新型抗癌組織蛋白酶制劑和使用其的癌癥并用療法抗癌劑的制作方法

文檔序號：1219629閱讀：479來源：國知局

專利名稱：新型抗癌組織蛋白酶制劑和使用其的癌癥并用療法抗癌劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型抗癌組織蛋白酶制劑和使用其的癌癥并用療法抗癌劑，更詳細地涉及，將組織蛋白酶E和/或其活性片段作為有效成分來含有的抗癌組織蛋白酶制劑以及將其和抗癌劑進一步作為有效成分來含有的新型抗癌組織蛋白酶制劑，通過將其與抗癌劑并用來增強抗癌劑的感受性的新型抗癌劑，即抗癌組織蛋白酶制劑、抗癌劑的感受性增強方法和使用該抗癌劑的癌癥的治療方法。
背景技術：
此前，為了治療癌癥而開發了很多的抗癌劑。但是，這些藥劑具有的比較
大的缺點為不止對癌細胞，對正常細胞也進行攻擊，對其造成損傷.殺傷。此前，一直在研究對正常細胞不起作用，而只攻擊癌細胞的抗癌作用物質，但是，這些物質即使在研究室水平上發現作用，在實際中也沒有效果，不能夠實用化。
另外，這些藥劑中的大多數在單獨使用時，經常得不到充分的效果，正在嘗試并用幾種抗癌劑的并用療法。但是，現狀是經常得不到充分的抗癌作用效果。
除了將作用機理不同的多個抗癌劑進行組合來并用的并用療法，還有人提出與其自身沒有抗癌作用的藥劑并用的并用療法，但是所述的并用療法也未起到充分的抗癌作用效果。
此外，也有人4是出抗癌劑與各種化合物的并用療法(例如，參照專利文獻 1、 2、 3)。但是，不得不說的是所述的并用療法也經常得不到充分的抗癌效果。
即使在并用療法中，如果可以增強抗癌劑的感受性，就可改善癌癥治療效果，所以期望著各種并用療法。
在本說明書中，"癌"或"腫瘤"等關聯的用語，并未特別嚴密地區別來
使用，以可互換的意思來使用，例如，使用"癌"這個用語時，只要沒有特別
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限定或者除了從上下文可以明白的情況，就應該理解為也意味著"腫瘤"等相關用語而使用的。因而，另一方面，使用"腫瘤"這個用語時，只要沒有特別限定或者除了從上下文可以明白的情況，就應該理解為也意味著"癌，，等相關用語而使用的。
組織蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，從高等動物到微生物中廣泛地分布，擔當著細胞內外的蛋白質代謝和處理等重要的生物體功能。作為所述的高等動物的天冬氨酸蛋白酶的一種，在細胞內的內體/溶酶體系統中存在組織蛋白酶D或
組織蛋白酶E。天冬氨酸蛋白酶參與細胞內外的蛋白質代謝和處理，所以，認
為其活性水平的變化與血壓異常、胃潰瘍和癌發生等各種病狀相關。
這些組織蛋白酶中，組織蛋白酶E是在胃、腸道等的消化道上皮、淋巴系統組織、泌尿器系統組織、血液系統細胞和皮膚中有限地分布的細胞內天冬氨酸蛋白酶。尤其是胃在全部的組織中，其組織蛋白酶E含量最高，比組織蛋白酶D含量多。組織蛋白酶E的細胞內定位也與組織蛋白酶D的細胞內定位明顯不同，具有組織.細胞特異性。在紅血球、破骨細胞和近端腎小管上皮細胞等中，存在于細胞膜，在小膠質細胞和巨噬細胞中，存在于內體/溶酶體系統中，在其他的很多外周組織中，存在于內質網和高爾基體中。從此前的研究可以知道，組織蛋白酶E，在除了紅血球的大部分細胞中，只有定位于內體 /溶酶體系統時，作為成熟型結構表現出蛋白酶活性。另外，在小膠質細胞和巨噬細胞等免疫系統細胞中，干擾素y或脂多糖等任何刺激施加于細胞被活化時，組織蛋白酶E在mRNA水平和蛋白質水平上都顯示出顯著增大，將其中的多數作為活性型酶分泌到細胞外，所以，人們將目光集中在了它們的與細胞功能的密切關系或在細胞外的功能。
另外，組織蛋白酶E,在幼齡大鼠的腦神經細胞中幾乎檢測不出，但是在老齡大鼠中，可以明確地確認出其存在于蓄積脂褐素或APP(淀粉樣蛋白前體蛋白質)的C末端片段的神經細胞中。另外，在前腦缺血或給與紅藻氨酸的大鼠的腦中，發現，在對這些刺激纟艮脆弱的部位存在的受到變性的神經細胞與這些刺激呼應，積累的活性化小膠質細胞中組織蛋白酶E的表達顯著地增大。這些結果顯示出，組織蛋白酶E在神經元死亡的實行過程中發揮重要的作用。
此外，已知組織蛋白酶E在免疫系統細胞中優先表達，而且是由活性化
噬菌細胞分泌的蛋白酶，但是，關于該蛋白質的生物體內的生理學功能，還有很多不清楚的地方。根據本發明人的研究來判斷，組織蛋白酶E，從癌細胞表
面將腫瘤壞死因子(TNF)相關凋亡誘導配體(TRAIL)作為可溶性分子來切斷游離，這樣，將各種癌細胞特異性地誘導向凋亡，誘導癌的生長抑制和轉移抑制，所述的現象在正常細胞中完全不產生，具有其他的組織蛋白酶完全沒有的新型抗癌作用。
凋亡在免疫應答中，對于轉化細胞和病毒感染細胞的生物體外排除來說，發揮重要的作用，是腫瘤消退的主要決定因子。關于腫瘤細胞的凋亡機理還不能完全闡明，但是，腫瘤細胞的增殖抑制和凋亡誘導，在預測癌癥患者的良好的預后方面是極其重要的。根據此前積累的證據提示，腫瘤細胞的凋亡通過例如TNF-a、 FasL (也被稱作CD95L或ApolL )、 TRAIL (或者被稱作Apo2L ) 等TNF家族分子來控制(參考文獻l)。這些細胞因子全部是II型膜貫通蛋白質，通過與細胞表面上的固有的受體結合，可以對靶細胞誘導凋亡信號傳達。這些家族成員為了誘導凋亡，而形成同質三聚體，它與形成于靶細胞表面的固有的受體的三聚體相結合，從而誘導凋亡。但是，在這些家族成員中，只有 TRAIL不對正常細胞產生影響，只將各種癌細胞誘導至凋亡，所以，人們對該TRAIL作為抗癌劑的有用性一直抱有強烈的關注(參考文獻2， 3)。另夕卜，在最近的研究中顯示出，侵入腫瘤部位的各種效應細胞，例如粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等，承擔著作為針對腫瘤細胞的抗腫瘤免疫應答的必須的作用。這些細胞中，認為巨噬細胞通過幾種機制，例如通過由吞噬細胞殺滅肺瘤細胞、抗原的處理或對T4淋巴細胞的提呈、TNF-a、 IL-1、 IL-6、 IL-8等在非特異性宿主防御中具有重要的作用的各種細胞因子的分泌增加，從而在針對癌的的宿主防御機制中發揮最重要的作用(參考文獻4、 5、 6)。因而，針對腫瘤的抗癌效果，認為是通過經由TRAIL的癌細胞特異性凋亡誘導機制和由侵入腫瘤的巨噬細胞來傷害癌細胞的機制這至少2種機制來誘導的。
從此前的多數研究中可知，與癌相關的多數蛋白酶(例如，溶酶體性組織蛋白酶B、 L和D, MMP-1和MMP-9等基質金屬蛋白酶等)，對肺瘤的增殖生長、侵入或轉移具有促進效果(參考文獻7， 8),當阻礙這些蛋白酶活性時，
就可抑制腫瘤的增殖(參考文獻7)等，癌中的蛋白酶對于生物體來說，作為有害蛋白酶在起作用。因而，對于具有抑制癌的增殖生長或轉移的功能的有益蛋白酶，幾乎一無所知。
如前所述，組織蛋白酶E在抗原提呈細胞和淋巴細胞等免疫系統的細胞中有限地表達(參考文獻9、 10、 11)，在吞噬細胞中，通過由FN-g和LPS 等進行活化刺激使得表達量增大，作為活性型分子被大量地分泌到細胞外(參考文獻12)。組織蛋白酶E與其他的組織蛋白酶不同，具有細胞特異性的定位方式和處理機制等，具有獨特的性質(參考文獻13)。但是，這些發現與該蛋白質的生理學功能的關聯性并未被完全理解。最近，顯示出，組織蛋白酶E 在由II類主要組織相容性復合體分子(MHC class II )所形成的外因性抗原提呈機制中，在外因性抗原的處理中發揮重要的作用(參考文獻10、 14、 15、 16)。此外，組織蛋白酶E敲除(CatE;)小鼠，在無菌條件下飼養不產生任何變化(參考文獻17)，但是，在通常的條件下伺養時，呈現出異位性皮炎樣的皮膚癥狀(參考文獻17)，另外，增大了對細菌感染的感受性(參考文獻18)。此外，在最近，本發明人等發現，缺乏組織蛋白酶E會誘導主要的溶酶體膜糖蛋白(例如，LAMP-1和LAMP-2等)的溶酶體內積累，結果，使巨噬細胞內的溶酶體性pH上升，在細胞的結構和功能上引起障礙(參考文獻18)。基于這些認識，本發明人等確定組織蛋白酶E與免疫應答有很深的關系，對維持生命體的穩定性有很大的貢獻。最近，從各種癌的基因或蛋白質的表達譜的解析結果來看，關于癌變^L制中的組織蛋白酶E的作用在文獻上并未闡明，但是啟示了該酶作為癌中的生物標記的有用性(參考文獻20, 21, 22)。
但是，^^道了這些組織蛋白酶可以用作扁平上皮癌等的腫瘤標記(專利文獻4)。但是，此前完全不知道組織蛋白酶E其自身具有抗癌作用，以及增強抗癌劑的感受性，也沒有任何報道。
專利文獻l: WO01/008698號公報
專利文獻2:日本特表號公報
專利文獻3:日本特開2004-26811號公報
專利文獻4:日本特開號公報

發明內容
發明要解決的問題
因而，本發明人等經過潛心研究組織蛋白酶E的特異性的作用后，發現
組織蛋白酶E自身顯示出抗癌效果，同時通過與抗癌劑并用能增強抗癌劑的
感受性，從而完成本發明。
因而，本發明的目的在于提供一種抗癌組織蛋白酶制劑，作為其主要方式，
該抗癌組織蛋白酶制劑以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分來含有。
另外，本發明的目的在于提供一種抗癌組織蛋白酶制劑，作為其別的方式，除了上述有效成分之外，通過進一步含有抗癌劑，從而能夠增強該抗癌劑的作用效果。
