專利名稱：：抗應激性微生物及發酵產物的制備方法
技術領域：
：本項發明系關于發酵產物的制備方法，具體說就是通過微生物發酵，制取氨基酸等有益物質的方法，以及對抑制微生物的生長和/或發酵產物的產生的應激壓力具有抗性的微生物。
背景技術：
：細胞一旦處于高溫、高滲透壓、代謝阻滯、重金屬存在、病毒感染等應激狀態，在很短時間內就可以誘導合成一種稱為熱應激蛋白的蛋白質(以下簡稱[HSP])，以防御應激反應。這種HSP，從原核細胞到真核細胞具有廣泛的同源性，可分成這幾個大組(HSP60組、HSP70組、HSP90組、TRiC組、其它組)(Hendrick，J.P.andHartlF-V生物化學年評，62,349-384(1993))。HSP之所以具有抗應激性，是因為HSP具有形成蛋白質高級結構的功能(蛋白質的折疊)。即蛋白質因應激反應而變性、不能形成正常高級結構，HSP與其相結合，該蛋白質重新形成正確的高級結構(再折疊)使其恢復正常功能。在蛋白質形成高級結構的過程中，HSP不僅對已變性蛋白質發揮作用，即使是正常狀態的細胞，HSP也作為伴侶分子參與到蛋白質的折疊、組裝、轉運等過程中，現在人們已經意識到它的重要性，給予很大關注(Ellis，R.J.等科學250，954-959(1990)。所謂伴侶分子就是輔助的意思，因HSP可與各種蛋白質相結合發揮作用而被命名的。HSP是在細胞處于上述應激狀態的誘導之下發現的。通常情況下，這種誘導是暫時的，不久就會減退，重新達到一個新的穩定狀態。這種誘導HSP的方法，是在轉錄水平進行的(CowingD.C.等，美國國家科學院院報，80，2679-2683(1985)，Zhou，Y.N.等，細菌學雜志，170，3640-3649(1988))。HSP基因中有一稱為熱應激啟動子的結構，其中存在對該熱應激啟動子特異起作用的σ因子中的一種σ32。σ32是由rpoH基因編碼半衰期很短(約1分鐘)的一種蛋白質，它與短時誘導HSP密切相關(Straus，D.B.等，自然，329，348-351(1987))。σ32的自身調節是靠轉錄及翻譯進行的，但主要依靠翻譯調節。由熱應激方式誘導HSP的方法，主要取決于σ32合成量的增加和穩定性的增加二方面的機制。其中將σ32的結構進行熱處理，促進其翻譯功能，可增加它的合成量(Yura.T.等，微生物學年評，47，321-351(1993))；關于σ32穩定性問題，現在認為σ32的降解過程與HSP(Dnak等)有關，通過HSP反饋抑制其活動，達到一定狀態(Tilly，K等，細胞，34，641-646(1983)，Liberek，K，美國國家科學院院報8935116-3520(1994)。我們已經了解大腸桿菌(E.coli)在應激狀態下HSP與細胞生長之間的關系(Meury，J.等，歐洲微生物學聯合會微生物學快報，11393-100(1993))、dnaK對人成長過程中激素產生的影響及groE對膠原酶原分泌的影響(Hockney，R.C.，生物工程動態12，456(1994))，但還不清楚氨基酸核酸等發酵產物與HSP之間的關系。而且還尚不清楚棒桿狀細菌中HSP與生長的關系和HSP與發酵產物之間的關。發明公開本發明以明確HSP與微生物生長和發酵的關系為課題，在氨基酸等有益物質的發酵過程中，減少應激壓力對微生物的生長/或發酵產物產生的影響，從而改善生產及收獲率低下。本發明人，為解決上述課題進行了專門的研究，將編碼HSP的基因或編碼HSP中有特殊功能的σ因子的基因導入微生物中，結果發現這樣可使HSP活性增強，從而使微生物的生產性及生長等得到改善，及至最終完成本發明。本發明也即包括如下特征的方法在培養基中培養微生物，使發酵產物在培養基中生成和積聚，然后提取該發酵產物，再利用微生物制備發酵產物的方法，將前面提到的微生物中編碼HSP的基因或編碼HSP中有特殊功能的σ因子的基因，至少一個導入該發酵產物的細胞中，使HSP活性增強，減少應激反應對微生物的生長/或發酵產物產生的抑制。