專利名稱：改進微生物中產物生產的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、分子生物學和生物技術領域。更具體地，本發明涉及改進微生物中產物如乙醇和氫的生產的方法和組合物。
背景技術：
開發從可再生和可持續生物質資源生產可用能源的方法和組合物是有利的。碳水化合物形式的能源可以在廢棄生物質和專用能源作物例如，谷物如玉米或小麥，或草如柳枝稷中找到。目前的挑戰是開發將碳水化合物轉化成可用能源形式的可行的和經濟的策略。從碳水化合物得到有用能源的策略包括生產乙醇和其它醇，將碳水化合物轉化成氫，和通過燃料電池將碳水化合物直接轉化成電能。得到乙醇形式生物質的策略的例子由DiPardo， Journal of Outlook for Biomass Ethanol Production and Demand(EIA Forecasts), 2002 ；Sheehan, Biotechnology Progress,15 :8179,1999 ；Martin, Enzyme Microbes Technology,31 :274,2002 ；Greer, BioCycle,61-65, April 2005 ；Lynd, Microbiology and Molecular Biology Reviews，66 :3，506—577，2002 ；禾口 Lynd 等在"Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass :An Update, " Current Opinion in Biotechnology, 16 :577-583, 2005 中描述。

發明內容
本申請特別基于Clostridium phytofermentans基因的鑒定，所述基因編碼預測涉及在產物產量有用的培養基上生長的產物，所述產物如燃料，例如乙醇和氫。本文中所鑒定的基因可以在其它微生物中異源表達以提供新的或增強的功能。同樣，這些基因可以在 C. phytofermentans中，例如由外源引進的核酸表達，以提供增強的功能。一些實施方式包括含有編碼至少一種在C. phytofermentans中鑒定的水解酶的分離核酸的多核苷酸。在這樣的實施方式中，所述分離核酸可以從表6中選擇。在具體的實施方式中，所述水解酶選自 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0430、Cphy3854、Cphy0857、 Cphy0694和Cphyl^9組成的組。名稱Cphy3367代表JGI號碼，其指的是Genbank記載的 C. phytofermentans的美國國家生物技術信息中心(NCBI)基因座標簽。在更多實施方式中，所述多核甘酸可以包含可操作地連接至編碼所述水解酶的分離核酸的調控序列。一些實施方式包括含有編碼至少一種在C. phytofermentans中鑒定的ATP結合盒 (ABC)轉運子的分離核酸的多核苷酸。在這些實施方式中，所述分離核酸可以從表7中選擇。在具體實施方式
中，所述ABC轉運子選自Cphy3854、Cphy3855、Cphy3857、Cphy3858、 Cphy3859、Cphy3860、Cphy3861和Cphy3862組成的組。在更多實施方式中，所述多核苷酸可以包含可操作地連接至編碼ABC轉運子的分離核酸的調控序列。一些實施方式包括含有編碼至少一種在C. phytofermentans中鑒定的轉錄調節因子的分離核酸的多核苷酸。在這些實施方式中，所述分離核酸可以從表8中選擇。在更多實施方式中，所述多核苷酸可以包含可操作地連接至編碼轉錄調節因子的分離核酸的調控序列。一些實施方式包括含有編碼本文描述的水解酶、ABC轉運子和轉錄調節因子的核酸的任何組合的多核苷酸盒。在一種實施方式中，多核苷酸盒可以包含編碼至少一種水解酶的分離核酸和編碼至少一種ABC轉運子的分離核酸。在另一種實施方式中，多核苷酸盒可以包含編碼至少一種水解酶的分離核酸和編碼至少一種轉錄調節因子的分離核酸。在另一種實施方式中，多核苷酸盒可以包含編碼至少一種ABC轉運子的分離核酸和編碼至少一種轉錄調節因子的分離核酸。在另一種實施方式中，多核苷酸盒可以包含編碼至少一種水解酶的分離核酸和編碼至少一種ABC轉運子的分離核酸和編碼至少一種轉錄調節因子的分離核酸。一些實施方式包括含有本文描述的任何多核苷酸的表達盒和可操作地連接至所述多核苷酸盒的調控序列。一些實施方式包括含有任何本文描述的多核苷酸、多核苷酸盒和/或表達盒的重組微生物。在具體實施方式
