專利名稱：：固相多肽合成阿托西般的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種阿托西般的制備方法，具體涉及固相多肽合成阿托西般的制備方法。
背景技術：
：中文名阿托西般，醋酸阿托西般，阿托西班、醋酸阿托西班。英文名Atosiban，AtosibanAcetate.結構式為Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2分子式為C43H67Nn012S2.分子量994.2阿托西般在臨床上為一種可以靜注的子宮內及蛻膜、胎膜上受體的環狀肽催產素競爭性拮抗劑。使用本品后可劑量相關性地抑制宮縮，并使環狀肽催產素介導的前列腺素分泌減少，達到保胎的目的，可用于18歲以上，孕齡24—33周，胎兒心率正常的孕婦。國外懷孕婦女的臨床實驗中，本品分別與e2激動劑(利托君、沙丁胺醇、特布他林)中的一種進行了雙盲比較研究，治療意圖分析的綜合結果顯示，本品有效地抑制宮縮，達到保胎的作用，且不良反應和停藥者均較少。綜合分析中兩組的平均生產孕齡及胎兒或嬰兒的指標(出生體重、存活率、呼吸窘迫綜合征或顱內出血的發生率)未見顯著差異。美國專利4,504,469是采用Boc路線，以氯甲基樹脂為起始原料，經縮合反應完成接肽，用干燥的液氨進行切肽，最后經氧化反應和分離純化。該專利存在的主要缺陷是，生產周期較長，操作復雜，人工成本較高，產生三廢較多，不能滿足有關方面的需要。
發明內容本發明的目的是公開一種,相多肽合成阿托西般的制備方法，以克服現有技術存在的缺陷。本發明的方法包括如下步驟(1)以RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt或BOP/HOAt為縮合劑進行接肽反應，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈使用保護的巰基丙酸(Map(X));得保護的九肽樹脂后，同步進行脫側鏈保護基團及切肽。所說的RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂為一種常用的氨基樹脂，可采用市售產品，如天津南開和成科技有限公司牌號為HCRAm04-l的產品；(2)然后加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集還原型阿托西般粗品；(4)將還原型阿托西般粗品溶于水中，用氨水調節PH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；(5)將收集的粗品通過制備型HPLC(ds或Q柱)分離純化，獲得目標產物，總收率可達到18.5%以上。以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸時的反應溫度為10~60°C，切肽溫度為10~60°C;優選的，本發明的方法，包括如下步驟RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂與Fmoc-Gly-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Orn(Boc)-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Pro-OH、TBTU/HOBT和六氫吡瞎反應，獲得Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmoc—Thr(tBu)-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)陽Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmoc-Ile-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Fmoc-Ile—Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmap(X)/TBTU/HOBt反應，獲得Map(SX)-D-Tyr(OEtHle-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly誦樹脂；然后與TFA/HBr/HAc/TIS/EDT反應，獲得Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2(還原型阿托西班)；然后進行1.氧化；2.純化；3.去鹽；4.凍干，獲得IIMap-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2(阿托西班)。更為具體的包括如下步驟(1)樹脂的預處理將RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂，用DMF浸泡0.52小時，使樹脂充分溶脹，氮氣吹干，加入六氫吡啶的DMF溶液，108(TC反應1060分鐘，氮氣吹濾去除六氫吡啶，DMF洗滌，氮氣吹干。六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶DMF=1:3~5體積比；六氫吡啶的DMF溶液中，RinkAmideMBHA樹脂的濃度比為1克/515ml。(2)Fmoc-Gly-樹脂的制備將步驟(1)預處理的樹脂與Fmoc-Gly-OH(MW:297.3)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，將混合物在10-60。C的條件下反應0.5-3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；NMM:DMF=1:5~15，體積比；Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；然后加入六氫吡啶的DMF溶液，106(TC反應10~60分鐘，氮氣吹千，用DMF洗漆，氮氣吹干，獲得Fmoc-Gly-樹脂；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10-40%;六氫吡啶的DMF溶液中樹脂的重量的體積濃度為1克/515ml;反應通式為應通式為1.六氫吡錠RinkAmideAM-樹脂Fmoc-Gly-樹脂2.TBTU/HOBtFmoc-Gly-OH(3)Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在歩驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，1060。C反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Om(Boc)-OH(MW:454.5)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，106(TC反應0.5~3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂；NMM:DMF=1:515，體積比；反應體系中Fmoc-Orn(Boc)-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10~40%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為(4)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(3)的Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，10~60°C反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Pro-OH(MW337.4)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，1060。C反應0.5~3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；NMM:DMF=1:5~15，體積比；1.