另一方面，本發明涉及一種產生發酵產物用的微生物，其中該微生物由于導入至少一種編碼HSP的基因和在細胞中特異性增強HSP表達量的σ因子的基因而被修飾，從而該微生物對應激壓力的抗性增強，否則的話應激壓力將抑制微生物的生長和/或發酵產物的產生。在一優選的實施方案中，根據本發明的方法和微生物涉及各種發酵產物包括，例如，L-蘇氨酸，L-賴氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鳥苷酸，肌苷，和肌苷酸；以及其它物質如維生素和抗生素。在另一優選的實施方案中，應激壓力包括溫度，培養基的滲透壓，和對微生物的生長不利的高濃度的發酵產物。在另一個優選的實施方案中，編碼熱應激蛋白的基因具體包括groE而編碼σ因子的基因具體包括rpoH。在另一個優選的實施方案中，本發明使用的微生物包括屬于大腸桿菌屬的細菌和棒桿狀細菌。下面將詳細描述本發明。本發明所使用的發酵產物沒有具體限制，只要它是可用微生物發酵產生的產物即可。發酵產物這些由微生物產生的如，各種L-氨基酸如L-蘇氧酸，L-賴氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鳥苷酸，肌苷，和肌苷酸；以及其它物質如維生素和抗生素。甚至一些目前不是用微生物產生的物質，本發明可用于這些物質使它們可用微生物產生，例如作為基因重組的后續結果。在上述的物質中，本發明的方法優選用于那些被分泌到培養基中的物質，尤其是氨基酸，以便增加培養基的滲透壓。對因導入至少一種編碼HSP的基因和編碼σ因子的基因而被修飾的微生物沒有特別限制，只要該微生物能通過發酵產生發酵產物即可，其中編碼σ因子的基因可特異性的作用于HSP基因以增加其在細胞中的表達量，從而增加了對抑制微生物的生長和/或發酵產物的產生的應激壓力的抗性。該微生物包括那些以被用于產生物質的，例如屬于大腸桿菌屬的細菌，棒桿狀細菌，屬于枯草桿菌屬的細菌，以及屬于沙雷氏菌屬的細菌。優選的微生物是其中以獲得了一個含質粒的復制起點的DNA片段，HSP基因或對HSP基因特異的基因的操縱子，而且這些基因的拷貝數在微生物中增加。上述的棒桿狀細菌是一組如伯杰氏鑒定細菌學手冊，第8版，599頁(1974)中所定義的微生物，它們是好氧和抗酸的不具孢子形成能力的革蘭氏陽性桿狀菌，屬于棒桿菌屬的細菌，屬于短桿菌屬的目前已被劃分到短桿菌屬但現在仍與屬于棒桿菌屬的細菌一致的細菌，和屬于與棒桿菌屬密切相關的短桿菌屬的細菌。具體地說，每種發酵產物的代表性微生物如下。適于L-蘇氨酸包括大腸桿菌VKPMB3996(RIA)(參見美國專利5,175,107)，和噬乙酰乙酸棒桿菌AJ12318(FERMBP-1172)(參見美國專利5,188,949)。適用于L-賴氨酸的包括，例如大腸桿菌AJ11442(NRRLB-12185，FERMBP-1543)(參見美國專利4,346,170)，大腸桿菌W3110(tyrA)(該菌株可通過從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERMBP-3635)中去除質粒pHATerm而得到，參見WO95/16042國際專利公報)，乳發酵短桿菌AJ12435(FERMBP-2294)(參見美國專利5,304,476)，和乳發酵短桿菌AJ3990(ATCC31269)(參見美國專利4,066,501)。適于L-谷氨酸的包括，例如大腸桿菌AJ12624(FERMBP-3835)(參見法國專利公開2,680,178)，乳發酵短桿菌AJ12821(FERMBP-4172)(參見日本專利公開5-26811，法國專利公開2,701,489)，乳發酵短桿菌AJ12475(FERMBP-2922)(參見美國專利5,272,067)，和乳發酵短桿菌AJ13029(FERMBP-5189)(參見JP95/01586國際專利公報)。