另外，本發明的目的在于提供一種抗癌劑的感受性增強方法，通過使用抗癌組織蛋白酶E制劑，可增強該抗癌劑的感受性，所述抗癌組織蛋白酶E制劑含有組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段以及抗癌劑。
此外，本發明的目的在于提供一種癌癥治療方法，該癌癥治療方法包括使用上述抗癌組織蛋白酶制劑來實施癌癥治療。
另外，本發明的目的在于提供一種TNF同質三聚體，該TNF同質三聚體包括由腫瘤壞死因子(TNF)家族成員來形成。
解決問題的手段
為了實現上述目的，本發明提供一種抗癌組織蛋白酶制劑，該抗癌組織蛋白酶制劑以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分來含有。
另外，本發明提供一種抗癌組織蛋白酶制劑，該抗癌組織蛋白酶制劑通過除了上述有效成分外，進一步含有抗癌劑，來增強該抗癌劑的作用效果。此外，本發明提供一種抗癌劑的感受性增強方法，該方法通過使用含有抗癌劑的抗癌組織蛋白酶制劑，來增強抗癌劑的感受性。
進一步，本發明-提供一種癌癥的治療方法，該癌癥治療方法包括使用上述抗癌組織蛋白酶制劑來實施癌癥的治療。
此外，本發明提供由TNF-a、Fas1( CD95L或ApolL )、TRAIL(或者Apo2L )
等腫瘤壞死因子(TNF)家族成員形成的TNF同質三聚體。
在本說明書中，單純地使用"抗癌組織蛋白酶制劑"這個用語時，通常為了簡化說明，是以包含抗癌組織蛋白酶制劑，和除了該有效成分外，并用了抗癌劑的抗癌組織蛋白酶制劑這兩者的意思來使用，所述抗癌組織蛋白酶制劑以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分來含有。另外，即使是使用任一種用語來說明時，如果在文理上沒有矛盾，則該用語就并不限定于其中一方的說明，應該理解為也同樣適于另一方的說明。此外，在并用了抗癌劑的抗癌組織蛋白酶制劑的情況中，應該理解為以如下意思，即，包括在同一制劑中配合該抗癌劑的抗癌組織蛋白酶制劑；以及，不在同一制劑中配合該抗癌劑，而是與以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分來含有的抗癌組織蛋白酶制劑分開來并用的情況。

圖1是表示各種組織蛋白酶對人前列腺癌ALVA-41細胞的生存的效果的圖。
圖2是表示胂瘤細胞的組織蛋白酶E誘導凋亡的特征的圖。
圖3是對于作為ALVA-41細胞中的組織蛋白酶E誘導凋亡的々某介的
TRAIL的鑒定的說明圖。
圖4是對于各種前列腺癌細胞抹的組織蛋白酶E誘導凋亡的感受性的說明圖。
圖5是對于由注射組織蛋白酶E的棵鼠的ALVA-41細胞所形成的腫瘤生長的效果的說明圖。
圖6-1是關于內在組織蛋白酶E與腫瘤中的小鼠B16黑色素瘤細胞的成長減緩以及轉移之間的直接相關性的說明圖。
圖6-2是圖6-1的繼續。
圖7是小鼠組織蛋白酶E轉基因的質粒結構的示意圖。圖8是表示過量表達小鼠組織蛋白酶E的HEK293細胞的細胞提取液的免疫印跡分析數據的圖。
圖9是表示過量表達組織蛋白酶E的轉基因小鼠(CatE+AH、鼠)與作為
10對照的野生型(Wt)小鼠的各種臟器中的組織蛋白酶EmRNA的表達量的圖。圖10是表示調查組織蛋白酶E和依托泊戒對人白血病細胞的生存的影響的結果的說明圖。
圖11是表示調查組織蛋白酶E和依托泊甙同時給藥的情況，與依托泊甙
圖12是表示通過組織蛋白酶E和依托泊戒的并用給藥，與依托泊戒單獨給藥，而對人白血病細胞U937細胞的生存的效果的說明圖。
具體實施例方式
在以下的說明書中，對特定的癌或癌細胞等特定的對象進行說明，但該說明并不是想將本發明限定于涉及的特定對象，應該理解為為了具體說明本發明的內容而例示的記載。即，在下述說明中，例如關于前列腺癌或前列腺癌細胞進行了記載，但是應該理解對于前列腺癌或前列腺癌細胞以外也同樣地適用。
首先，針對各種組織蛋白酶對于人前列腺癌ALVA-41細胞的細胞生存和凋亡的效果進行了記載。
將人前列腺癌細胞ALVA-41與組織蛋白酶B、 D、 E、 L分別在中性pH 條件下體外培養20小時，針對各蛋白酶對于癌細胞的細胞毒性進行調查。組織蛋白酶B和D濃度依賴性地增加生存細胞的數量(圖1A)，這與以前的結果一致(參考文獻7),即，這些組織蛋白酶可促進腫瘤細胞的增殖、侵入和轉移。組織蛋白酶L對于這些細胞，在低濃度(10嗎/ml)下會增加生存細胞，而在高濃度(50-100嗎/ml)下會減少生存細胞數。在以前的發現中，報告了組織蛋白酶L的過量表達和分泌會增加人黑色素瘤細胞的腫瘤產生(參考文獻24， 25)，不過，由反義cDNA所引起的內因性組織蛋白酶L的缺失會抑制神經膠質瘤細胞、黑色素瘤細胞、軟骨肉瘤細胞的惡化(參考文獻25， 26)。該情況提示，該蛋白質參與腫瘤生長和轉移。與此相對，組織蛋白酶E用量依存性地減少生存細胞數。在形態學上，用組織蛋白酶B或D處理的細胞顯示出處于生長相的細胞形態，而用組織蛋白酶E處理的細胞顯示出細胞膜的包嚢化、細胞質的縮小、凋亡小體的形成等凋亡的形態學特征(圖1B)。用組織蛋白酶L ( 100昭/ml)處理的細胞，被發現有細胞或細胞核的膨潤或破裂等壞死狀的形態學變化。此外，為了確認由組織蛋白酶E和組織蛋白酶L誘導
的細胞死亡模式的不同，利用Annexin V染色(檢測凋亡的初期過程)和TUNEL 檢測(檢測凋亡的后期過程)，對用所述的蛋白酶處理的細胞進行分析。結果，用組織蛋白酶E ( 50嗎/ml)處理的細胞對于由Annexin V和TUNEL試劑進行的染色為陽性，而用組織蛋白酶L ( lOO^g/ml)處理的細胞對于由兩者進行染色為陰性(圖1C)。從這些結果可知，組織蛋白酶E誘導ALVA-41細胞凋亡，而組織蛋白酶L誘導由壞死產生的細胞死亡。由組織蛋白酶E所引起的癌細胞的細胞死亡是凋亡，這是根據通過胱冬肽酶(caspase) 3、 6、 7的抑制劑即 DEVD-fmlk，或胱冬肽酶l、 3、 4、 7的抑制劑即z-VAD-fmlk而受到抑制來確認的。
組織蛋白酶E對于癌細胞的細胞毒性，通過將天冬氨酸蛋白酶抑制劑即胃蛋白酶抑制劑A添加于ALVA-41細胞的培養基中來抑制(圖1C )。此外，用丙氨酸取代活性部位的2個天冬氨酸殘基的惰性組織蛋白酶E變異體
(D98A/D283A),對人胚胎腎(HEK ) 293T細胞的生存沒有顯示出效果，而對應的野生型重組蛋白質，與天然的組織蛋白酶E同樣，對于HEK293T細胞
(圖2B )或ALVA-41細胞以濃度依賴形式誘導凋亡。這些結果表明了由組織蛋白酶E所產生的凋亡誘導能力，完全依賴于其催化活性。接著，為了調查由組織蛋白酶E所引起的凋亡誘導是否直接或間接地作用于癌細胞，將用組織蛋白酶E處理的ALVA-41細胞的培養基上清液，在胃蛋白酶抑制劑A的存在或非存在的條件下，添加于新制備的ALVA-41細胞的培養基。結果，不管是胃蛋白酶抑制劑A是否存在，癌細胞根據添加的組織蛋白酶E處理培養基上清液，以用量依賴形式被誘導凋亡(圖2C)。該結果表明了組織蛋白酶E誘導性凋亡，被由于組織蛋白酶E蛋白酶作用而從腫瘤細胞表面釋放的某種分子所誘導。為了進一步驗證該結論，將組織蛋白酶E處理的細胞培養基上清液用DEAE-Sephacel色譜法進行分離。結果，在用0.3MNaCl溶出的部分中檢測出組織蛋白酶E活性的80°/。以上(參考文獻27， 28),但是大部分的凋亡誘導活性，在幾乎不能檢測出組織蛋白酶E活性的用0.1M NaCl溶出的部分 #皮-險測出。
接著，對作為參與到組織蛋白酶E媒介腫瘤細胞的凋亡的介質的TRAIL 的鑒定進行記載。
如前所述，關于胂瘤細胞的凋亡的機制還不太理解，但是，在最近的研究
中提示，腫瘤細胞的凋亡受TNF家族成員，例如TNF-a、 FasL、 TRAIL等的配體類型的細胞因子分子的控制(參考文獻1)。通過使用針對各配體的特異性抗體的ELISA檢測法，來測定通過組織蛋白酶E處理而從ALVA-41細胞游離的TNF家族成員。在組織蛋白酶E處理的細胞培養基上清液中，幾乎檢測不出TNF-a和FasL，但可明確TRAIL為游離態(圖3C )。已知TRAIL與其他的TNF家族成員一樣，通過其細胞外羧基末端區域三聚化，可以結合于在靶細胞表面上存在的受體，傳遞凋亡信號(參考文獻29-32)。因此，通過使用抗TRAIL抗體的免疫印跡分析，來解析在組織蛋白酶E處理的ALVA-41細胞培養基上清液中所含有的可溶性TRAIL分子的分子型。結果，在組織蛋白酶 E處理的細胞的培養基上清液中，檢測出63kDa和65kDa這兩條強的免疫反應性帶，以及相當于48kDa的較小的帶(圖3B )。在組織蛋白酶E處理前的細胞提取液中，檢測出分子量17、 24、 30和48kDa的免疫反應性帶，在組織蛋白酶E處理后的細胞提取液中，17kDa和24kDa的免疫反應性帶消失。基于TRAIL的氨基酸序列計算的TRAIL的細胞外部分的分子量是21kDa (參考文獻33 ),在組織蛋白酶E處理的細胞的培養基中所檢測出的63kDa和65kDa 的蛋白質以及48kDa的蛋白質，被認為分別是相當于可溶性TRAIL的三聚體和二聚體。另外，與ELISA法所得到的數據一致，確認出在用組織蛋白酶E 處理的ALVA-41細胞的培養基上清液中，不產生TNF-a和FasL的可溶性三聚體。