中，所述重組微生物可以選自Clostridium eellulovorans> Clostridium eellulolyticum、Clostridium thermoce1lum、 Clostridium josui、 Clostridium papyrosolvens、 Clostridium eellobioparum、 Clostridium hungatei、 Clostridium eellulosi、 Clostridium stercorarium、 Clostridium termitidis、Clostridium thermocopriae、Clostridium celerecrescens、 Clostridium polysaccharolyticum> Clostridium populeti> Clostridium lentocellum、 Clostridium chartatabidum、Clostridium aldrichii、Clostridium herbivorans、 Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Caldicellulosiruptor saccharolyticum、Ruminococcus albus、Ruminococcus flavefaciens> Fibrobacter succinogenes、Eubacterium cellulosolvens、Butyrivibrio fibrisolvens、 Anaerocellum thermophilum、Halocella eellulolytica、Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum 禾口 Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的^1。一些實施方式包括編碼在C. phytofermentans中鑒定的水解酶的分離蛋白。在一些實施方式中，提供生產乙醇的方法。這些方法包括培養微生物、提供培養基和提供本文描述的任何分離蛋白。一些實施方式包括分離的多核苷酸盒，所述分離的多核苷酸盒包括一個或多個、兩個或多個、或全部三個編碼Clostridium phytofermentans水解酶的序列、編碼 C. phytofermentans ATP 結合盒(ABC)轉運子的序列禾口編碼 C. phytofermentans 轉錄調節因子的序列。在一些實施方式中，所述水解酶選自Cphy3368、Cphy3367、Cphy 1799, Cphyl800、Cphy2105、Cphyl071、Cphy0430、Cphyll63、Cphy3854、Cphyl929、Cphy2108、 Cphy3158、Cphy3207、Cphy3009、Cphy3010、Cphy2632、Cphy3586、Cphy0218、Cphy0220、Cphyl720、Cphy3160、Cphy2276、Cphyl714、Cphy0694、Cphy3202、Cphy3862、Cphy0858、 Cphyl510、Cphy2128、Cphyll69、Cphyl888、Cphy2919 和 Cphyl612 組成的組。在一些實施方式中，所述 ABC 轉運子選自 Cphyl529、Cphyl530、Cphyl531、Cphy3858、Cphy3859、Cphy3860、 Cphy2569、Cphy2570、Cphy2571、Cphy2654、Cphy2655、Cphy2656、Cphy3588、Cphy3589、 Cphy3590、Cphy3210、Cphy3209、Cphy3208、Cphy2274、Cphy2273、Cphy2272、Cphy2268、 Cphy2267、Cphy2266、Cphy2265、Cphy2012、Cphy201U Cphy2010、Cphy2009、Cphyl717、 Cphyl716、Cphyl715Cphyl45U Cphyl450、Cphyl449、Cphyl448、Cphyl 134, Cphy 1133 和 Cphyl 132組成的組。