適于L-亮氨酸的包括，例如，大腸桿菌AJ11478(FERMP-5274)(參見日本專利公報62-34397)，以及乳發酵短桿菌AJ3718(FERMP-2516)(參見美國專利3,970,519)。適于L-異亮氨酸包括，例如，大腸桿菌KXI41(VKPMB-4781)(參見歐洲專利公報519,113)，黃色短桿菌AJ12149(FERMBP-759)(參見美國專利4,656,135)。適于L-纈氨酸的包括，例如，大腸桿菌VL1970(VKPMB-4411)(參見歐洲專利公報519,113)，乳發酵短桿菌AJ12341(FERMBP-1763)(參見美國專利5,188,948)。適于L-苯丙氨酸的包括，例如，大腸桿菌AJ12604(FERMBP-3579)(參見日本專利公開5-236947和歐洲專利公報488,424)，乳發酵短桿菌AJ12637(FERMBP-4160)(參見法國專利公報2,686,898)。用于本發明方法的微生物包括上述的微生物，在所定義的由導入了至少一種編碼HSP的基因和特異性作用于HSP以增強HSP在細胞內的表達量的σ因子的基因而被修飾的微生物的范圍以內，從而使該微生物增加了對抑制微生物生長和/或發酵產物的產生的應激壓力的抗性。將被導入進微生物中的基因可以是編碼HSP的基因和編碼特異性作用于HSP基因的σ因子的基因中的任一個或二者。術語“增加HSP的表達量”指增加原先產HSP的微生物的HSP的產物量，還意謂著使在原先的狀態不表達HSP的微生物變德表達HSP。具體地說，HSP表達量的增加可這樣實現，例如，通過將外來或外源HSP基因導入微生物的細胞中并使其在細胞中表而實現。在這樣的方法中，可用能在微生物細胞中自主復制的載體，特別是多拷貝類型的質粒作為載體使細胞中的HSP基因的拷貝數增加。可替代地，HSP的表達可用具有高表達效率的啟動子增加每單位HSP基因的表達量而被有效的增強。可替代地，HSP還可通過向微生物細胞中導入一個特異性用作HSP基因的內在啟動子的σ因子的基因而被增強。編碼HSP的基因包括，例如，groE(GroELS的基因)，dnaK(DnaK的基因)，以及dnaJ(DnaJ的基因)。其中，優選groE。特異性作用于這些基因的σ因子以編碼σ32的rpoH為代表。作為這些基因來源低得微生物沒有特別限制，只要每種基因能夠在大腸桿菌屬的或棒桿狀細菌的微生物細胞中起作用，且具體的以屬于大腸桿菌屬和棒桿狀細菌的微生物為代表。已經報道了大腸桿菌的rpoH基因和groE基因的核苷酸序列(rpoH細菌學雜志，170，3479-3484(1988)；groE自然，333，330-334(1988))。這些基因可用在這些序列的基礎上合成的寡核苷酸引物通過PCR方法(聚合酶鏈式反應)從大腸桿菌染色體中得到。擴增rpoH基因的引物的核苷酸序列代表性地如SEQIDNOS1和2所示。擴增groE基因的引物的核苷酸序列代表性地如SEQIDNOS3和4所示。據報道已用PCR方法分離了黃色短桿菌的dnaK和groE基因，所用的引物是在來源于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的dnaK和groE基因中保守的氨基酸序列的基礎上制備的，且這些基因與來源于其它微生物的dnaK和groE基因高度同源(1994年日本分子生物學聯合會會議報告摘要，395頁)。根據以上事實，預測編碼其它HSP基因(dnaJ和rpoE基因等)也與其它來源于大腸桿菌的每一種基因高度同源。因此，認為可以很容易地使用來源于大腸桿菌的編碼HSP的基因通過雜交方法，或者利用這些基因的部分序列通過PCR方法從棒桿狀細菌中分離這些基因。為了將如上所述得到的基因導入大腸桿菌屬的細菌中，例如，將含有該基因的DNA片段與可在大腸桿菌屬的細菌細胞中自主復制的載體連接，并可用得到的大腸桿菌屬的重組載體轉化大腸桿菌的細菌。為了將上述的基因大腸桿菌屬細菌以外的其它微生物中，將含有該基因的DNA片段與可在微生物細胞中自主復制的載體連接，并可用得到的大腸桿菌屬的重組載體轉化該微生物。