此外，為了調查該可溶性TRAIL在多大程度上，承擔了組織蛋白酶E處理的ALVA-41細胞培養基上清液所具有的凋亡誘導活性，調查由 DEAE-Sephacel色譜法所得到的同培養基上清液的O.lMNaCl部分的凋亡誘導能力因抗TRAIL抗體而消失多大程度。從該結果看出，該部分的凋亡誘導效果因抗TRAIL抗體而基本消失(圖3C)。因此明確了，以組織蛋白酶E為中介的腫瘤細胞凋亡活性依賴于從該細胞釋放的的TRAIL三聚體。
接著，對各種人前列腺癌細胞林的組織蛋白酶E媒介TRAIL依賴凋亡的感受性進行說明。
針對于組織蛋白酶E所產生的TRAIL依賴性凋亡的感受性，使用各種人
前列腺癌細胞抹進行調查的結果，發現組織蛋白酶E對正常的人前列腺上皮
(PrE)細胞的生存和形態幾乎沒有影響，對于癌細胞，雖然有程度上的差別，但是對全部癌細胞都誘導凋亡(圖4A)。對于組織蛋白酶E誘導性凋亡的感受性，以如下的順序增加PPC-l<DU145<=ALVA-101<ALVA-41<PC-3。其中，組織蛋白酶E對于PC-3細胞的生存的效果，是對于PPC-1細胞的生存的效果的大約2(H咅。
已有提示，TRAIL通過作用的各種明確的受體來促進或阻礙凋亡(參考文獻29)。在人體中，鑒定出至少5種針對TRAIL的受體。其中，TRAIL-R1
(DR4)和TRAIL-R2 ( DR5 )是能傳遞凋亡信號的死亡受體(參考文獻29)。作為剩下的3種受體的TRAIL-R3 (DcRl )、 TRAIL-R4 (DcR2)和可溶性受體即護骨素(OPG)，被鑒定為在過量表達時阻礙TRAIL誘導凋亡的誘騙受體
(參考文獻29)。細胞對于TRAIL誘導凋亡的感受性，存在依賴于死亡受體和誘騙受體的相對表達水平的可能性，所以，對于各種人前列腺癌細胞抹和 PrE細胞的TRAIL與它們的受體的細胞表面表達量，通過細胞表面生物素化
腺癌細胞抹和PrE細胞，不僅TRAIL,膜受體(2種死亡受體DR4和DR5，以及2種誘騙受體DcRl和DcR2 )也顯示出同樣的表達量。因而，可知TRAIL 和膜受體的表達，與相對于組織蛋白酶E所引起的TRAIL依賴性凋亡的癌細胞間的感受性差異并沒有直接關系(圖4B)。另外，不具有死亡區域、顯示出阻礙破骨細胞形成的可溶性誘騙受體OPG (參考文獻34, 35)的量，在PrE 細胞和PPC-1細胞的培養基上清液中，與被檢測的其他細胞抹的OPG的量相比，顯著增加。來自癌細胞的OPG是對于激素耐藥性前列腺癌細胞的重要的生存因子，如果考慮到內因性OPG水平與TRAIL所引起的前列腺癌細胞的凋亡誘導能力之間具有負相關的關系，則在PrE細胞和PPC-1細胞中，OPG表達量的增加對這些細胞賦予相對于由組織蛋白酶E所引起的TRAIL依賴性凋亡的抗性。通過組織蛋白酶E處理所釋放的可溶性TRAIL三聚體的量也因癌細胞抹而不同(圖4C)，以PrE<PC-3<PPC-l<ALVA-101<=DU145<ALVA-41 細胞的順序而增大。由于并未發現各種前列腺癌細胞林中的TRAIL的表達量上有顯著的差異，所以，可溶性TRAIL的產生量的不同，可以認為是由于組
織蛋白酶E在癌細胞表面的TRAIL切斷效率的不同所引起的。因而，OPG的表達量增大或組織蛋白酶E所引起的細胞表面的TRAIL切斷效率的降低，或者是由于這兩方面，都能夠部分地說明前列腺癌細胞抹對組織蛋白酶E誘導性凋亡的感受性的降低。但是，PC-3細胞對組織蛋白酶E誘導性凋亡有更高的感受性，不能用這兩種機制中的任一種來說明，這提示對于這種處理的感受性還有別的決定因子存在，例如FLIP、 IAP類、Bcl-xL、 Bd-2等抗凋亡蛋白質的表達量的不同等機制的存在。
接著，對通過給與組織蛋白酶E來抑制具有人前列腺癌細胞的棵鼠的腫瘤生長和轉移的情況進行說明。
用癌細胞的培養系觀察到的組織蛋白酶E的抗癌活性，是否也可以通過使用將人前列腺癌細胞進行皮下移植的棵鼠的體內研究來得到驗證，對此情況進行調查。在棵鼠的皮下移植ALVA-41細胞，在腫瘤的容積約為100mm3時，向形成的腫瘤的中心部以每天1次的頻率注射16天精制的組織蛋白酶E (200jxg/kg)。作為對照，注射生理鹽水來代替組織蛋白酶E。給與生理鹽水的腫瘤，在最初比較緩慢地生長后，便以指數函數級別增大(圖5A)。另一方面，用組織蛋白酶E處理的腫瘤生長，與對照組相比被顯著地抑制。組織蛋白酶E的腫瘤消退效果依賴于投入量，每天的用量為200嗎/kg時是顯著的，為50[ig/kg時期效果減少，為3(Hig/kg或其以下時，幾乎看不出腫瘤抑制效果。腫瘤容積達到大致400mm3時，將組織蛋白酶E以400pg/kg的濃度一天一次地給藥。給藥10天后，摘除腫瘤并測定其重量，結果，組織蛋白酶E給藥組與對照組相比，腫瘤重量顯著降低(圖5B)。對各組的腫瘤進行TUNEL染色，比較產生凋亡的癌細胞的數量，結果，在組織蛋白酶E給藥組中觀察到大量的凋亡細胞，而在對照組中幾乎檢測不出凋亡細胞(圖5C)。這表明了從外部給藥的組織蛋白酶E在體內的個體水平上，也能誘導癌細胞凋亡。由組織蛋白酶E引起的癌細胞的TRAIL依賴性凋亡，可以通過增加給藥次數或增加給藥量來得到增強，所以，可以期待通過改良組織蛋白酶E給藥方法而在消退腫瘤方面產生大的效果。另外，并未發現由于組織蛋白酶E給藥而引起的對正常組織或細胞的任何毒性效果。
以下，對于內因性組織蛋白酶E表達水平和腫瘤生長抑制效果的關系進
行說明。
已知淋巴細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、樹突狀細胞等腫瘤入侵效應細
胞，對于腫瘤發展或轉移的TRAIL依賴性抑制起到重要的作用(參考文獻36, 39)。組織蛋白酶E在淋巴細胞、巨p藍細胞、樹突狀細胞、小膠質細胞等免疫系統細胞中優先表達(參考文獻9、 10、 40)，所以認為這些細胞中的組織蛋白酶E為針對腫瘤細胞的生物體防御機制做出貢獻。因而，在本發明中，使用顯示不同的組織蛋白酶E表達水平的3種類型的同系小鼠(CatE— 、鼠、過量表達組織蛋白酶E的轉基因小鼠(CatETg)和它們的野生型同窩出生小鼠 (Wt)，評價組織蛋白酶E表達量對腫瘤生長、轉移和個體死亡的影響。對各基因型的小鼠將同系由來的小鼠黑色素瘤B16細胞進行皮下注射，在第21天之前觀察得到的腫瘤的大小。各動物組的腫瘤的生長在第8天之前比較緩和，然后漸漸增加。在接種后10天至15天之間，Cat一小鼠的胂瘤生長，與CatE化小鼠和Wt小鼠的腫瘤生長相比，顯著地高，但是在接種后經過19天時，Cat一小鼠和Wt小鼠之間看不出顯著性的差異(圖6A)。但是，CatETg小鼠的腫瘤生長在整個實驗期間，與其他兩個同系小鼠組相比，被顯著強烈地抑制。在 21天中的接種的最終日，CatETg小鼠的腫瘤重量，與CatE化小鼠和Wt小鼠相比，分別是它們的三分之一和五分之一。另外，如果在56天內比較接種B16 黑色素瘤細胞的小鼠的死亡率，則Cat- 、鼠的死亡率最高，接著是Wt小鼠， CatETg小鼠的死亡率最低(Cat一小鼠的生存率為20%，而野生型的生存率為 60%, CatETg小鼠的生存率為80%)(圖6B )。這些結果表明了在腫瘤增殖和組織蛋白酶E表達量之間，存在負相關的關系。
為了調查CatETg小鼠的死亡率降低是否是由于腫瘤細胞的凋亡的增強和消除所引起的，比較各基因型的小鼠的腫瘤的凋亡細胞的表達程度。在接種后的第23天，將從各動物組中釆集的腫瘤進行TUNEL檢觀'J，結果發現在CatETg 小鼠中，凋亡細胞顯著增加。與此相對，在Cat一小鼠和Wt小鼠中，同期的凋亡細胞很少(圖6C )。此處值得注意的是，使用的黑色素瘤B16細胞對于TRAIL 依賴性凋亡具有抗性(參考文獻39， 42)。因而，認為在CatETg小鼠中觀察到的癌細胞的凋亡，是由與通過TRAIL的機制所不同的機制來誘導的。從形態學的觀察來看，在接種黑色素瘤B16細胞的全部的小鼠組的腫瘤部位上，侵
入了大量的淋巴細胞和巨噬細胞等效應細胞。但是，從使用針對于F4/80抗原和II類MHC分子的抗體的免疫染色的結果可知，巨噬細胞的數量和活化程度，在CatETg小鼠的腫瘤中最高，其次是Wt小鼠，在Cat^小鼠的腫瘤中極低(圖 6D)。這些數據，與以前結果相一致，即，在從癌癥患者的胸膜滲出液中的巨噬細胞數量和惡性腫瘤之間存在負相關的關系(參考文獻43， 44)。已知巨噬細胞或淋巴細胞，除了 TRAIL依賴性凋亡誘導效果之外，通過活性氧種或活性氮中間體、以及IFN-a、 IFN-y、 IL-1、 IL-12等效應分子的產生，來發揮細胞損害性(參考文獻45)。此外，也已知活性巨噬細胞通過抗體依賴性和非依賴性機制，來有效地損害胂瘤細胞(參考文獻46, 47)。因而認為，與CatE化小鼠的TRAIL抗性B16細胞的凋亡同時產生的肺瘤生長抑制和這些動物的死亡率降低，是通過腫瘤侵入效應細胞，其中的活化巨噬細胞所產生的細胞毒性來體現的。
此外，死亡細胞數與含有它們的腫瘤部位周圍的壞死區域，以CatE化小鼠〈Wt小鼠〈Cat;小鼠的順序顯著增大(圖6E)。這顯示出與壞死區域的血管分布成反比，由循環系統所產生的死亡細胞的消除和炎癥細胞向腫瘤部位的侵: 入，在CatETg小鼠中最高，其次是Wt小鼠，在Cat一小鼠中最低。此外，腫瘤中心部位和在其附近觀察到的血管內皮細胞的結構，與CatETg小鼠和Wt小鼠相比，在Cat一小鼠中被顯著損傷(圖6E的下行的圖)。這種Cat一小鼠的血管體系的不全，會促進紅血球等血管內容物漏出到血管外。另外，如果考慮到腫瘤侵入巨噬細胞在無血管區域內誘導新的血管，或者對形成的血管體系的改造發揮重要的作用，則本發明的數據表明了組織蛋白酶E通過活化腫瘤侵入巨噬細胞，來控制胂瘤部位的血管體系。