六氫吡啶Fmoc-Gly-樹脂Fmoc-Om(Boc)-Gly-樹脂2.TBT面OBtFmoc-Om(Boc)-OH反應體系中Fmoc-Pro-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10~40%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂-^Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂2.TBTU/HOBtFmoc-Pro-OH(5)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(4)的Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，10~60。C反應10-60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7)、TBTUMW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW401.2)和DMF混合，將混合物10-60。C反應0.5~3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂樹脂；NMM:DMF=1:5~15，體積比；反應體系中Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10~40%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂-^Fmoc-Cys(Trt)國Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂2.TBT簡OBtFmoc-Cys(Trt)-OH(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>樹脂的制備在步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，106(TC反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物1060。C反應0.5~3.0小時，氮氣吹千，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；NMM:DMF=1:5~15,體積比；反應體系中Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為1040%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂-2.TBT簡OBtFmoc-Asn(Trt)-OHFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)隱Gly-樹脂(7)Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)國Gly國樹脂的制備在步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，1060'C反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(MW:397.5)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物10-60。C反應0.5~3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)國Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；NMM:DMF=1:5~15，體積比；反應體系中Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10~40%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂-2.TBT-OBtFmoc-Thr(1Bu)-OHFmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂(8)Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(7)的Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，106(TC反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Ile-OH(MW:353.4)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物1060。C反應0.5~3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；NMM:DMF=1:5~15，體積比；反應體系中Fmoc-Ile-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為1040%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂-2.TBTU/HOBtFmoc-Ile-OHFmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂(9)Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備在歩驟(8)的Fmoc-Ile-Thr(tBu)隱Asn(Trt)-Cys(Trt)曙Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，106(TC反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH(MW:413)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物106(TC反應0.5~3.0小時，氮氣吹千，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)，Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；NMM:DMF=1:5~15，體積比；反應體系中Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10~40%;六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為l克/515ml;反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂-2.TBT蘭OBtFmoc-D陽Tyr(OEt)-OHFmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂(10)Map(SX)-D曙Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備在歩驟(9)的Fmoc陽D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，1060'C反應10~60分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Map(SX)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF,將混合物106(TC反應0.5~3.0小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；NMM:DMF=1:5~15，體積比；反應體系中Map(SX)的摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；TBTU摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；HOBT摩爾數為樹脂摩爾數的2-6倍；甲醇洗滌，抽干，氮氣吹干，得保護還原型阿托西般樹脂；反應通式為Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)國Asn(Trt)-Cys(Trt)國Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂Map(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂(11)切肽將切肽試劑加入保護的還原型阿托西般樹脂，106(TC反應26小時，過濾，抽干，濾液加乙醚沉淀，過濾收集沉淀得還原型阿托西般粗品(MW-833.96),收率為96%;所說的切肽試劑為TFA/HBr/HAc/TIS/EDT=(800-900ml/25陽40ml/5-20ml/40-60ml/20-30ml);反應通式為Map(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂TFA/HBr/HAc/TIS/EDT-^Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2以還原型阿托西般樹脂的重量計，切肽試劑的加入量為520ml/g;(12)氧化(二硫鍵的形成)將還原型阿托西般粗品溶于水中，加入濃度為0.11.5mol/L的氨水，調節pH到7.5-10.0，通空氣攪拌約1530小時，過濾；反應通式為Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2p『.5-10.0,02-^M^p-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2(13)純化1.