質粒載體DNA是本發明中可使用的優選的載體DNA。這些適于以大腸桿菌屬細菌作為導入用微生物的質粒包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，heRSF1010。可替代地，也可使用噬菌體DNA。為了有效地促進HSP的表達，可用在微生物中起操縱作用的啟動子如lac，trp，和PL代替HSP的內在啟動子。為了將HSP基因或特異性地對HSP基因起作用的σ因子導入微生物中，可用轉座子的方法(Berg，D.E.和Berg，C.M.，生物和工程學，1，417(1983))，μ噬菌體(日本專利公開2-109985)，或同源重組(分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室，1972)將含有該基因的DNA整合到微生物的染色體中。當導入該基因用的微生物是棒桿狀細菌時，可用于本發明的載體DNA包括能在棒桿狀細菌自主復制的質粒載體，如pAM330(參見日本專利公報1-11280)，和pHM1519(參見日本專利公開58-77859)。轉化方法與制備微生物轉化子的普通方法沒有特別不同。例如，對屬于大腸桿菌屬的細菌，可根據D.M.Morrison的方法(酶學方法，68，326(1979))，用氯化鈣處理受體細胞以增加對DNA的通透性的方法(Mandel，M和Higa，A，分子生物學雜志，53，159(1970))。棒桿狀細菌根據Mandel等的方法轉化，或者如在枯草芽孢桿菌中所述的在增殖期導入的方法(以提供所謂的感受態細胞(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，基因，1，153(1977))。可替代地，重組DNA可在將DNA受體細胞轉變為原生質體或原生質球后被導入，如在枯草芽孢桿菌，放線菌和酵母中已知的那樣可以容易地整合重組DNA(Chang，S和Choen，S.N.，分子和普通遺傳學，168，111(179)，Bibb，M.J.，Ward，J.M.，和Hopwood，O.A，自然，274，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.Fink，G.R.，美國國家科學院院報，75，1929(1978))。可替代地，也可用電脈沖方法將重組DNA導入屬于短桿菌屬或棒桿菌屬的細菌中(杉木等，日本專利公開2-207791)。普通微生物在受到培養溫度增加，由發酵產物或高濃度的培養基成分引起的高滲透壓，或與目標發酵產物相關的代謝異常等應激壓力的影響時，其生長受抑制，發酵產物的產量和產率下降。相反地，可能通過增強HSP的表達增加對此類應激壓力的抗性。結果，可以在受上述應激壓力影響的環境下增加發酵產物的產量。對應激壓力的抗性不是指完全的抗性，因此還包括減少由應激壓力引起的影響的特征。根據將被導入基因的類型和宿主微生物的類型，不是生長的抑制和發酵產物產量和產率的下降都必須脫敏。有時盡管生長受到抑制，但發酵產物的產率確有提高。根據本發明的方法可以增加對其抗性的應激壓力包括，如溫度，培養基的滲透壓和培養基中對微生物的生長非優選的高濃度的氨基酸。根據所用的微生物，用于本發明方法的發酵生產培養基可以是已知的培養基。即，是含碳源，氮源，無機離子和任選的其它有機成分的普通培養基。實現本發明不需要特殊的培養基。這些可用作碳源的包括，例如，糖類如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖和淀粉水解產物；醇類如甘油和山梨糖醇；有機酸如富馬酸，檸檬酸，和琥玻酸。可用作氮源的包括，例如，無機氨鹽如硫酸銨，氯化銨，和磷酸銨；有機氮如大豆水解產物，氨氣，和氨水。還希望含有合適量的作為有機微量營養源的所需物質如維生素B1，L-高絲氨酸，和L-酪氨酸；酵母提取物等。處此之外，如果需要還要加入小量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等。