此外，明白了內因性組織蛋白酶E表達水平對癌細胞的轉移度有影響。將黑色素瘤B16細胞對各遺傳型小鼠組進行靜脈注射，在22天后測定轉移至肺的癌細胞的集落的數目，結果，Cat一小鼠的所述的集落數，與Wt小鼠和 CatETg小鼠相比，分別大約是其2倍和8倍(圖6F )。這表明組織蛋白酶E欠缺，促進了癌細胞的肺轉移。因而，這些數據表明了內因性組織蛋白酶E抑制癌細胞的轉移。
這里對TRAIL進行簡單說明，TRAIL的細胞外COOH末端部分與其他的
TNF家族一樣，從細胞表面被切斷游離。這樣得到的游離的可溶性TRAIL形成同質三聚體，誘導各種癌細胞凋亡(參考文獻2， 3)。但是，由可溶性TRAIL 所引起的凋亡在正常細胞中幾乎不產生。TRAIL這種令人矚目的性質，顯示出作為人的癌癥治療的新的治療劑的有用性。事實上，重組型可溶性TRAIL 或TRAIL受體的激動劑(包含作用型抗體)，作為新的抗癌劑在美國正在進行一期臨床試驗。因而，選定從各種細胞抹的表面參與可溶性TRAIL的產生的蛋白酶就極其重要。如今，顯示出TNF-a和FasL通過可溶形式的TNF-a轉換酶(TACE)(參考文獻47， 48)或MMP-7 (參考文獻49, 50, 51 )被分別釋放。但是，還沒有選定參與TRAIL切斷的蛋白質分解酶。根據此前的認識，表達全長重組TRAIL的Sf9細胞的TRAIL在細胞表面的表達，通過亮抑蛋白酶肽和E-64等半胱氨酸蛋白酶抑制劑被增強，但不通過金屬蛋白酶被增強，另外來自該細胞提取液的20kDa的可溶性TRAIL的游離，被所述的半胱氨酸蛋白酶抑制劑抑制，所以，表明了細胞半胱氨酸蛋白酶可能參與TRAIL釋放 (參考文獻52)。但是，在體外的實驗條件中所得到這些認識，是否表明在生物體內實際上產生可溶性TRAIL這種生理學的蛋白質分解現象，這并不明確。在本發明中，本發明人等初次發現了組織蛋白酶E在人前列腺細胞的表面切斷TRAIL后，生成可溶性三聚體分子，對正常的PrE細胞完全沒有影響，是只誘導癌細胞凋亡的責任酶。組織蛋白酶E從全部的人前列腺癌細胞游離 TRAIL,但是發現凋亡誘導效率在癌細胞抹之間存在差異。PPC-1和DU145 等幾種細胞抹與正常的PrE細胞一樣，對組織蛋白酶E誘導性凋亡比較有抗性，而PC-3和ALVA-41等其他細胞抹顯示出高的感受性。細胞表面的TRAIL、 DR4、 DR5、 DcRl或DcR2的表達水平在這些細胞抹之間并沒有實質性的差異，所以表明，這些分子的表達量的不同，與組織蛋白酶E誘導性凋亡的癌細胞間的感受性差異沒有關系。反而可以說成一個原因是，可溶性誘騙受體 OPG產量的增加，會對PrE細胞或PPC-1細胞賦予針對于組織蛋白酶E誘導性凋亡的抗性。此外，ALVA-41細胞對組織蛋白酶E的高感受性，可以通過從這些細胞表面釋放的可溶性TRAIL的量比較多的情況來說明。但是，PC-3 細胞對于組織蛋白酶E的高感受性，不能只用OPG或可溶性TRAIL的量來說明，認為存在抗凋亡蛋白質例如FLIP、 IAP類、Bcl-xL、 Bcl-2等的表達在PC-3
細胞中比其他細胞林少等其他的原因。
另外，在體外觀察到的由組織蛋白酶E引起的抑制腫瘤細胞的生長以及誘導凋亡的實驗結果，與使用移植了人癌細胞的小鼠的個體水平的研究結果非常一致。當對移植了人前列腺癌細胞的棵鼠每天給與組織蛋白酶E時，對正常組織或細胞完全沒有組織學上的影響，可抑制腫瘤細胞的生長并誘導凋亡。這些結果與顯著地延長了接種腫瘤細胞的小鼠生命的認識相一致。大部分的腫瘤細胞的凋亡是在組織蛋白酶E給藥的最后一天觀察，因此，認為將組織蛋
白酶E更頻繁地給藥，或增多組織蛋白酶E的給藥量，能夠在更短時間內有效地誘導肺瘤的消退。另外，如果考慮到活化T細胞(參考文獻39， 53)、 B 細胞(參考文獻54)、自然殺傷細胞(參考文獻55)、樹突狀細胞(參考文獻 39)、單核細胞(參考文獻37)等腫瘤效應細胞產生TRAIL,則可以推測從活化吞喧細胞分泌的組織蛋白酶E，不僅從腫瘤細胞，還從這些免疫系統細胞產生可溶性TRAIL,從而可以誘導腫瘤細胞的凋亡或腫瘤的消退。
另外，斷定組織蛋白酶E可以通過獨立于TRAIL的機制來發揮腫瘤殺傷活性。非常多的腫瘤細胞對TRAIL依賴性凋亡具有感受性，但是，有的種類的腫瘤細胞林對TRAIL依賴性凋亡反而具有抗性。小鼠B16黑色素瘤細胞對 TRAIL依賴性凋亡具有抗性(參考文獻38, 41 )。根據在本發明中得到的認識，將B16黑色素瘤細胞進行皮下移植的CatETg小鼠中，腫瘤侵入效應細胞，特別是活化巨噬細胞不論在數量上還是在活化度上，都顯著地高于同系的CatE一小鼠和Wt小鼠。如果考慮到侵入腫瘤部位的活化巨噬細胞與癌細胞直接接觸，或通過細胞因子等液體因子間接地相互作用從而具有攻擊消除癌細胞的能力 (參考文獻36)的話，則認為，腫瘤侵入性活性巨噬細胞與其他的免疫系統細胞，以區別于TRAIL依賴性凋亡機制的機制，誘導腫瘤細胞凋亡。關于這方面，已報告了胂瘤侵入性活性巨噬細胞的存在的程度與癌癥患者的良好的預后密切相關(參考文獻36)。有文獻顯示，由IFN-Y或LPS引起的巨噬細胞的活化，會帶來組織蛋白酶E的mRNA和蛋白質水平的表達增大以及組織蛋白酶E分泌的增加(參考文獻12)。另外，有文獻顯示，組織蛋白酶E缺乏會帶來巨噬細胞的功能不全(參考文獻19)。這些認識表明了組織蛋白酶E與活性巨噬細胞的功能密切相關。因而，移植了 B16黑色素瘤細胞的CatE;小鼠的
19
皮下腫瘤中，侵入性巨噬細胞的數量和這些細胞的活性狀態(如MHC class II 分子的表達所反映的那樣)，明顯地低于CatE化小鼠和Wt小鼠，這些現象表示巨喧細胞的組織蛋白酶E的表達水平與抑制腫瘤生長和抑制個體死亡之間有很強的關系。因而，認為組織蛋白酶E通過腫瘤侵入活性巨噬細胞所具有的細胞損害活性，可抑制B16黑色素瘤細胞的增殖生長。
這里值得注意的是，腫瘤中的腫瘤侵入性巨噬細胞具有2個相對的竟爭作用，即，具有腫瘤消退和腫瘤促進的結果。例如，低濃度的腫瘤性侵入巨噬細胞具有細胞溶解效果，而高濃度的腫瘤性侵入巨噬細胞具有腫瘤生長促進效果 (參考文獻56， 57)。通過巨噬細胞的多種功能(例如，增強的吞噬作用，T 淋巴細胞或中性白血球的誘導和活化，自然免疫和獲得免疫的活化等)產生有用的抗癌效果(參考文獻58)，而另一方面，巨噬細胞通過幾種機制(例如，腫瘤細胞的移動或侵入的促進，細胞外基質的分解或改變的增強，血管新生的促進等)來促進腫瘤的生長和轉移(參考文獻59)。這些竟爭的功能被認為是由于巨噬細胞所產生的多種細胞因子和活性氧種的質和量的多樣性而產生的。在本發明中，本發明人等首次闡明了， CatE化小鼠與同系的CatE一小鼠和Wt 小鼠相比，可顯著地抑制小鼠B16黑色素瘤細胞的皮下生長和肺轉移，并減少死亡率，在CatETg小鼠的腫瘤中有凋亡性壞死的空白區域。這樣，內因性組織蛋白酶E的表達水平，與抑制B16黑色素瘤細胞的癌生長和抑制其轉移，以及腫瘤侵入性巨噬細胞的增加和活化之間有正相關的關系，這表明了組織蛋白酶E可通過巨噬細胞的細胞毒性、凋亡誘導能力和腫瘤微血管系統的變性來消除腫瘤細胞。因而，認為組織蛋白酶E通過至少2種不同的機制，即， TRAIL依賴性凋亡機制和胂瘤侵入性巨噬細胞誘導性細胞毒性機制來破壞癌細胞。組織蛋白酶B、 L、 D和MMP類等多種蛋白酶的蛋白質分解活性為促進腫瘤生長創造出良好的微環境，但是，關于誘導抑制腫瘤生長和抑制轉移的蛋白酶基本上一無所知。從這個角度來看，組織蛋白酶E是具有抗癌作用的有用的蛋白酶的1個例子。
幾乎所有的抗癌劑都不能克服的共同課題是它們的強烈副作用。因而，抗癌劑探索的有效策略是，以對正常細胞完全不產生細胞毒性，僅誘導靶腫瘤細胞凋亡為目標。以往的認識啟示，給與可增加組織蛋白酶E或內因性組織蛋
白酶E的表達的藥劑，對于抗癌療法來說是有希望的治療策略。因而，以組織蛋白酶E為基本的抗癌療法，單獨給與組織蛋白酶E或與其他的療法并用，可以對人癌癥進行現場處理。
因而，本發明中，作為主要的實施方式，提供一種抗癌組織蛋白酶制劑。
該抗癌組織蛋白酶制劑包括以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者包含其活性部位的活性片段作為有效成分來含有的組織蛋白酶制劑；除了上述有效成分外，還可進一步包含抗癌劑作為有效成分的組織蛋白酶制劑。另外，后者的組織蛋白酶制劑如上所述，包括在同一制劑中配合上述成分和抗癌劑的形式的制劑；分開獨立地配合上述成分和抗癌劑來并用給藥的形式的制劑。
本發明涉及的抗癌組織蛋白酶制劑的特征在于，以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者包含其活性部位的活性片段作為有效成分來含有。
本發明的組織蛋白酶E具有序列表的序列號1所表示的堿基序列和氨基酸序列。另外，本發明涉及的組織蛋白酶E的活性部位是包含第98號和第283 號的天冬酰胺酸的區域。在本發明中，由組織蛋白酶E的活性部位構成的活性片段是指由含有第98號和第283號的天冬酰胺酸的區域所形成的活性片段。另外，含有組織蛋白酶E的活性部位的活性片段是指，由以含有第98號和第 283號的天冬酰胺酸的區域作為部分來含有的區域所形成的活性片段。