一些實施方式包括重組微生物，所述重組微生物包括本文公開的核酸，如一個或多個、兩個或多個、或全部三個編碼Clostridium phytofermentans水解酶的外源核酸、 編碼C. phytofermentans ATP結合盒(ABC)轉運子的外源核酸和編碼C. phytofermentans 轉錄調節因子的外源核酸。在一些實施方式中，所述水解酶選自Cphy3368、Cphy3367、 Cphyl799、Cphyl800、Cphy2105、Cphyl071、Cphy0430、Cphyll63、Cphy3854、Cphyl929、 Cphy2108、Cphy3158、Cphy3207、Cphy3009、Cphy3010、Cphy2632、Cphy3586、Cphy0218、 Cphy0220、Cphyl720、Cphy3160、Cphy2276、Cphyl714、Cphy0694、Cphy3202、Cphy3862、 Cphy0858、Cphyl510、Cphy2128、Cphyl 169、Cphyl888、Cphy2919 和 Cphyl612 組成的組。在一些實施方式中，所述ABC轉運子選自Cphyl529、Cphyl530、Cphy 153U Cphy3858、 Cphy3859、Cphy3860、Cphy2569、Cphy2570、Cphy2571、Cphy2654、Cphy2655、Cphy2656、 Cphy3588、Cphy3589、Cphy3590、Cphy3210、Cphy3209、Cphy3208、Cphy2274、Cphy2273、 Cphy2272、Cphy2268、Cphy2267、Cphy2266、Cphy2265、Cphy2012、Cphy201U Cphy2010、 Cphy2009、Cphyl717、Cphyl716、Cphyl715 Cphyl451、Cphyl450、Cphyl449、Cphyl448、 Cphyl 134、Cphyl 133和Cphyl 132組成的組。在一些實施方式中，所述微生物選自 Clostridium ce1Iulovorans>Clostridium ce1IuloIyticum>Clostridium thermocellum、 Clostridium josui、 Clostridium papyrosolvens、 Clostridium eellobioparum、 Clostridium hungatei、 Clostridium cellulosi、 Clostridium stercorarium、 Clostridium termitidis、Clostridium thermocopriae、Clostridium celerecrescens、 Clostridium polysaccharolyticum> Clostridium populeti> Clostridium lentocellum、 Clostridium chartatabidum、 Clostridium aldrichii、 Clostridium herbivorans、 Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Caldicellulosiruptor saccharolyticum、Ruminococcus albus、Ruminococcus flavefaciens> Fibrobacter succinogenes、Eubacterium cellulosolvens、Butyrivibrio fibrisolvens、 Anaerocellum thermophilum、Halocella eellulolytica、Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum 禾口 Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的^1。一些實施方式包括生產乙醇的方法，所述方法包括培養至少一種本文描述的重組微生物。這樣的實施方式同樣可以包括向微生物提供培養基。在具體實施方式