根據所用的微生物，可在已知的培養條件下進行培養。優選培養在通氣條件下進行16-120小時。在培養中溫度控制在25℃-45℃，pH控制在5-8。調節pH可以使用無機或有機的，酸性或堿性的物質，氨氣等。在本發明中，在發酵完成之后從培養基液體中收集發酵產物，不需要任何特殊方法。即，本發明可綜合使用離子交換樹脂，沉淀和其它已知的方法進行。實施本發明的最佳方式下面將參照實施例對本發明進行更詳細地描述。實施例1制備導入rpoH基因和groE基因用的質粒<1>rpoH基因和groE基因的克隆根據PCR方法(聚合酶鏈式反應)對大腸桿菌的rpoH基因和groE基因進行了克隆。PCR方法中所用的引物是在已報道的大腸桿菌的rpoH基因(細菌學雜志.，170，3479-3484(1988))和groE基因(自然，333，330-334(1988))序列的基礎上合成的。合成了具有如SEQIDNO1(5’端)和SEQIDNO2(3’端)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為擴增rpoH基因的引物。合成了具有如SEQIDNO3(5’端)和SEQIDNO4(3’端)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為擴增groE基因的引物。(擴增rpoH基因的引物)5′端-CGGAACGAAGTTTGATATCA-3′(SEQIDNO1)3′端5′-ATCCAGGGTTCTCTGCTTAA-3′(SEQIDNO2)(擴增groE基因的引物)5′端5′-GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3′(SEQIDNO3)3′端5′-GACGCACTCGCGTCGTCCGT-3′(SEQIDNO4)采用齊藤法(SaitoH.andMiura，K，生物化學和生物物理學報，72，619(1963))從大腸桿菌K-12菌株中提取染色體DNA，以此為模板，使用上述的寡核苷酸作為引物，進行PCR反應PCR反應即熱變性(94℃下1分鐘)、退火(37℃下2分鐘)、聚合反應(72℃下3分鐘)如此反復25次。用市場上銷售的DNA未端平齊化試劑盒(寶酒造社制Bluntingkit)，將獲取的擴增產物的兩末端平齊化處理，之后，將產物分別在載體質粒pSTV28的HincII位點導入，即得到了質粒pSTV28-rpoH和pSTV28-groE<2>在含有rpoH基因和groE基因的質粒中導入棒桿狀菌的復制起點為了使pSTV28-rpoH能在棒桿狀細菌細胞內自主復制，一個來源于已得到的可在棒桿狀細菌內自主復制的pHM1519質粒(Miwa，K等，農業生物化學，48(1984)2901-2903)的復制起點(日本專利公開5-007491)導入pSTV28-rpoH中。具體地，用限制酶BamHI和KpnI消化pHM1519以得到含復制起點的DNA片段。用DNA末端平齊化試劑盒(寶酒造社制)將得到的片段末端平齊化，然后將KpnI接頭(寶酒造社制)與該末端連接。該片段被插入了pSTV28-rpoH質粒的KpnI位點以得到pRPH。另一方面。用不含rpoH基因的質粒pHSG399作為對照。還用SalI接頭(寶酒造社制)將來源于pHM1519的復制起點對照質粒的SalI位點已得到pSAC4。實施例2用導入了rpoH基因的產谷氨酸細菌生產谷氨酸如上所述得到的pRPH和pSAC4被導入了具有產L-谷氨酸能力的乳發酵短桿菌AJ12821(FERMBP-4172)中。對含各個導入質粒的轉化子的谷氨酸產量進行評估。用電脈沖方法將質粒導入乳發酵短桿菌的細胞中(日本專利公開2-207791)。將含導入的質粒的轉化子在含4μg/ml氯霉素的CM2G的平板培養基(1L純水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克瓊脂，pH7.2)上篩選。