在本說明書中，即使簡單地記載成"組織蛋白酶E"的情形中，用語"組織蛋白酶E，，除了根據上下文明確地解釋成別的意思的情形或有特別定義的情形之外，應該理解成以包含上述活性片段的意思來使用。
在本發明中，組織蛋白酶E對于尤其是表面上有TRAIL的非常多的種類的腫瘤細胞，具有活化其TRAIL、抑制腫瘤細胞的生長和轉移，以及誘導凋亡的作用。而且，令人驚訝的是，組織蛋白酶E對腫瘤細胞以外的正常細胞完全沒有影響，只攻擊腫瘤細胞。因而，以組織蛋白酶E為有效成分的本發明的組織蛋白酶制劑被期待作為極其有效的抗癌劑。
如上所述，非常多的種類的腫瘤細胞對TRAIL誘導凋亡具有感受性，但是，組織蛋白酶E也能夠通過獨立于經由TRAIL的凋亡機制的機制來發揮腫瘤抑制活性。就是說，即使對于對TRAIL依賴性凋亡具有抗性的腫瘤細胞林，例如B16黑色素瘤細胞等的細胞，本發明的組織蛋白酶E也能發揮腫瘤抑制活性。
本發明涉及的抗癌組織蛋白酶制劑可以與其他的抗癌劑并用，用于所謂的聯合療法。作為所述的聯合療法中使用的抗癌劑，只要是在與組織蛋白酶E 并用時，其效果得以增強或補充的物質或者增強或補充組織蛋白酶E的作用的物質，就都可以使用，抗癌劑的應用范圍并沒有特別限制。另外，將本發明的抗癌組織蛋白酶制劑與其他的抗癌劑并用給藥時，與單獨給予抗癌劑相比，可以期待以更少的用量達到治療效果。因而，期待能夠避免聯合給藥的抗癌劑的毒性所引起的副作用或者將該副作用抑制在最、程度。
在本說明書中，即使是只使用"抗癌組織蛋白酶制劑"這樣的用語時，除了根據上下文應該解釋成別的意思時或者沒有特定的定義時，應該理解成不只
是指單獨使用組織蛋白酶E的抗癌組織蛋白酶制劑，還意味著與其他抗癌劑
聯合給藥的抗癌組織蛋白酶制劑來使用。
另外，在本發明的聯合療法中，除了組織蛋白酶E和抗癌劑同時作為有效成分被包含于同一制劑中的情形之外，獨立地給與抗癌劑和組織蛋白酶E, 來相互補充或增強其作用的情形，也應該被理解成包含在本發明的范圍內。
作為可與本發明的抗癌組織蛋白酶制劑并用的抗癌劑，可以舉出例如烷化劑、抗代謝劑、抗生素、微管抑制劑等細胞毒性抗癌劑或分子靶向治療藥物等。
抗癌劑之中，作為烷化劑，可以舉出例如環磷酰胺、異環磷酰胺、美法侖、二氯曱基二乙胺(mechlorethamine )、苯丁酸氮芥等氮芥類；白消安(Busulfan )、曱磺英丙舒凡等烷基磺酸酯類；瘞替派(Thiotepa)等乙撐亞胺類；六甲密胺等曱基三聚氰胺類等；卡莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、洛莫司汀、鏈脲霉素等亞硝基脲類；達卡巴嗪等三氮烯咪唑類等。
作為抗代謝劑，可以舉出例如曱氨蝶呤等葉酸類似化合物、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、替加氟、UFT、去氧氟尿苷(5'-DFUR)、卡莫氟、卡培他濱、阿糖胞普、氟尿脫氧核苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鈉、依諾他濱等嘧啶類似化合物；巰基噤呤、6-巰基噪呤核苷、硫鳥嘌呤、噴司他丁等嘌呤類似化合物等。
作為抗癌性抗生素，可以舉出例如放線菌素D、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素C、阿柔比星、鏈脲霉素、柔紅霉素、阿霉素、吡柔比星、表柔比星、新制癌菌素、凈司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)、伊達比星等。作為植物生
物堿系的抗癌劑，可以舉出例如長春新堿、長春堿等長春花生物堿類；依托泊
甙、替尼泊甙類的表鬼臼毒素類；紫杉醇、多烯紫杉醇等紫杉醇類；長春瑞賓、長春地辛、伊立替康、索布佐生、埃坡霉素、脫氧埃坡霉素(desoxy印othilone) 等。
作為鉑配合物，可以舉出例如順柏、卡鉑、奈達柏等。另外，作為上述分類中不包含的抗癌劑，可以舉出例如米托蒽醌等大黃素類、甲基爺肼等甲基肼類、維曱酸A等維他命A代謝物質、達卡巴。秦、羥基脲、噴司他丁、 L-天冬酰胺酶等。
所述的抗癌劑中，例如上述烷化劑、抗代謝劑和鉑配合物都是對作為DNA 合成過程的細胞周期的S期起抑制作用的藥劑。與此相對，抗生素或植物生物堿類的紫杉醇、多烯紫衫醇等具有抑制微管形成的作用，是主要抑制細胞分裂過程的M期的藥劑。因而，這些抗癌劑可以單獨使用也可以組合并用來使用。另外，組合這些抗癌劑時，最好并用抗代謝劑和鉑配合物，尤其是并用順鉑 (CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)。
本發明涉及的抗癌組織蛋白酶制劑可以有效應用于各種癌癥的治療，作為涉及的癌癥種類，并不限定于特定的種類，可以例示以下種類食道癌、頸頸部癌、曱狀腺癌、胃癌、肝癌、肺癌(包含小細胞癌)、乳癌、胰臟癌、膽囊癌、腎癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌(包含扁平上皮癌)等癌癥；淋巴性白血病、淋巴芽球性白血病、細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等淋巴系列的造血性腫瘤；骨髓性白血病、骨髓異形性癥候群、前骨髓性白血病等骨髓性系列的造血性腫瘤；星細胞瘤、神經芽細胞瘤、神經膠質瘤、神經鞘瘤等中樞和末梢神經系統的腫瘤；纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤等間葉系的腫瘤；黑色瘤、色素性干皮癥、角質棘細胞瘤、精上皮瘤、甲狀腺濾胞癌、畸胎瘤(tertoma)等其他的腫瘤等。
本發明的抗癌組織蛋白酶制劑可以含有藥學上允許的載體或添加劑，例如稀釋劑、賦形劑、穩定劑、緩沖劑、著色劑等，可以舉出例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化納、氯化鉀、氯化鈣、失水山梨醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
本發明的抗癌組織蛋白酶制劑可以口服給藥，或者通過靜脈注射、肌肉注射、腹腔、經皮、直腸或局部等非口服方式給藥。口服給藥時，可以以例如片
劑、膠嚢、水溶液或懸濁液等方式給藥。作為在用于口服的固體制劑中通常使用的載體，可以舉出例如乳糖、玉米淀粉、硬脂酸鎂等。另外，用于口服給藥的液體制劑的情形中，通常可以使用乳化劑或懸濁化劑等。
在本發明中，與抗癌劑組合使用的組織蛋白酶E的給藥量，只要是增強該抗癌劑的抗癌活性(包含細胞死亡誘導活性)的量即可，沒有特別限制，可以根據該抗癌劑的規定的給藥量在較寬的范圍內變動來給藥。實際上，通過組
織蛋白酶E的并用給藥，來增強抗癌劑的感受性，從而可以以比該抗癌劑的規定的給藥量少的用量來給藥。通常，每一次給與組織蛋白酶E的給藥量(單位給藥量)，都根據并用的抗癌劑的種類、給藥方式、癌癥的種類、患者的體重或狀態、病情等進行變化，例如，以0.01mg 10g/kg體重為宜。另一方面，抗癌劑的給藥量也因其種類、癌癥的種類、患者的體重或狀態、病情等而不同，例如，可以在lng/kg體重 200mg/kg體重(靜脈給藥)或者0.005mg/kg體重 600mg/m2體表面積(靜脈給藥)、或2.5mg/kg體重 2g/kg體重(口服給藥) 的范圍內使用。
以下，通過實施例對本發明進行具體說明。但本發明完全不限定于這些實施例。
實施例1
(細胞生存的測定)
細胞生存使用Cell Counting Kit-8 (細胞計數試劑盒-8 )按照制造者手冊來測定。簡單描述一下其方法為，將細胞(1 x io4 )接種于lOO^il的96孔板中，培養24小時。接著，將細胞與從大鼠胃(參考文獻27, 60-62)精制得到的規定濃度的各種組織蛋白酶一起在無血清Opti-MEM培養基中培養。然后，向各孔添加試劑盒試劑1(^1，對細胞進一步培養l小時。用酶標儀在450nm下測定各孔的吸光度。 (凋亡的測定)
對于凋亡的形態變化，用相差顯微鏡來檢查細胞。對前期和后期凋亡的細胞分別通過Annexin V染色和TUNEL技術來檢測。為了 Annexin V染色，使 ALVA-41細胞與組織蛋白酶E或組織蛋白酶L接觸4小時，離心分離來分開，用PBS洗滌2次，與異硫氰酸熒光黃標記的Annexin V在室溫下在暗處培養
24
IO分鐘。用熒光顯微鏡檢測出AnnexinV染色為陽性的細胞。就TUNEL技術來說，對培養腫瘤細胞采用ApopTag過氧化物酶凋亡4僉測試劑盒(ApopTag Peroxidase Apoptosis Detection Kit)來進行，對異種移植片，采用Tumor TACS 原位細胞凋亡檢測試劑盒(Tumor TACS In Situ Apoptosis Detection Kit)來進行。
(重組組織蛋白酶蛋白質的制備)
讓其活性部位的2個天冬酰胺酸殘基被丙氨酸取代的重組野生型和其變異蛋白質(D98A7D283A),在HEK293T細胞中表達，用前述記載的方法精制 (參考文獻63 )。
(DEAE-Sephacel色語法和免疫耗竭)
