de)，所述(shu)步(bu)驟3中(zhong)，添加質量體積濃度為(wei)0.1-0.3％的(de)抗壞血酸溶液；和(he)/或(huo)，所述(shu)加壓(ya)是(shi)利用氣泵在體系(xi)中(zhong)加壓(ya)至800-1200kpa；和(he)/或(huo)，重(zhong)復加壓(ya)以形成(cheng)微泡和(he)瞬(shun)時泄壓(ya)的(de)過程2-3次。

23、本發明還提供一種上(shang)述的(de)重(zhong)組蛋白在保濕和/或維持皮膚屏障修(xiu)護的(de)應用。

24、與現(xian)有技術相比，本發(fa)明具有如下優點及有益效果：

25、第一，本(ben)發明的重組蛋白制備方法具有如下優點：

26、(1)通過低(di)(di)頻超聲篩選活性強(qiang)的菌種(zhong)，以(yi)提(ti)高產率(lv)，同時通過低(di)(di)頻超聲可以(yi)刺激菌體內(nei)部，與(yu)正常的菌種(zhong)相比提(ti)高蛋白表達率(lv)；

27、(2)通(tong)過流加硫酸鎂和葡萄糖，可以實現高(gao)密(mi)度培養，抑制菌代(dai)謝(xie)產(chan)物的(de)(de)積累，提供最適環境條件，以提高(gao)大腸(chang)桿(gan)菌繁殖的(de)(de)穩定(ding)性，保(bao)證質(zhi)粒傳代(dai)過程(cheng)中的(de)(de)穩定(ding)性性，進而提高(gao)菌種產(chan)量及表達量；

28、(3)通過(guo)在(zai)(zai)后處理中(zhong)添加抗壞血酸，可以保(bao)證蛋白在(zai)(zai)處理過(guo)程中(zhong)結構(gou)穩(wen)定(ding)，不會(hui)失活。經(jing)過(guo)空(kong)氣(qi)泵氣(qi)體(ti)加壓(ya)，導致液體(ti)內(nei)部(bu)出現1-50μm的(de)微(wei)(wei)泡(pao)，微(wei)(wei)氣(qi)泡(pao)在(zai)(zai)瞬(shun)時壓(ya)縮和瞬(shun)時放壓(ya)的(de)交(jiao)互作用下，發生交(jiao)替壓(ya)縮和膨(peng)脹直(zhi)至微(wei)(wei)泡(pao)塌(ta)陷，在(zai)(zai)微(wei)(wei)泡(pao)塌(ta)陷破裂的(de)瞬(shun)間，會(hui)在(zai)(zai)極小的(de)區(qu)域(yu)內(nei)釋放能量(liang)，從而改變細菌(jun)細胞(bao)膜的(de)通透性，甚至破裂。該方法(fa)比(bi)起其他傳統(tong)破壁方法(fa)操作簡單，有效成(cheng)分溶出率高(gao)。

29、第二，本發明(ming)制得的(de)(de)蛋白169用(yong)于皮(pi)膚(fu)屏(ping)障(zhang)相關因子(zi)及(ji)(ji)保濕(shi)因子(zi)的(de)(de)表(biao)達(da)實驗，結果(guo)(guo)為其(qi)對(dui)(dui)皮(pi)膚(fu)屏(ping)障(zhang)相關因子(zi)capase-14和(he)保濕(shi)因子(zi)aqp3具有(you)很好的(de)(de)促表(biao)達(da)效(xiao)果(guo)(guo)，表(biao)明(ming)該重(zhong)組蛋白對(dui)(dui)于屏(ping)障(zhang)功能受損(sun)有(you)益(yi)，可加強皮(pi)膚(fu)對(dui)(dui)外界(jie)損(sun)傷的(de)(de)修(xiu)(xiu)護(hu)，因此有(you)望用(yong)于化(hua)妝產(chan)品(pin)，尤其(qi)是修(xiu)(xiu)護(hu)舒緩及(ji)(ji)保濕(shi)的(de)(de)化(hua)妝品(pin)中。