對得到的轉化子的谷氨酸的產力進行了如下評價。在CM2G平板培養基中培養各轉化子，進行細胞更新，在1L純水中含葡萄糖80g、KH2PO41g、MgSO4.7H2O0.4g、(NH4)2SO430g、FeSO4.7H2O0.01g、MnSO4·7H2O0.01g、大豆水解液15ml、鹽酸硫胺200μg、生物素300μg、氯霉素4mg及CaCO350g這樣的培養基中培養更新的各轉化子(用KOH調節PH在8.0)。優選31-32℃培養20小時。培養后，測定菌體濃度和積聚在培養基中的L-谷氨酸的濃度。用Asahi化學公司的BiotecAnalyzerAs-210定量測定L-谷氨酸。把培養液用0.2N鹽酸稀釋51倍，通過它在660nm時的吸光度(OD660)菌體濃度。結果如表-1所示。表1這一結果表明導入了rpoH基因的乳發酵短桿菌谷氨酸生產菌，它的生長被抑制，而谷氨酸的產生量卻增加了。實施例3導入了rpoH基因的賴氨酸生產菌賴氨酸的產生上述制備的pRPH和pSAC4被導入了從乳發酵短桿菌ATCC13869突變而來的抗S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸并能產生L-賴氨酸的乳發酵短桿菌AJ12435(FERMBP-2294)中。測定了攜帶有各導入質粒的轉化子的L-賴氨酸的產力。用電脈沖的方法(日長專利公開2-207791)將質粒導入了乳發酵短桿菌的細胞中。將含導入的質粒的轉化子在含4μg/ml氯霉素的CM2G的平板培養基(1L純水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15免瓊脂，pH7.2)上篩選。對得到的轉化子的L-賴氨酸的產力進行了如下評價。在CM2G平板培養基中培養各轉化子，進行細胞更新，在1L純水中含葡萄糖80g、KH2PO41g、MgSO4.7H2O0.4g、(NH4)2SO430g、FeSO4.7H2O0.01g、MnSO4·7H2O0.01g、大豆水解液15ml、鹽酸硫胺200μg、生物素300μg、氯霉素4mg及CaCO350g這樣的培養基中培養更新的各轉化子(用KOH調節PH在8.0)。培養后，測定菌體濃度和積聚在培養基中的L-谷氨酸的濃度。用Asahi化學公司的BiotecAnalyzerAs-210定量測定L-賴氨酸。把培養液用0.2N鹽酸稀釋51倍，通過它在660nm時的吸光度(OD660)菌體濃度。結果如表-2所示。表2</tables>如表2所示，導入了rpoH基因的乳發酵短桿菌的細菌生長良好，L-賴氨酸的產量也有增加。猜想該結果收由于L-賴氨酸的積聚而來的滲透壓的增加波動的影響。實施例4導入了groE基因的L-苯丙氨酸生產菌苯丙氨酸的產生將按上述方法制備的pSTV28-groE或pSTV28導入培養自大腸桿菌K12株的苯丙氨酸生產菌AJ12604菌株(FERMBP-3579)中。對導入質粒的各轉化子產生苯基丙氨酸的情況進行評價。通過電子脈沖法(日本專利公開2-207791)導入質粒。將含導入的質粒的轉化子在含40μg/ml氯霉素的CM2G的平板培養基(1L純水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克瓊脂，pH7.2)上篩選。對得到的轉化子產生苯基丙氨酸的性能進行了如下評價。在含40mg/L氯霉素的L平板培養基中培養各轉化子，進行細胞更新。在1L純水中含葡萄糖20g、Na2HPO429.4g、KH2PO46g，NaCl1g，NH4Cl2g，10g檸檬酸鈉，0.4g谷氨酸鈉，MgSO4.7H2O3g、0.23gKcl，2mg鹽酸硫胺，75mgL-酪氨酸和40mg氯霉素，這樣的培養基中培養更新的各轉化子(用KOH調節PH在7.0)。培養后，測定菌體濃度和積聚在培養基中的L-苯丙氨酸的濃度。用Asahi化學公司的BiotecAnalyzerAs-210定量測定L-賴氨酸。