中，所述培養基可以選自鋸末、木粉、木漿、紙漿、紙漿廢汽、草如柳枝稷、生物質植物和農作物，如海甘藍、海藻、稻殼、甘蔗渣、黃麻、樹葉、大型藻類物質、微藻類物質、草屑(grass clippings)、 玉米桿、玉米棒子、玉米粒、玉米粉、蒸餾谷物和果膠組成的組。在具體實施方式
中，所述培養基可以是果膠。
一些實施方式包括處理水解酶培養基的方法，包括提供外源表達Clostridium phytofermentans水解酶的微生物和向所述微生物提供水解酶的培養基，使得所述培養基被處理以形成產物。在一些實施方式中，所述微生物外源表達轉運(如輸入或輸出)產物白勺 Clostridium phytofermentans ATP(ABC) $fgi。一些實施方式包括用于生物燃料生產的產物，包括木質纖維生物質和能夠直接水解和發酵所述生物質的微生物，其中所述微生物被改良以提高一種或多種纖維素酶(如在本文中公開的一種或多種纖維素酶,如 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和Cphyll63)的活性。在一些實施方式中，所述微生物能夠直接發酵五碳和六碳糖。在一些實施方式中，所述微生物是細菌，如梭菌屬的種，如Clostridium phytofermentans。在一些實施方式中，所述微生物包含一種或多種提高一種或多種纖維素酶活性的異源多核苷酸。一些實施方式包括用于生物燃料生產的產物，包括碳質生物質和能夠直接水解和發酵所述生物質的微生物，其中所述微生物被修飾以提高一種或多種纖維素酶(如在本文中公開的一種或多種纖維素酶,如 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163)的活性。在一些實施方式中，所述微生物能夠生產發酵終產物。在一些實施方式中，發酵終產物的實質部分是乙醇。在一些實施方式中，所述發酵終產物包括乳酸、乙酸和/或蟻酸。在一些實施方式中，所述微生物能夠吸收一種或多種復雜碳水化合物。在一些實施方式中，所述生物質具有比單體碳水化合物更高濃度的低聚體碳水化合物。一些實施方式包括生產生物燃料的方法，包括(a)用能夠直接水解和發酵碳質生物質的微生物接觸碳質生物質，其中所述微生物被改良以提高一種或多種纖維素酶(如在本文中公開的一種或多種纖維素酶，如 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163)的活性；和(b)對上述水解和發酵給予充分時間以生產生物燃料。在一些實施方式中，所述微生物能夠吸收一種或多種復雜碳水化合物。在一些實施方式中，所述生物質具有比單體碳水化合物更高濃度的低聚體碳水化合物。在一些實施方式中，所述水解導致相對單體碳水化合物更高濃度的纖維二糖和/或更大的低聚物。本文中使用的抬頭僅出于結構目的，并不能被解釋為以任何方式限定所描述的主題。本申請中引用的所有文獻和相似的材料，包括但不限于專利、專利申請、論文、書籍、論述和因特網網頁，特別地出于任何目的通過引用的方式全部結合至本文。如果術語在結合的參考文獻中的定義與本申請中提供的定義不同，以本申請提供的定義為準。應當意識到， 在本申請討論的度量如溫度、濃度和時間之前有隱含的“大約”，因此稍微的和非實質的偏差包括在本申請的范圍內。在本申請中，除另有明確說明，單數包括復數。同樣，“包含”、 “包括”的使用并不意味限定。應當理解，前述的一般性描述和之后的具體描述都僅是示例和說明性的，而不是限制本發明。本文中使用的術語“一”指的是一或多于一(即至少一) 的文章的文法對象。例如，“一個元件”意味著一個元件或多于一個元件。除非另有限定，用于與本文所描述的發明相關的科技術語應當具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非文中另有要求，單數術語應當包括復數并且復數術語應當包括單數。通常，與本文描述的細胞和組織培養、分子生物學和蛋白和寡聚或多聚核苷酸化學和雜交相關使用的術語和技術是本領域中已知和通常使用的那些。例如，標準技術被用于核酸純化和制備、化學分析、重組核酸和寡核苷酸合成。根據生產商的說明書或如本領域通常使用的或如本文描述的方式實施酶反應和純化技術。本文描述的技術和工作程序一般根據本領域已知的常規方法和如在多個一般和更具體的參考文件中描述的方式實施，所述參考文件在本說明書中貫穿引用和討論。