六氫吡啶2.TBT簡OBtMap(SX))-OH濾液流經制備型HPLC(C18或C"柱進行純化流速為200-800ml/min;用分析型HPLC跟蹤收集所需要的流出液。樣品峰合并后，采用常規的方法去鹽、除乙腈、凍干，約得白色疏松塊狀物成品；流動相為0.1-0.9M醋酸鹽緩沖液乙腈(70-90:30-10)，體積比；或0.1-0.9M磷酸鹽緩沖液乙腈(70-90:30-10)，體積比；或0.05%-0.1%三氟醋酸緩沖液乙腈(70-90:30-10),體積比；由上述公開的技術方案可見，本發明的方法，采用RinkAmide樹脂、RinkAmideAM樹脂或RinkAmideMBHA樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸的方法，接肽收率高。選用Fmoc-氨基酸，原料來源方便，最后一個肽鏈使用保護的巰基丙酸(M叩(SX))，簡化了工藝，降低了成本；采用切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)進行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，且提高收率，采用制備型HPLC(C18或C8)柱進行分離純化，避免使用TFA(三氟醋酸)進行純化，減少三廢，純化收率高達25%以上，每步接肽收率均在99%以上；切肽后收率為95.4%，總收率為18.5%。由此可見，本發明的方法便于工業化實施，具有較大的產業化前景。圖l為本發明的流程圖。具體實施例方式實施例和前述過程中所采用的原料列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>10<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例1肽鏈制備稱取RinkAmideAM樹脂相當于720mmol的量(200目，0.80mmol/g)，裝入SHYM-25的多肽合成儀中，用6000mlDMF浸泡，使樹脂溶脹，抽干。加入6400毫升體積濃度為25。/。六氫吡啶的DMF溶液，25'C振搖30分鐘。抽干，分別用DMF、洗滌數次，抽干。Fmoc-Gly-樹脂的制備力口Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，1440mmo1)428g、HOBT(MW:135.1，1440mmol)195g、TBTU(MW:321,1440mmol)462g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25'C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25%六氫吡淀的DMF溶液，25'C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-Orn(Boc)-OH(MW:454.5，1440mmo1)654g、TBTU(MW:321，1440mmol)462g，HOBT(MW:135.1，1440讓ol)195g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF,將混合物25t振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25X六氫吡啶的DMF溶液，25。C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。力口Fmoc-Pro誦OH(MW:337.4，1440mmo1)486g,TBTU(MW:321，1440腿o1)462g，HOBT(MW:135.1，1440mmol)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25'C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25X六氫吡啶的DMF溶液，25'C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。力口Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7,1440簡ol)843g，TBTU(MW:321,1440讓ol)486g,HOBT(MW:135.1,1440函ol)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25'C振搖1.5小時。抽干，DMF洗漆數次，抽干。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25X六氫吡啶的DMF溶液，25'C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。力口Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7，1440mmol)859g，TBTU(MW:321，1440讓o1)486g，HOBT(MW:135.1，1440腿o1)195g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25'C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25X六氫吡啶的DMF溶液，25'C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗漆數次，抽干。加Fmoc-Thr(tBu)-OH(MW:397.5，1440mmol)572g，TBTU(MW:321，1440mmo1)486g，HOBT(MW:135.1,1440mmo1)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25'C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)誦Cys(Trt)陽Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25X六氫吡啶的DMF溶液，25t:振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。加Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，1440mmol)509g，TBTU(MW:321,1440mmo1)486g，HO^T(MW:135.1，1440腿o1)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25。C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備加入6400毫升體積濃度為25X六氫吡啶的DMF溶液，25"C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。力口Fmoc隱D-Tyr(OEt)-OH(MW:413,1440mmo1)595g，TBTU(MW:321,1440mmo1)486g，HOBT(MW:135.U440mmo1)195g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，將混合物25'C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。