把培養液用純水稀釋51倍，通過它在660nm時的吸光度(OD660)菌體濃度。結果如表-3所示。表3這一結果表明導入groE基因的大腸桿菌的L-苯丙氨酸的產生量增加了。實施例5導入了rpoH基因的具有了產生L-賴氨酸能力的大腸桿菌L-賴氨酸的產生使用大腸桿菌W3110(tyrA)株作為生產賴氨酸的宿主。在歐洲專利公開92年488424號公報中詳細記載W3110(tyrA)株，以下就簡要地介紹其制備方法。從國立遺傳學研究所(靜岡縣三島)獲得大腸桿菌W3110。將該菌株涂布在含有鏈霉素的LB平板上，從形成的菌落中可取得耐鏈霉素株。把選擇出的耐鏈霉素株和大腸桿菌ME8424株混和，在完全培養基(L-肉湯1％細菌培養用胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCI)37℃的條件下，15分鐘靜置培養，誘導融合。大腸桿菌K-12ME8424株有(hfrP045，thi，relA1，tryATn10，ung-1，nadB)的遺傳特征，能夠從國立遺傳學研究所取得。然后，把培養物放入含有鏈霉素、四環素以及L-酪氨酸的完全培養基(L-肉湯1％細菌培養用胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中，選擇形成菌落的菌株，將此株命名為大腸桿菌(tyrA)株。在歐洲專利公報488424(1992)中描述了許多把質粒導入而形成的菌株。例如，將導入了質粒pHATerm的菌株命名為大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm，根據布達佩斯條約于1991年11月16以登記號FERMBP-3635保藏于通商產業省工業技術院生命工業技術研究所(郵編305日本茨城縣筑波市東1區1條3號)。可用常規方法將質粒pHATerm從該菌株去除而得到大腸桿菌W3110(tyrA)。根據實施例4的方法，把攜帶有賴氨酸合成基因的質粒RSFD80導入了大腸桿菌W3110(tyrA)菌株。RSFD80在WO95/16042國際專利公報中有描述，它含有對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的編碼二氫葉酸還原酶的DNA，和對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的編碼天冬氨酸激酶的DNA。攜帶RSFD80質粒的大腸桿菌JM109菌株被命名為AJ12396，并于1993年10月28號以登記號FERMP-13936保藏于通商產業省工業技術院生命工業技術研究所(郵編305日本茨城縣筑波市東1區1條3號)，并根據1994年11月1日布達佩斯條約轉移為國際保藏，保藏號FERMBP-4859。導入了RSFD80的W3110(tyrA)的轉化子在含50μg/ml的鏈霉素的平板培養基上進行篩選。另一方面，為導入rpoH基因用的質粒構建如下。根據實施例1<1>中的PCR方法擴增rpoH基因。用商業購德的DNA末端平齊化試劑盒使得到的擴增產物兩端平齊化(寶酒社造制)，然后將其克隆進質粒載體pMW119(和光純藥社制)的HincII位點。根據上述方法將該質粒導入大腸桿菌W3110(tyrA)/RSFD80菌株中。在含50μg/ml的鏈霉素和50μg/ml的氨芐青霉素的L平板培養基上進行篩選。對上述得到的大腸桿菌W3110(tyrA)/RSFD80菌株和大腸桿菌W3110(tyrA)/RSFD80+pMWrpoH菌株的L-賴氨酸產力進行評價。對得到的轉化子的L-賴氨酸的產力評價如下。將轉化子培養在L平板培養基上使細胞更新。每個更新的轉化子在37℃在如下培養基中培養30小時，其中培養基在1L純水中含有40g葡萄糖，1gKH2PO4，0.01gMnSO4.7H2O，0.01gFeSO4.7H2O，2g酵母提取物，0.1gL-酪氨酸，1gMgSO4，和25gCaCO3(用KOH調pH值為7.0)。