見，如Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2000)。所使用的與本文有關的術語和本文所描述的實驗室工作程序和技術是本領域已知和通常使用的那些。為與本文提供的實施方式使用一致，除非有其它說明，以下術語應當被理解為具有以下含義“核苷酸”指核苷的磷酸酯，作為單體單位或核酸內。“5’ -三磷酸核苷酸”指三磷酸酯基團的5’位置有核苷酸，其有時被表示為“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”以具體指出核糖的結構特征。所述三磷酸酯基團可以包括對于不同氧的硫取代物，如α-硫代-5'-三磷酸核昔酸。核酸化學的綜述見Shabarova，Z.禾P Bogdanov，A，Advanved Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, New York,1994。術語“核酸”和“核酸分子”指如DNA (脫氧核糖核酸)和RNA (核糖核酸)的天然核酸序列、人工核酸、它們的類似物或它們的組合。如本文中所用的，術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交替使用，意思是核苷酸單體 (核酸)的單鏈或雙鏈聚合體，包括但不限于由如3’ -5’和2’ -5’的核苷間磷酸二酯鍵所連接的、如5’-5’的反向連接的2’-脫氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(RNA)，分枝結構，或核酸類似物。多核苷酸具有締合的反離子，如H+、NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等等。多核苷酸可以完全由脫氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或它們的混合物組成。多核苷酸可以由核苷堿基和糖類似物組成。多核苷酸典型的大小范圍在幾個單體單元(例如在本領域當它們更通常普遍被指定為寡核苷酸時，為5-40)至幾千個單體核苷酸單元。除非另有指定， 只要出現多核苷酸序列，應當理解所述核苷酸從左至右是按照5’到3’順序，并且“A”表示脫氧腺苷，“C”表示脫氧胞苷，“G”表示脫氧鳥苷，“T”表示胸苷。本文使用的“燃料和/或其它化學品”指的是適于作為液體或氣體燃料的化合物， 包括但不限于烴、氫、甲烷、羥基化合物如醇(如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇等)、羰基化合物如醛和酮(如丙酮、甲醛、ι-丙醛等)、有機酸、有機酸衍生物如酯(如蠟酯、甘油酯等)和其它官能化合物，包括但不限于1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乳酸、蟻酸、乙酸、琥珀酸和丙酮酸， 所述化合物由纖維素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木質素酶和半纖維素酶等酶產生。術語“質粒”指環形核酸載體。通常，質粒包含復制起點，使得在細菌(或有時真核的)細胞中質粒產生許多拷貝而沒有整合至宿主細胞DNA中。本文中使用的術語“構建體”指重組核苷酸序列，通常是重組核酸分子，它的產生出于表達特異核苷酸序列的目的，或被用在其它重組核苷酸序列的構建中。大體上，本文中使用的“構建體”指重組核酸分子。“表達盒”指一組允許多核苷酸在宿主細胞中轉錄的多核苷酸元件。典型地，所述表達盒包括啟動子和被轉錄的異源或本身的多核苷酸序列。表達盒或構建體同樣可以包括，如轉錄終止信號、多腺苷酸化信號和增強子元件。“表達載體”意思是使得多核苷酸在細胞內表達的載體。多核苷酸的表達包括轉錄和/或轉錄后事件。“表達構建體”是插入有目標核苷酸序列的載體，所述目標核苷酸序列以使得所述目標核苷酸序列置于可操作地連接至表達載體中存在的表達序列的方式插入。“操縱子”指一組產生信使RNA(mRNA)的多核苷酸元件。典型地，所述操縱子包括啟動子和一個或多個結構基因。典型地，操縱子包含一個或多個被轉錄至一個多順反子 mRNA(編碼多于一個蛋白的單一 mRNA分子)的結構基因。在一些實施方式中，操縱子也可以包括調節操縱子結構基因活性的操縱基因。