Map-D-Tyr(OEt)國Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備加入400毫升體積濃度為25%六氫吡啶的DMF溶液，25。C振搖30分鐘。抽干，用DMF洗滌數次，抽干。力口Map(MW:196，1440mmo1)282g、TBTU(MW:321，1440mmol)486g，HOBT(MW:135.1，1440mmo1)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF,將混合物25。C振搖1.5小時。抽干，DMF洗滌數次，抽干。再用無水甲醇洗滌數次。抽干后，放入真空抽干器中抽干，稱重，得保護阿托西般樹脂約700g。切肽取700g保護的阿托西般樹脂轉移到切肽瓶中，冷卻下，邊攪拌邊加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT=850ml/34ml/llml/51ml/25ml),25。C攪拌3小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約37g還原型阿托西般粗品(MW^833.96，44.4mmo1)，收率為95.4%。氧化(二硫鍵的形成)將37g還原型阿托西般粗品溶于40L純化水中，在攪拌下加入lmol/L氨水，調節pH到8，攪拌過夜，過濾。取700g還原型阿托西班粗品溶于5000ml純化水中，用NaOH調pH7.5，在攪拌下加入雙氧水，室溫反應，液相色譜儀跟蹤檢測，確定反應終點。力BHAc至PH4.5土0.5后，過濾。純化濾液經制備型HPLC(C18柱)進行純化；流動相0.5M磷酸緩沖液乙腈(80:20);流速為550ml/min;檢測波長為220nm;用分析型HPLC跟蹤收集所需要的流出液。樣品峰合并后去鹽、除乙腈、凍干，約得132g白色疏松塊狀物成品(MW:993.4，133mmo1);總收率約18.5%(以RinkAmideAM-樹脂的720mmol計)。權利要求1.固相多肽合成阿托西般的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)以RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt或BOP/HOAt為縮合劑進行接肽反應，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈使用保護的巰基丙酸(Map(SX))；得保護的九肽樹脂后，同步進行脫側鏈保護基團及切肽；(2)然后加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集還原型阿托西般粗品；(4)將還原型阿托西般粗品溶于水中，用氨水調節PH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；(5)將收集的粗品通過制備型HPLC(C18或C8柱)分離純化，獲得目標產物。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂與Fmoc-Gly-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Orn(Boc)-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Om(Boc)-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Pro-OH、TBTU/HOBT和六氫吡錠反應，獲得Fmoc-Pro-0rn(Boc)-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc陽Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；然后與Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氫吡啶反應，獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)陽Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmoc—Thr(tBu)-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Fmoc-Thr(但u)陽Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmoc-Ile-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Fmoc-Ile—Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Fmoc-D-Tyr(OEt)陽Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)陽Gly-樹脂；然后與六氫吡啶、Map(X)-OH/TBTU/HOBt反應，獲得Map(SX)-D-Tyr(OEt)隱Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)隱Gly-樹脂；然后與TFA/HBr/HAc/TIS/EDT反應，獲得Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2(還原型阿托西班)；然后進行1.氧化；2.純化；3.去鹽；4.凍干，獲得Map-D-Tyr(OEt)國Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn墨Gly-NH2(阿托西班)。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樹脂的預處理將RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂，用DMF浸泡，使樹脂溶脹，氮氣吹干，加入六氫吡啶的DMF溶液，10-80t:反應1060分鐘，氮氣吹濾去除六氫吡啶，DMF洗滌，氮氣吹干；(2)Fmoc-Gly-樹脂的制備將步驟(1)預處理的樹脂與Fmoc-Gly-OH(MW:297.3)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW^01.2)和DMF混合，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；然后加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干，獲得Fmoc-Gly-樹脂；應通式為1.六氫吡啶RinkAmideAM-樹脂_Fmoc-Gly-樹脂2.TBT簡OBtFmoc-GIy-OH(3)Fmoc-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Orn(Boc)-OH(MW:454.5)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW^01.2)和DMF混合，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂；反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Gly-樹脂_^Fmoc-Om(Boc)-Gly-樹脂2.TBTU/HOBtFmoc-Orn(Boc)-OH(4)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(3)的Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干，加入Fmoc-Pro-OH(MW337.4)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW401.2)和DMF混合，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；反應通式為1.