除了在最初加入40g/L鹽酸L-賴氨酸外，在本該轉化子也被培養在相同的培養基中。用旭化成(株)制造的Biotec分析儀AS210對L-賴氨酸進行定量測定。表4示以鹽酸L-賴氨酸表示的L-賴氨酸量的增加(在培養后從培養基中L-賴氨酸的量中去除初始加入的L-賴氨酸的量)。表4</tables>根據以上結果，與不含導入的rpoH基因的菌株相比，即使在高濃度的L-賴氨酸的存在下，大腸桿菌的L-賴氨酸的產率也有提高。用于產業中的可能性通過本發明，明確了HSP與微生物生長和發酵產物發酵之間的關系，能夠在氨基酸等有益物質的發酵過程中，減少應激反應的影響，改善生產和收獲率低下。序列表(1)一般信息申請人味素株氏會社發明名稱抗應激性微生物及發酵產物的制備方法序列數4聯絡方法A會社名稱味素株氏會社B會社地址京橋1丁目15-1C市中央區D州東京都E國日本F郵區104計算機可讀形式A媒體B計算機C操作系統D軟件當前申請數據A申請號B申請日C分類代理人/事物所信息A名字B登記號C整理號通信方法A電話號碼B傳真號碼(2)有關SEQIDNO1的信息(i)序列特征A長度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說明SEQIDNO1CGGAACGAAGTTTGATATCA20(2)有關SEQIDNO2的信息(i)序列特征A長度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說明SEQIDNO2號序列ATCCAGGGTTCTCTGCTTAA20(2)有關SEQIDNO3的信息(i)序列特征A長度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說明SEQIDNO3GACGTCGATAGCAGGCCAAT20(2)有關SEQIDNO4的信息(i)序列特征A長度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說明SEQIDNO4GACGCACTCGCGTCGTCCGT20權利要求1.一種用微生物制備發酵產物的方法，其特征在于包括在培養基中培養微生物使其在培養基中長生和積累發酵產物以及收集發酵產物的步驟，其中所說的微生物由于導入至少一種編碼熱應激蛋白和編碼特異性作用于熱應激蛋白，增加其在細胞中的表達量的σ因子的基因而被修飾，從而所述微生物可增加對應激壓力的抗性，否則的話該應激壓力會抑制微生物的生長和/或發酵產物的產生。2.權利要求1的方法，其中發酵產物是氨基酸。3.權利要求1的方法，其中所述應激壓力是溫度，培養基的滲透壓，或對微生物的生長不利的目標發酵產物。4.權利要求1的方法，其中所述編碼熱應激蛋白的基因是groE。5.權利要求1的方法，其中所述編碼σ因子的基因是rpoH基因。6.權利要求1的方法，其中所述微生物是屬于大腸桿菌屬的細菌，或者是棒桿狀細菌。7.一種用于產生發酵產物的微生物，其中所說的微生物由于導入至少一種編碼熱應激蛋白和編碼特異性作用于熱應激蛋白，增加其在細胞中的表達量的σ因子的基因而被修飾，從而所述微生物可增加對應激壓力的抗性，否則的話該應激壓力會抑制微生物的生長和/或發酵產物的產生。全文摘要通過在培養基中培養微生物使其在培養基中長生和積累發酵產物以及收集發酵產物而利用一種微生物發酵產生有用的如氨基酸等物質等方法,其中所說的微生物由于導入至少一種編碼熱應激蛋白和編碼特異性作用于熱應激蛋白,增加其在細胞中的表達量的σ因子的基因而被修飾,從而所述微生物可增加對應激壓力的抗性,阻止了應激壓力對微生物的生長和/或發酵產物的產生的抑制,否則的話該應激壓力會抑制微生物的生長和/或發酵產物的產生。文檔編號C12P13/08GK1181785SQ9619333公開日1998年5月13日申請日期1996年2月9日優先權日1995年2月20日發明者木村英一郎,河原義雄,后藤慎也,中松亙,菊池慶實,倉橋修申請人:味之素株式會社被以下專利引用(2),