本文中使用的術語“宿主細胞”指使用本發明的方法和組合物轉化的細胞。大體上，本文中使用的宿主細胞意思是引入有目標核酸的微生物細胞。本文中使用的術語“轉化”指在細胞中隨著非宿主核酸序列的融合而誘導的永久或瞬時遺傳改變，如永久遺傳改變。本文中使用的術語“轉化的細胞”指通過重組核酸技術手段已經將編碼目標基因產物(如RNA和/或蛋白)的核酸分子引入細胞(或其祖先細胞)的細胞。本文中使用的術語“基因”指宿主基因組的任何和所有不連續的編碼區，或者僅編碼功能性RNA (如tRNA、rRNA、調控RNA如核酶)的區和包括相關的非編碼區和調控區。術語“基因”的范圍包括編碼特異多肽的開放閱讀框、內含子和涉及表達調控的鄰近的5’和 3’非編碼核苷酸序列。在這點上，基因可以進一步包含控制信號如啟動子、增強子和/或與給出基因天然相關的終止信號，或異源控制信號。基因序列可以是cDNA或基因組核酸或它們的片段。基因可以被引入至合適的載體以在染色體外存在或整合至宿主。本文中使用的術語“目標基因”、“目標核苷酸序列”、“目標多核苷酸”或“目標核酸”指任何編碼期望在宿主細胞中表達的蛋白或其它分子(如在靶細胞中生產蛋白或其它生物分子(如RNA產物))的核苷酸或核酸序列。所述目標核苷酸序列可以可操作地連接至促進表達的其它序列，如啟動子。本文中使用的術語“啟動子”指足以引導與其可操作連接的核酸序列轉錄的最小的核酸序列。本文中使用的術語“誘導型啟動子”指當結合轉錄激活劑時有轉錄活性的啟動子，其進而在特定條件下被激活，如存在影響轉錄激活劑與誘導型啟動子結合和/或影響轉錄激活劑本身的功能的特定化學信號或化學信號的組合時。本文中使用的術語“操縱子”、“控制序列”或“調控序列”指調控可操作地連接的編碼序列在特定宿主生物體中表達的核酸序列。適合原核生物的控制序列包括例如啟動子、 任選地操縱基因序列和核糖體結合位點。“可操作地連接”等的意思是多核苷酸元件具有功能關系的連接。當核酸序列被置于與另一核酸序列具有功能關系，則所述核酸序列是“可操作地連接”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它是可操作地連接至編碼序列。在一些實施方式中，可操作地連接意思是被連接的核酸序列典型地是鄰近的，其中有必要使兩個蛋白編碼區，鄰近的并在讀碼框中連接。編碼序列“可操作地連接至”另一編碼序列，RNA聚合酶將轉錄所述兩條編碼序列至單一 mRNA，其然后被翻譯成具有源自兩條編碼序列的氨基酸的單一多肽。所述編碼序列不需要彼此鄰近，只要表達序列最終被加工產生需要的蛋白。“可操作地連接”啟動子至可轉錄的多核苷酸意思是將可轉錄的多核苷酸置于啟動子的調控控制下，其然后控制多核苷酸的轉錄和可選地多核苷酸的翻譯。在異源啟動子/ 結構基因化合物的構建中，典型地將啟動子或它的變異體遠離可轉錄的多核苷酸的轉錄起始位點放置，大約與該啟動子和它在自然情況下控制的基因，即啟動子起源的基因之間的距離相同。如本領域所知，可以在這個距離設置一些變異體而不喪失功能。相似地，與處于調控序列元件控制下的可轉錄的多核苷酸相關的調控序列元件如操縱子、增強子的典型放置由所述元件在它的自然情況下，即它所源于的基因的放置限定。“培養”表示在細胞或生物能夠進行一些(如果不是全部)生物學過程的條件下孵育細胞或生物。例如，培養細胞使之生長或繁殖，或者它可能是非活性的但仍然能夠進行生物學和/或生物化學過程如復制、轉錄、翻譯等。“轉基因生物”意思是在其部分細胞中存在有非內源性(即異源)核酸序列或非內源性(即異源)核酸序列穩定整合至其種系核酸中的非人類生物(如單細胞生物(如微生物)、哺乳動物、非哺乳動物(如線蟲或果蠅))。本文中使用的術語“生物質”指大量活的或生物材料并包括天然的或加工的，以及更寬泛地天然有機材料。“重組”指合成的或其它體外操作的多核苷酸(重組多核苷酸)和在細胞或其它生物系統中使用重組多核苷酸生產由那些多核苷酸編碼的基因產物的方法。例如，可以將克隆的多核苷酸插入至合適的表達載體中，例如細菌質粒，所述質粒可以用于轉化合適的宿主細胞。包含重組多核苷酸的宿主細胞被稱為“重組宿主細胞”或“重組細菌”。然后所述基因在重組宿主細胞中被表達以產生如“重組蛋白”。另外，重組多核苷酸可以提供非編碼功能，例如啟動子、復制起點或核糖體結合位點。術語“異源重組”指基于核酸序列相似性兩個核酸分子之間的重組過程。該術語包括交互重組和非交互重組(也被稱為基因轉變)。