采用無血清培養基Opti-MEM，將ALVA-41細胞(9x 109個)與組織蛋白酶E (100嗎/ml) —起在37。C培養20小時，以20000xg、 4。C的條件離心分離30分鐘。濃縮培養基上清液，離心分離，采用含有0.05%Brij-35的10mM 磷酸鈉緩沖液(pH7.0)來透析得到的上清液，然后，添加于用同一溶液平衡的DEAE-Sephacel柱。然后，對柱用0.01M和0.3M NaCl梯度洗提。柱部分的細胞毒性活性和組織蛋白酶E活性，采用新制備的ALVA-41細胞和下述組織蛋白酶E特異性基質MOCAc-Gly-Ser-Pro-Ala-Phe-Leu-Ala-Lys(D叩) -D-Arg-NH2 (參考文獻64 )來調查。為了來自0.1M NaCl部分的TRAIL的免疫耗竭，對于該部分，首先用TRAIL的小鼠單克隆抗體或對照小鼠免疫球蛋白G (分別是l嗎/ml的濃度)，接著與蛋白質G-Sepharose 4 Fast Flow共同在 4。C的條件下培養l個晚上。然后，用離心分離除去樹脂，對于得到的上清液，評價對ALVA-41細胞的生存的效果。 (SDS-PAGE和免疫印跡分析)
按照前述文獻(參考文獻63)進行SDS-PAGE和免疫印跡分析。通過 SDS-PAGE區分的蛋白質在硝基纖維素膜上的移動和用5%脫脂干奶粉封閉后，將該膜與抗TRAIL抗體(1/300倍稀釋)、抗TNF-cc抗體(1/200倍稀釋)、抗FasL抗體(1/500倍稀釋)、抗DR4抗體(1/500倍稀釋)、抗DR5抗體(1/100 倍稀釋)、抗DcRl抗體(1/500倍稀釋)、抗DcR2抗體(1/500倍稀釋)、抗護骨素抗體(1/150倍稀釋)或抗(3-肌動蛋白抗體(1/500倍稀釋)等第一抗
體共同在4。C培養一夜。將這樣處理的膜洗滌數次，接著，用化學發光試劑沖企
測免疫復合物。密度測定用LAS1000來進行。 (細胞表面的生物素化)
細胞表面的生物素化按如下方法進行。以~80%合流的狀態將前列腺細胞放入亞中，用冰冷PBS洗滌2次，用可細胞非浸透性分解試劑磺基-NHS-SS-生物素在4。C培養30分鐘，從而標記生物素。非結合生物素通過將細胞用 100mM甘氨酸PBS溶液洗滌6次來淬滅后，對細胞用1% Triton X-100和含有苯曱基磺酰氟、亮抑蛋白酶肽(口 4 、y )、胃酶抑素(Pepstatin)以及抑肽酶各lmg/ml的100mM磷酸緩沖液(pH8.0 )200)ul來溶菌。細胞裂解物用20000
x g的條件在4。C離心分離20分鐘，將得到的上清液與鏈霉親和素-瓊脂糖4敖珠50^1 —起在4。C緩慢攪拌2小時。這樣處理過的微珠，用含有10mM Tris-HCl
(pH 7.5 )、 0.1%SDS、 0.1%Triton X-IOO、 2mM EDTA和lmM NaN3的溶液洗滌2次，用對該溶液進一步加入1M NaCl和0.1%月桂酰基肌氨酸鈉的溶液洗滌2次，進一步用5mM Tris-HCl (pH 7.0)洗滌2次。接著，將微珠在SDS 樣本緩沖液中在100。C培養5分鐘，對溶出的蛋白質進行SDS-PAGE和免疫印跡分析。
(對TRAIL 、 FasL和TNF-a的ELISA )
采用無血清Opti-MEM培養基，與組織蛋白酶E ( 100嗎/ml) —起在37°C 培養20小時，對得到的ALVA-41細胞(每6cm皿為^106個)培養基上清液中的TRAIL、 FasL和TNF-a的量用ELISA試劑盒來進行測定。簡單地說明該方法，將樣本或標準品100^d添加于微量滴定板，該微量滴定板固定了與對應的TNF家族成員相對應的單克隆抗體，在室溫下培養2小時。接著，用洗滌緩沖液洗滌4次板孔。接著，對各孔添加生物素標記的單克隆抗體lOOpl，在室溫下培養1小時，然后完全洗滌小孔，與鏈霉親和素-結合辣根過氧化物酶 IOOW—起，在室溫下培養30分鐘，用洗滌緩沖液洗滌4次。向各孔添加穩定的色原體(chromoge: 100^1),在室溫下在暗處培養30分鐘。添加反應停止溶液后，用顯微閱讀器測定吸光度(450nm)。 (免疫組化)
對福爾馬林固定和石蠟包埋移植片，釆用CHEMICONIHC Select(R)免疫
過氧4b物酶間4妄沖全觀'J系纟克(Immunoperoxidase Secondary Detection System)來調查F4/80和MHC class II分子。用二曱苯和乙醇除去載玻片的石蠟，用3% 過氧化氫處理10分鐘。清洗后，與封閉試劑(正常山羊血清)共培養后清洗。接著，使用抗F4/80抗體(1: 500倍稀釋)或抗MHC class II分子抗體(1: 500倍稀釋)來作為第一抗體，在室溫下對載玻片培養IO分鐘。進一步，將 IHC Select(R) Biotinylated Secondary Antibody Goat anti-Rat IgG作為第二抗體，在室溫下培養10分鐘，用鏈霉親和素-結合HRP在室溫下處理10分鐘，與色原體試劑(3，3，-二氨基聯苯胺)在室溫下反應10分鐘。對這樣處理的片段用蘇木精進行負染色，用光學顯微鏡檢查。 (實驗動物)
全部的實驗動物在特定的無菌設施下按照日本藥理學會的指南來飼養。全部的動物實驗在九州大學研究生院齒學研究院動物實驗委員會的承認的條件下進行。C57BL/6基因背景的野生型小鼠和CatE一小鼠，如前述文獻(參考文獻17)的記載來使用。為了制成過量表達組織蛋白酶E的轉基因小鼠，構建用血凝素(HA )標記的小鼠組織蛋白酶E轉基因。采用TRIsol試劑從小鼠脾臟中提取出總RNA，用逆轉錄酶合成第1鏈cDNA。通過將該cDNA用作模板，利用EXTaq聚合酶來擴增小鼠組織蛋白酶。使用具有下述序列的引物 5，-CGGTCTAGAGAGATCGGAGCAGAGTGAGAG-3 ， 5，-GGACCCGGGTAACAGGYTTAAATGGGTATCA畫3，(下劃線序列分別表示限制性內切酶的Xba I和Sma I部位)。擴增片段亞克隆于具有HA標記的pBluscript SK上。接著，為了除去小鼠組織蛋白酶E ( mCE)和HA的間隙，而誘導部位指向性突變。用Xbal酶切，用Klenow片段補平后在兩端添加 pXhoI連接鏈。用Xhol酶切得到的質粒，將其結合于牛堿性磷酸酶處理的 pCAGGS。采用該得到的質粒制成轉基因小鼠。靶載體的連接鏈DNA片段微注射于C57BL/6J小鼠的受精卵中。使創始小鼠與野生型小鼠交配來制作出半接合體Tg小鼠。妊娠小鼠通過使用尾DNA的PCR和Southem blot分析法來進行篩選。
(具有人和小鼠的異種移植片的小鼠的肺瘤生長和轉移) 為了研究一次腫瘤生長，將ALVA-41細胞(5 x 106個)的PBS溶液lml
對雄棵鼠的右肋腹部進行皮下注射。另外，將小鼠黑色素瘤B16細胞(1 x 106 個)對同系野生型(WT)小鼠、CatE一小鼠和CatE化小鼠的右肋腹部同樣地進行皮下注射。腫瘤的大小用卡尺測定，腫瘤容量用式ab2/2 (式中，a和b 分別表示最大和最小中央截面尺寸)來算出。ALVA-41細胞異質移植片的大小達到大約100mm3 (注射后大約12天左右)時，將動物以5只為單位分成2 組，用16天對胂瘤中心部給與精制組織蛋白酶E (每一天為200昭/體重kg) 或者生理鹽水。為了測定腫瘤重量和免疫組織化學的研究，當腫瘤大小達到大約400mm3時，用10天對腫瘤中心部給與組織蛋白酶E (每一天為500pg/ kg) 或者溶劑(聚乙二醇)。為了研究轉移，從Wt小鼠、CatE一小鼠和CatETg小鼠的尾靜脈注射黑色素瘤B16細胞(PBS溶液50|il中2 x 105個)。22天后對小鼠實施麻醉，用致死量的二乙醚處死后，摘出肺。數出該肺表面的轉移黑色集落數。
(mRNA提取和RT-PCR)
總RNA釆用Rneasy Mini Kit按照制造者手冊來分離。RNA的收率和質量通過A260/A280的吸收和凝膠電泳來評價。cDNA合成采用Ready-to-Go RT-PCR微珠來進行。將各樣本500ng在含有第1鏈引物、正向和反向引物 (20pmo1)和無Rnase/Dnase的水的50^1的反應混合物中進行培養。RT在由 45°C10分鐘以及95。C5分鐘所構成的加熱程序下進行。另外，PCR反應采用下述引物進行。G3PDH(正向5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA;反向 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC ), 組織蛋白酶 E (正向 5'-GTGCCCCTCAGAAGACATCA;反向5'-GTATCCCAGACCCAGAATCC )。 PCR產物分別是471bp和498bp。對于G3PDH的PCR循環條件為，以95°C 30秒、60。C30秒、72°C1分鐘為一個循環設35個循環，并且最后72°C5分鐘。全部的樣本在含有溴化乙錠(0.5pg/ml)的2.5%的瓊脂糖凝膠上分解，用紫外線照射實現可視化。為了確保檢測在線性范圍內，PCR用不同的循環實施，至少重復2回。 (統計分析)
數據作為平均值± SD來表示，通過Student's t test來進行組之間的比較。生存數據用Mann-WhitneyU-test來分析，p<0.05的值判斷為統計學的顯著性。以下，對附圖進4亍詳細i兌明。