技術特征：

1.一種重組(zu)蛋白，其特征(zheng)在(zai)于(yu)，所述重組(zu)蛋白具有如seq?id?no.1所示的氨(an)基酸序(xu)列。

2.一種載(zai)有(you)權(quan)利(li)要求(qiu)1所述(shu)的(de)重組蛋(dan)白的(de)基(ji)(ji)因(yin)的(de)表(biao)達載(zai)體(ti)，其特征在于，所述(shu)表(biao)達載(zai)體(ti)是將所述(shu)重組蛋(dan)白的(de)基(ji)(ji)因(yin)與(yu)空載(zai)體(ti)質粒(li)連接獲得。

3.根據權(quan)利要求(qiu)2所(suo)(suo)述的表達載體(ti)，其特征(zheng)在(zai)于，所(suo)(suo)述表達載體(ti)的獲得方法為：

4.根據權(quan)利要求(qiu)2或3所述(shu)的(de)表達載(zai)體(ti)，其特征在于，所述(shu)空載(zai)體(ti)質粒選(xuan)自以(yi)下(xia)之一(yi)：pet-3c、pbv220、pqe30、pet22b、pgex-4t-1。

5.一(yi)種宿(su)主(zhu)細(xi)胞(bao)，其特(te)征在于，其細(xi)胞(bao)內含(han)有權利(li)要求2-4任一(yi)項所(suo)述的表達載體。

6.一種權(quan)利(li)要求1所(suo)述的重組蛋(dan)白的制備(bei)方法，其特征(zheng)在于，是通過權(quan)利(li)要求5所(suo)述的宿主細胞獲得，所(suo)述制備(bei)方法包括如(ru)下步驟：

7.根據權利要求6所(suo)述(shu)的制備(bei)方法(fa)，其特征在于，所(suo)述(shu)步(bu)驟1中，超聲處(chu)理的控(kong)制參數為：功率(lv)20-30khz，時間(jian)50-150s；和(he)/或，所(suo)述(shu)初(chu)步(bu)培(pei)養(yang)過程包括：將超聲處(chu)理后(hou)的培(pei)養(yang)體(ti)系于37℃、200rpm振蕩(dang)培(pei)養(yang)12-24h。

8.根(gen)據權利(li)要求6所述(shu)的(de)制備(bei)方法，其(qi)特征在(zai)于(yu)，所述(shu)步驟2中，硫酸(suan)鎂(mei)溶液的(de)質(zhi)量體積濃(nong)度(du)為(wei)(wei)0.3-0.6％，葡萄(tao)糖溶液的(de)質(zhi)量體積濃(nong)度(du)為(wei)(wei)25-35％；和/或(huo)，所述(shu)發酵培(pei)養至a600達到19-21；和/或(huo)，所述(shu)誘導劑(ji)iptg，其(qi)在(zai)體系中的(de)終濃(nong)度(du)為(wei)(wei)0.7mmol/l，誘導時(shi)間為(wei)(wei)3-5h。

9.根據權利要求6所述的(de)制備方法，其(qi)特征在于，所述步(bu)驟3中(zhong)，添(tian)加質(zhi)量體(ti)積濃(nong)度為0.1-0.3％的(de)抗壞血酸溶液；和(he)(he)/或(huo)，所述加壓是利用氣泵在體(ti)系中(zhong)加壓至800-1200kpa；和(he)(he)/或(huo)，重復加壓以(yi)形成微泡和(he)(he)瞬時泄壓的(de)過程(cheng)2-3次。

10.一種權利要求(qiu)1所述的重組蛋白在(zai)維持皮膚屏障(zhang)和/或保(bao)濕上的應用。

技術總結
本發明提供一種重組蛋白及其制備方法和應用，所述重組蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。該重組蛋白對于屏障功能受損有益，可加強皮膚對外界損傷的修護，因此有望用于化妝產品，尤其是修護舒緩的化妝品中。本發明也提供了該重組蛋白的表達載體、宿主細胞及其制備方法和應用，該制備方法提高了菌種產量及表達量，比起其他傳統破壁方法操作簡單，有效成分溶出率高，有效提高菌體發酵密度同時增加目標產物產量，一方面解決了重組工程菌發酵密度和產量的問題，另一方面能夠提供具有高保濕和修護活性的重組蛋白。

技術研發人員：高悅譯,劉幫民,王麗華,趙娜,徐明
受保護的技術使用者：廣州力鑫生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19