此外，所述重組可以是等價或非等價的交叉事件的結果。等價交叉發生在兩個等價序列或染色體區之間，而非等價的交叉發生在非等價序列或染色體區的相同(或基本上相同)片段之間。非相等的交叉典型地導致基因重復或刪除。涉及同源重組的酶和機制的描述見Watson等，Molecular Biology of the Gene 313-327 頁，The Benjamin/Cummings Publishing Co.第 4 版(1987)。術語“非同源或隨機整合”指不包括同源重組的、核酸被整合至基因組的任何過程。它表現出是整合可以發生在很多基因組定位的任意一個的隨機過程。“異源多核苷酸序列”或“異源核酸”是相對術語，指與另一多核苷酸(如啟動子序列)以使得兩條多核苷酸序列沒有被設置成如在自然中彼此一樣的關系的方式而功能相關的多核苷酸。異源多核苷酸序列包括如可操作地連接至異源核酸的啟動子，和包含它天然啟動子的多核苷酸序列，其被插入至異源載體中用于轉化至重組宿主細胞。異源多核苷酸序列被認為是“外源”因為它們通過轉化技術被引入至宿主細胞。但是異源多核苷酸可以來自不同來源或來自相同來源。異源多核苷酸序列的改變可以發生，例如，通過用限制性酶處理所述多核苷酸以產生能夠可操作地連接至調控元件的多核苷酸序列。改變也可以通過如定點突變發生。術語“內源表達”指相對于宿主細胞是天生的并且在所述宿主細胞中天然表達的多核苷酸。“能夠表達”指為內源和/或外源多核苷酸的表達提供足夠的細胞環境的宿主細胞。本申請涉及2008年2月27日提交的美國臨時申請號61/032，048、2009年2月27日提交的國際申請號PCT/US2009/35597、2009年4月6日提交的美國申請號12/419,211、 2008年6月11日提交的美國臨時申請號61/060，620和2009年6月11日提交的美國申請號12/483，118，每一個的全部內容都出于任何目的通過引用的方式結合至本文。下面的圖、描述和實施例詳細說明了本發明的一些具體實施方式
。本領域技術人員將意識到許多變化和修改形式都包括在它的范圍內。因此，一些具體實施方式
的描述不應當被認為限制本發明的范圍。


圖1是一系列多核苷酸基因組合實施例的簡圖。R代表轉錄調控序列；A、B和C代表編碼ATP結合盒(ABC)轉運子的序列；GH代表編碼糖苷水解酶的序列；S代表信號序列。圖2是一系列C. phytofermentans中基因組合的具體實施例的簡圖。數字代表特定序列在C. phytofermentans染色體上的定位。圖3是C. phytofermentans Affymetrix微列陣設計的簡圖。破折號表示微列陣上合成的M堿基探針。盒子表示預測的開放閱讀框，如蛋白編碼區。11個M堿基探針被用于測量每一個開放閱讀框(ORF)的水平。基因間區在DNA兩側均由M堿基探針覆蓋，所述M堿基探針由單一 DNA堿基區分。圖4是測量mRNA轉錄本范圍的方法的簡圖。假定的mRNA轉錄本包括延伸相應預測的ORF的5’和3’的非編碼區。探針由破折號表示。在這個實施例中，ORF的左端(5’ ) 的三個探針和ORF的右端(3’ )的兩個探針將指示mRNA的轉錄本范圍。圖 5 是 C. phytofermentans 染色體的圖示。圖6是顯示Ikb基因組片段中GC含量作為隨C. phytofermentans基因組距離的函數的圖示。6個GC含量> 50%的基因組島被編號。這6個區構成總共16個11Λ區。圖7是基于16S rRNA基因序列梭狀芽胞桿菌類內的菌株C. phytofermentans和相關分類的鄰接樹。簇I包括引起疾病的梭狀芽胞桿菌，簇III包括可水解纖維素的梭狀芽胞桿菌，簇XIVa包括腸道微生物，以及梭菌屬中的宏基因組序列。節點上的數字是基于 1000個重復取樣數據庫的鄰接分析的自引支持度的水平(百分比)。Bacillus subtilis 被用作為外群體。條形，每個位置4個核苷酸取代。圖8是顯示Clostridium phytofermentans ISDg CDk在其它測序的梭狀芽胞桿菌類細菌基因組中的最好匹配(e值截止于0.01)的數值的環狀圖。圖9A和9B是顯示了使用BLASTP比較在不同生物中糖苷水解酶(GH)編碼基因 (9A)和所有基因(9B)的環狀圖。圖10是顯示了糖苷水解酶家族GH9域的分子系統發生的鄰接樹。圖11是顯示了糖苷水解酶家族GH5域的分子系統發生的鄰接樹。圖12是顯示了實施例假定水解酶的概略圖。一些水解酶可以是細胞外或膜結合的。GH 水解酶；CBM 碳水化合物結合域。圖13是C. phytofermentans中吸收和代謝戊糖的描述。圖14是C. phytofermentans中吸收和代謝巖藻糖的描述。圖15是C. phytofermentans中吸收和代謝鼠李糖的描述。圖16是C. phytofermentans中調節、吸收和代謝海帶多糖的描述。