首先，圖1表示各種組織蛋白酶對人前列腺癌ALVA-41細胞的生存的效果。圖1A表示用生理鹽水和組織蛋白酶B、 D、 E、 L (各自濃度10|ig/ml (左側)、50路/ml (中央)、100|ig/ml (右側))在37。C、 pH7.4下處理20小時后，用比色法測定生存細胞的結果。圖中的數據是相對于生理鹽水處理細胞值的相對值，用4次獨立的實驗的平均值士SD來表示。*p<0.001是相對于生理鹽水處理細胞的對應值。圖IB表示用各種組織蛋白酶(濃度100pg/ml)和生理鹽水處理的細胞的顯微鏡觀察的結果。圖中的指示尺度為5(Hrni。圖1C表示將細胞用生理鹽水和組織蛋白酶E (50昭/ml)和組織蛋白酶L (100pg/ml)在 37°C、 pH7.4下處理20小時后，通過TUNEL技術(上行)和熒光異硫氰酸酯標記的AnnexinA染色(下行)來檢測的凋亡圖像。圖中的線段尺度為50|am。
圖2表示腫瘤細胞組織蛋白酶E誘導性凋亡的特征。圖2A表示ALVA-41 細胞的生存率的測定結果。在該實驗中，將ALVA-41細胞在胃蛋白酶抑制劑 A(100pM)的存在下或非存在下，與規定濃度的組織蛋白酶E在37。C、 pH7.4 下培養20小時后，測定細胞生存率，用相對于非處理細胞組的值的百分率來表示。數據用4次獨立的實驗的平均值士SD來表示。*p<0.001是相對于胃蛋白酶抑制劑A非處理細胞的對應值。圖2B表示HEK293細胞的生存率的測定結果。在該實驗中，將HEK293細胞與規定濃度的天然組織蛋白酶E、野生型重組體和其活性部位變異體(D98A/D283A) —起在37°C、 pH7.4下培養20 小時后，測定細胞生存率，用相對于非處理細胞組的值的百分率來表示。^t據用4次獨立的實驗的平均值± SD來表示。*p<0.001是相對于變異體處理細胞的對應值。圖2C表示只用組織蛋白酶E處理的細胞的生存率。在該實驗中，將細胞用規定濃度的組織蛋白酶E如圖2A所示處理后，回收培養基上清液，離心分離，除去沉淀，將其一部分UOOpM)移入新制備的ALVA-41細胞的培養基中。接著，將這些細胞在胃蛋白酶抑制劑A (100pM)的非存在下(黑圈記號)或存在下(白圏記號)，在37。C、 pH7.4下培養20小時后，測定細胞生存率，以相對于用生理鹽水處理ALVA-41細胞培養基上清液所處理的細胞的值的百分率來表示。數據用4次獨立的實驗的平均值士SD來表示。在圖2D 所示的實驗中，將組織蛋白酶E處理的ALVA-41細胞培養基上清液用
DEAE-Sephacel色譜法來分離，各分離部分如上所述處理。各柱分離部分的組織蛋白酶E活性(上行的圖)和細胞毒性活性(下行的圖)，采用新制備的 ALVA-41細胞和組織蛋白酶E特異性基質來分別確定。規定的最終蛋白質濃度的各分離部分所處理的細胞生存率，表示為相對于生理鹽水處理細胞的百分率，用4次獨立的實驗的平均值士SD來表示。組織蛋白酶E活性，作為培養基上清液中的總活性的百分率來表示，其數據用3次獨立的實驗的平均值± SD 來表示。
圖3對于作為ALVA-41細胞的組織蛋白酶E誘導性凋亡的誘導因子的 TRAIL的鑒定進行說明。圖3A表示針對培養基上清液中的TNF-a、 FasL和 TRAIL的量的ELISA測定結果。在該實驗中，采用組織蛋白酶E ( 100嗎/ml) 或生理鹽水，將ALVA-41細胞在37°C、 pH7.4下培養20小時后，用ELISA 測定培養基上清液中的TNF-a、 FasL和TRAIL的量。數據表示相對于生理鹽水處理細胞的平均值的對應值的相對值，用4次獨立的實驗的平均值士SD來表示。圖3B表示免疫印跡分析結果。在該實驗中，將細胞如圖A所示用組織蛋白酶E(道2， 4)或生理鹽水(道1， 3)處理后，采用分別針對于TNF-a、 FasL和TRAIL的特異性抗體，對細胞提取物和培養基上清液進行免疫印跡分析。圖3C是表示由TRAIL的免疫耗竭所引起的對于凋亡誘導活性的抑制效果的結果。在該實驗中，采用抗TRAIL抗體，將通過規定的最終濃度的組織蛋白酶E處理細胞的培養基上清液的DEAE-Sephacel色語法所得到的0.1M NaCl部分所產生的TRAIL,用免疫沉降來除去。作為對照，采用針對于對照小鼠IgG的抗體，進行同樣的處理。采用免疫沉降后的培養基上清液調查 ALVA-41細胞的凋亡。數據作為與生理鹽水處理細胞的生存率的對應值的百分率來表示，用3次獨立的實驗的平均值± SD來表示。*p<0.001是與對照IgG 處理細胞相對的對應值。
圖4對各種人前列腺癌細胞林相對于組織蛋白酶E誘導性凋亡的感受性進行說明。
圖4A表示用組織蛋白酶E或生理鹽水處理各種人前列腺癌細胞抹和正常人前列腺上皮(PrE)細胞時，用比色檢測法測定細胞生存率的結果。在該檢測中，首先，將被檢驗細胞培養至 80%合流的狀態，接著，與組織蛋白酶E
(100pg/ml)或生理鹽水在37°C、 pH7.4下一起培養20小時后，用比色^r測法測定細胞生存率。細胞生存率作為與生理鹽水處理細胞相對的對應值的百分率來表示。數據用4次獨立的實驗的平均值士SD來表示。fpO.001是與生理鹽水處理細胞相對的對應值。圖4B表示免疫印跡分析的結果。在該實驗中，首先，將細胞用可細胞透過性分解的試劑磺基-NHS-SS-生物素
(sulfo-NHS-SS-biotin)進行生物素化后，溶解細胞，將細胞裂解物與鏈霉親和素-瓊脂糖微珠在4。C培養2小時。接著，洗滌微珠，采用抗TRAIL抗體或針對于TRAIL膜相關受體的抗體，對相關蛋白質進行免疫印跡分析。另外，采用抗(3-肌動蛋白抗體對細胞裂解物部分直接進行免疫印跡分析。作為其他的方法，可采用抗OPG抗體對各細胞林的調節培養基進行免疫印跡分析。圖4C 是用密度計進行濃度解析時的結果。在該實驗中，與圖3A同樣，采用抗TRAIL 抗體對組織蛋白酶E處理培養基上清液進行免疫印跡分析后，為了定量可溶性三聚化TRAIL而對免疫印跡進行濃度解析。縱軸的單位，定義為，與組織蛋白酶E處理的PrE細胞的每毫米單位的TRAIL濃度相對的相對值。數據用 4次獨立的實驗的平均值± SD來表示。柱1是PrE細胞，柱2是ALVA-41細胞，柱3是ALVA-101細胞，柱4是PPC-1纟田胞，柱5是PC-3細胞，柱6是 DU145細胞。*p<0.001是對組織蛋白酶E處理的PrE細胞的統計性顯著的值。圖5對針對于注射組織蛋白酶E的棵鼠的ALVA-41細胞所形成的腫瘤生長的效果進行說明。
圖5A表示將ALVA-41細胞對雄棵鼠進行皮下注射而生成的腫瘤的容積。皮下注射后腫瘤容積達到 100cn^時，將組織蛋白酶E ( 20(^ig/kg/天)或生理鹽水對腫瘤中心部進行16天的皮下注射。數據是每個組的5只小鼠所得的值的平均值士SD值，*p<0.005、 **p<0.01和氺"p〈0.001是與組織蛋白酶E處理小鼠對應的統計上的顯著的對應值。圖5B表示腫瘤容積達到 400cn^時，將組織蛋白酶E (400^ig/kg/天)或生理鹽水對腫瘤中心部進行10天的注射后，測定胂瘤重量的結果。數據是每個組的3只大鼠所得的值的平均值± SD值。圖5C與圖5B同樣，表示對用組織蛋白酶E或生理鹽水處理的小鼠腫瘤用 TUNEL檢測分析的結果。檢測是在與二氨基聯苯胺反應后，將切片用1%甲基綠計數染色來進行。數據表示用各組的5只小鼠來得到的結果，下行是上行的
圖像的放大圖。圖中的線段尺度是50(im。
圖6-1和圖6-2對內因性組織蛋白酶E表達水平，與腫瘤中的小鼠B16黑色素瘤細胞的生長下降以及轉移的直接相關性進行說明。圖6A表示將同系的小鼠B16黑色素瘤細胞(1 x 106個)對各個CatE一小鼠(n-11 )、 Wt小鼠(n-lO) 和CatETg小鼠(n=10)進行皮下注射，測定所生成的腫瘤容量的結果。腫瘤容量是在注射后規定時間測定，數據是各組值的平均值士SD值。《pO.01和 ** p<0.001是對Wt小鼠對應的統計上的顯著的對應值。圖6B表示小鼠B16 黑色素瘤細胞的皮下注射后的各組的小鼠的死亡率。Wt小鼠與CatE一小鼠或 CatETg小鼠的差是統計學上的顯著性差異。圖6C表示針對從各小鼠組摘除的腫瘤的TUNEL檢測分析結果。檢測是在與二氨基聯苯胺反應后，將切片用1% 甲基綠計數染色來進4亍。數據表示各組5只小鼠的移植第23天的結果。圖中的線段尺度是5(Hxm。圖6D表示對移植第23天的各組小鼠用針對摘除腫瘤的
箭頭表示血管，而且線段尺度是100jim。圖6E表示癌細胞移植后第23天摘除的腫瘤的多聚曱酰胺(paraformamide)固定和蘇木精-伊紅染色的結果。白色箭頭記號和黑色箭頭記號分別表示腫瘤中的血管和壞死區域。圖下行表示圖上行的圖像(圖中的矩形部分)的放大圖。CatE—M、鼠的情況中，圖下行確認出在腫瘤中心部有新生血管結構。圖6F是表示向各組小鼠靜脈注射小鼠B16 黑色素瘤細胞后的肺表面的黑色小結節數的圖表。在該實驗中，將小鼠B16 黑色素瘤細胞(2 x 105個)對各組小鼠進行尾靜脈注射，在22天后處死小鼠，數出肺表面的黑色小結節數。數據是各組值的平均值土SD值。* pO.01和" p<0.001是與對應小鼠對應的統計上顯著性差異的值。
圖7是小鼠組織蛋白酶E轉基因的質粒構造的示意圖。將HA標記的組織蛋白酶E克隆于靶載體pCAGGS。圖中標記的簡略號表示的是，AG啟動子是 amp，氨節西林抗性基因是fl(-)ori, HA是血凝素，hCMV是人巨細胞病毒即刻啟動子，mCE是大鼠組織蛋白酶E基因，MCS是多克隆位點，ori來自大腸桿菌質粒pMBl， Plac為lac啟動子，pUCori來自pUC, SV40ori來自猿猴病毒(simian virus )。