六氫吡錠Fmoc-Orn(Boc)-Gly-樹脂-^-^Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂2.TBTU/HOBtFmoc-Pro-OH(5)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(4)的Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7)、TBTUMW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹千；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂樹脂；反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂-^Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂2.TBT簡OBtFmoc-Cys(Trt)-OH(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Asn(Trt)隱Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂反應通式為Fmoc-Cys(Trt)-Pro隱Orn(Boc)-Gly-樹脂Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂(7)Fmoc-Thr(但u)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹千，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(MW:397.5)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂；反應通式為l.六氫n比啶Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂-2.TBT簡OBtFmoc-Thr(tBu)-OHFmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)誦Gly-樹脂(8)Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro陽Orn(Boc)陽Gly-樹脂的制備在步驟(7)的Fmoc-Thx(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干，加入Fmoc-Ile-OH(MW:353.4)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應，氮氣吹千，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂-2.TBT區OBtFmoc-Ile-OHFmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro國Orn(Boc)-Gly-樹脂(9)Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂的制備1.六氫吡啶2.TBTU/HOBtFmoc-Asn(Trt)-OH在歩驟(8)的Fmoc隱Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹千，DMF洗滌，氮氣吹干，加入Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH(MW:413)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應，氮氣吹千，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂；反應通式，為1.六氫吡啶Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)"Pro陽Om(Boc)-Gly-樹脂-2.TBT簡OBtFmoc-D-Tyr(OEt)-OHFmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂(10)Map(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(9)的Fmoc-D國Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)國Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly誦樹脂中，加入夭氫吡啶的DMF溶液，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干，加入Map(SX)-OH、TBTU、HOBT、NMM禾卩DMF，反應，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干，洗滌，抽干，氮氣吹干，得保護還原型阿托西般樹脂；反應通式為1.六氫吡啶Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-2.TBTU/HOBtMap(SX))-OHMap(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂(11)切肽將切肽試劑加入保護的還原型阿托西般樹脂，反應，過濾，抽干，濾液加乙醚沉淀，過濾收集沉淀得還原型阿托西般粗品(MW:833.96)，收率為96%;所說的切肽試劑為TFA/HBr/HAc/TIS/EDTt800-900ml/25-40m]/5-20mV40-60ml/20-30ml);反應通式為Map(SX)-D隱Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-樹脂TFA/HBr/HAc/TIS/EDT-Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2(12)氧化將還原型阿托西般粗品溶于水中，加入濃度為0.11.5mol/L的氨水，調節pH到7.5-10.0，通空氣攪拌2028小時，過濾；反應通式為Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Oni-Gly-NH2P『.5-10.0，02_^Mlp國D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-CysZPro-Om-Gly-NH2(13)純化濾液流經制備型HPLC(C18或Q)柱進行純化用分析型HPLC跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，去鹽、除乙腈、凍干，約得白色疏松塊狀物成品。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，以還原型阿托西般樹脂的重量計，切肽試劑的加入量為520ml/g。5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(13)中，流動相為0.1-0.9M醋酸鹽緩沖液:乙腈(70-90:30-10)，體積比；或0.1-0.9M磷酸鹽緩沖液:乙腈(70-90:30-10)，體積比；或0.05%-0.1%三氟醋酸緩沖液:乙腈(70-90:30-10)，體積比。6.根據權利要求15任一項所述的方法，其特征在于，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸時的反應溫度為10~60°C。7.根據權利要求15任一項所述的方法，其特征在于，切肽溫度為10~60°C。全文摘要本發明公開了一種固相多肽合成阿托西般的制備方法，包括如下步驟以RinkAmide樹脂、RinkAmideMBHA樹脂或RinkAmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈使用保護的巰基丙酸(Map(SX))；得保護的九肽樹脂后，同步進行脫側鏈保護基團及切肽；然后切肽，收集還原型阿托西般粗品；調節pH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；再通過制備型HPLC(C₁₈或C₈柱)分離純化，獲得目標產物。本發明的方法，原料來源方便，簡化了工藝，降低了成本；三廢污染少，且收率高，便于工業化實施，具有較大的產業化前景。文檔編號C07K1/00GK101357937SQ200710044420公開日2009年2月4日申請日期2007年7月31日優先權日2007年7月31日發明者周逸明,頎崔申請人:崔頎;周逸明;上海蘇豪逸明制藥有限公司