圖8表示過量表達小鼠組織蛋白酶E的HEK293細胞的細胞才是取液的免
疫印跡解析數據。作為第一抗體，使用針對于組織蛋白酶E (CE)和血凝素 (HA)的抗體。道1表示轉染組織蛋白酶E的細胞，道2表示對照細胞。
圖9表示過量表達組織蛋白酶E的轉基因小鼠(CatE+/N、鼠)和作為對照的野生型(Wt)小鼠的各種臟器的組織蛋白酶EmRNA的表達量。M表示100 堿基對Marker, G3PDH表示甘油醛三磷酸脫氫酶。道1至IO依次表示腦、心臟、肺、胃、胰臟、脾臟、小腸、大腸、肝臟、腎臟。
實施例2
圖10表示調查組織蛋白酶E和依托泊苷對人白血病細胞的生存產生的影響的結果。上行的圖表示，對白血病細胞U937細胞和HL-60細胞分別給予組織蛋白酶E和依托泊苷時，給藥濃度的影響。下行的圖表示，與單獨給予組織蛋白酶E時相比，對各細胞同時給與各濃度的組織蛋白酶E和依托泊苷 (lOpg/ml)時的效果的結果。這些結果表示，同時給與組織蛋白酶E和依托泊苦時，任何癌細胞的生存率都被降低。
實施例3
圖11表示在組織蛋白酶E和依托泊苷同時給藥的情形以及依托泊苷前處理的情形進行比較，調查組織蛋白酶E和依托泊苷對人白血病細胞的生存產生的影響的結果。如圖所示，依托泊普(10嗎/ml)單獨給藥時，依托泊苷相對于人白血病細胞U937細胞，只誘導40%左右的凋亡，同時給藥各種濃度的組織蛋白酶E的情形和在依托泊苷前處理后給藥的情形，顯著增強癌細胞的凋亡。
實施例4
圖12表示組織蛋白酶E和依托泊普聯合給藥以及依托泊苷單獨給藥，所產生的對白血病細胞U937細胞的生存的效果。圖上行表示依托泊苷單獨給藥的情形的效果。圖下行表示將依托泊苷(50pg/ml)和各種濃度的組織蛋白酶 E聯合給藥時的效果。從這些結果可以看出，通過并用組織蛋白酶E和依托泊苷，可明顯增強依托泊苷的效果。
工業上的應用性
本發明涉及的抗癌組織蛋白酶制劑，對于抑制癌細胞的生長和預防癌轉移是有用的，同時，可以顯著誘導癌細胞的凋亡。另外，本發明的抗癌組織蛋白
33
酶制劑，對正常細胞沒有不良影響，只殺傷癌細胞，所以沒有或者顯著減輕以往的抗癌劑所具有的副作用。此外，將被發明的抗癌組織蛋白酶制劑與其他的抗癌劑并用，對于以往的抗癌劑不顯示感受性的癌癥等也可以期待治療效果，所以在癌癥治療領域;fe其有用。 (參考文獻1 )
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權利要求
1. 一種抗癌組織蛋白酶制劑，其特征在于，含有組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分。
2. 根據權利要求1所述的抗癌組織蛋白酶制劑，其特征在于，所述活性部位是包含序列表的序列號1記載的氨基酸序列的序列號第98號和第283號的天冬酰胺酸的區域。
3. 根據權利要求1或2所述的抗癌組織蛋白酶制劑，其特征在于，進一步含有抗癌劑作為有效成分。
4. 根據權利要求3所述的抗癌組織蛋白酶制劑，其特征在于，所述抗癌劑是抗癌劑或抗腫瘤劑。
5. 根據權利要求3或4所述的抗癌組織蛋白酶制劑，其特征在于，所述抗癌劑是鉑配合物、拓樸異構酶抑制劑、抗生素、抗有絲分裂生物^喊、二氟核苷。
6. 根據權利要求3 5中任一項所述的抗癌組織蛋白酶制劑，其特征在于，所述抗癌劑適用于食道癌、頸部癌、曱狀腺癌、胃癌、肝癌、肺癌(包含小細胞癌)、乳癌、胰臟癌、膽嚢癌、腎癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌(包含扁平上皮癌)等癌癥；淋巴性白血病、淋巴芽球性白血病、細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等淋巴系列的造血性腫瘤；骨髓性白血病、骨髓異形性癥候群、前骨髓性白血病等骨髓性系列的造血性肺瘤；星細胞瘤、神經芽細胞瘤、神經膠質瘤、神經鞘瘤等中樞和末梢神經系統的腫瘤；纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤等間葉系的腫瘤；黑色瘤、色素性干皮癥、角質棘細胞瘤、精上皮瘤、曱狀腺濾泡癌、畸胎瘤等其他的腫瘤。
7. —種抗癌劑的感受性增強方法，其特征在于，通過將權利要求1~6中任一項所述的含有組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分的抗癌組織蛋白酶制劑與抗癌劑并用，來增強抗癌劑的感受性。
8. 根據權利要求7所述的抗癌劑的感受性增強方法，其特征在于，所述活性部位是包含序列表的序列號1記載的氨基酸序列的序列號第98號和第 283號的天冬酰胺酸的區域。
9. 根據權利要求7或8所述的抗癌劑的感受性增強方法，其特征在于，所述抗癌劑是抗代謝劑、烷化劑、抗癌性抗生素、微管抑制劑等細胞毒性抗癌劑或分子靶向治療藥。
10. 根據權利要求7 9中任一項所述的抗癌劑的感受性增強方法，其特征在于，所述抗癌劑適用于食道癌、頸部癌、曱狀腺癌、胃癌、肝癌、肺癌(包含小細胞癌)、乳癌、胰臟癌、膽嚢癌、腎癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌(包含扁平上皮癌)等癌癥；淋巴性白血病、淋巴芽球性白血病、細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等淋巴系列的造血性肺瘤；骨髓性白血病、骨髓異形性癥候群、前骨髓性白血病等骨髓性系列的造血性腫瘤；星細胞瘤、神經芽細胞瘤、神經膠質瘤、神經鞘瘤等中樞和末梢神經系統的腫瘤；纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤等間葉系的腫瘤；黑色瘤、色素性干皮癥、角質棘細胞瘤、精上皮瘤、曱狀腺濾泡癌、畸胎瘤等其他的腫瘤。
11. 一種TRAIL的表達方法，其特征在于，通過使組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段與癌細胞接觸，在癌細胞表面表達TRAIL。
12. 根據權利要求11所述的TRAIL的表達方法，其特征在于，所述活性部位是包含序列表的序列號1記載的氨基酸序列的序列號第98號和第283號的天冬酰胺酸的區域。
13. —種癌細胞的殺傷方法，其特征在于，通過使組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段與癌細胞接觸來表達 TRAIL,不影響正常細胞而實際上只殺傷癌細胞。
14. 根據權利要求13所述的癌細胞的殺傷方法，其特征在于，所述活性部位是包含序列表的序列號1記載的氨基酸序列的序列號第98號和第283號的天冬酰胺酸的區域。
15. —種癌癥治療方法，其特征在于，采用權利要求1~6中任一項所迷的抗癌組織蛋白酶制劑來治療癌癥。
16. —種癌癥治療方法，其特征在于，采用權利要求7~10中任一項所述的抗癌劑的感受性增強方法來治療癌癥。
17. 根據權利要求15或16所述的癌癥治療方法，其特征在于，所述抗癌劑是抗代謝劑、烷化劑、抗癌性抗生素、微管抑制劑等細胞毒性抗癌劑或分子靶向治療藥。
18. 根據權利要求15 17中任一項所述的癌癥治療方法，其特征在于，所述抗癌劑適用于食道癌、頸部癌、曱狀腺癌、胃癌、肝癌、肺癌(包含小細胞癌)、乳癌、胰臟癌、膽嚢癌、腎癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌(包含扁平上皮癌)等癌癥；淋巴性白血病、淋巴芽球性白血病、細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等淋巴系列的造血性腫瘤；骨髓性白血病、骨髓異形性癥候群、前骨髓性白血病等骨髓性系列的造血性腫瘤；星細胞瘤、神經芽細胞瘤、神經膠質瘤、神經鞘瘤等中樞和末梢神經系統的腫瘤；纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤等間葉系的腫瘤；黑色瘤、色素性干皮癥、角質棘細胞瘤、精上皮瘤、曱狀腺濾泡癌、畸胎瘤等其他的腫瘤。
19. 一種TNF同質三聚體，其特征在于，由THF-a、 FasL (CD95L或 ApolL)、 TRAIL (或ApolL)等腫瘤壞死因子(TNF)家族成員形成。
全文摘要
本發明的抗癌組織蛋白酶制劑，以組織蛋白酶E和/或由其活性部位構成的或者含有其活性部位的活性片段作為有效成分來含有。本發明的抗癌組織蛋白酶制劑對正常細胞沒有不良影響，在只抑制癌細胞的生長和防止轉移的同時，還能誘導癌細胞凋亡。另外，通過與其他的抗癌劑并用，對于以往的抗癌劑不顯示感受性的癌癥，也能增強其感受性，通過其感受性增強作用可顯著地提高對癌癥的治療效果。進一步，通過增強抗癌劑的感受性，減少其抗癌劑自身的用量，可以顯著降低其抗癌劑所引起的副作用等。
文檔編號A61K38/43GK101384277SQ200780005718
公開日2009年3月11日申請日期2007年2月19日優先權日2006年2月17日
發明者山本健二, 川久保友世申請人:國立大學法人九州大學

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