圖17是C. phytofermentans中吸收和代謝纖維二糖的描述。圖18是ρ IMP-Cphy質粒圖的描述。圖 19 是 pCphyP;3510-3367 質粒圖的描述。
具體實施例方式本文公開的多個實施方式一般集中在制造重組微生物的組合物和方法，在多種發酵環境下培養時所述重組微生物能夠生產燃料。一般性地，重組微生物能夠有效地和穩定地生產燃料，如醇，和相關化合物，從而可以從相對低廉的天然生物質材料如纖維素中得到高產量燃料。在一些實施方式中，重組微生物可以有效地和穩定地催化低廉的天然生物質材料如木質纖維素的轉化，以生產糖類和多糖，和相關的化合物。目前，有少數幾項使用能夠生產燃料的重組生物的技術。許多技術通常具有導致低燃料產量、高耗費和不期望的副產品的問題。例如，一些已知技術使用玉米顆粒和其它谷類作為給料。但是，在谷物供應上競爭性飼料和食物需求以及價格可能最終限制從玉米和其它谷類生產乙醇的發展。其它給料來源包括木質纖維素，通過糖化作用和發酵其可以生產乙酉享(Lynd, L. R. , Cushman, J. H. , Nichols, R. J.禾口 Wyman, C. Ε. Fuel ethanol from cellulosic biomass, “ Science 251,1318-1323 (1991)) 由于木質纖維素是生物質的主要成分，也是地球上最豐富的生物材料，因此源自木質纖維生物質的燃料是可更新能源選擇，具有維持世界經濟、能源和環境的潛力。但是，常規的木質纖維素乙醇產品需要昂貴的和復雜的多步過程，包括木質纖維素材料的生產和用外源糖分解酶預處理木質纖維素材料、水解存在于預處理的生物質中的多糖，和己糖和戊糖的分離發酵。在一種實施方式中，本發明的方法和組合物包含遺傳性改良或制造微生物以提高一種或多種酶的酶活性，包括但不限于纖維素酶。這樣的改良的實施例包括修改內源核酸調控元件以增加一種或多種酶的表達(如將編碼目標酶的基因可操作地連接至強啟動子)，向微生物中引入額外的核酸分子拷貝以提供酶的增強的活性，將編碼一種或多種酶的基因可操作地連接至誘導型啟動子，或它們的組合。可以改良本發明的不同的微生物以提高一種或多種纖維素酶或與纖維素處理相關的酶的活性。纖維素酶的分類通常基于將形成具有相似或同樣活性的家族的酶集合，但不需要同樣的底物特異性。這些分類之一是CAZY系統(CAZY代表碳水化合物活性酶)， 例如，列有115種不同的糖苷水解酶(GH)，命名為GHl至GHl 15。每一種不同的蛋白家族通常具有相應的酶活性。本數據庫包括纖維素和半纖維素活性酶。此外，Clostridium phytofermentans 白勺 i角軍白勺■ @ 砠胃 M 3 1 www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/ entrez上獲得。通過提供使木質纖維素生物質可以在單一步驟中發酵成乙醇的方法和組合物，本文描述的一些實施方式簡化了木質纖維素乙醇生產的常規多步過程。這被認為是綜合生物過程(CBP)。由于CBP簡化了整個轉化過程，減少了成本和能源浪費，它被預示為唯一的經濟地和環境地可持續的纖維素乙醇生物過程。在一些實施方式中，提供用于有效的燃料生產系統的多核苷酸和表達盒。所述多核苷酸和表達盒可以用于制備轉化微生物的表達載體以賦予轉化的微生物能夠有效地生產極大數量的產物，如燃料。
在一些實施方式中，微生物的新陳代謝可以通過引入和表達多種基因而被改良。根據本發明的一些實施方式，重組微生物可以使用來自Clostridium phytofermentans (ISDgT，美國模式培養物保藏所700394T)的基因作為用于促進例如纖維素轉化成燃料如乙醇和氫的生物催化劑。在一些實施方式中，C. phytofermentans (美國模式培養物保藏所700394τ)可以根據培養的菌株ISDgT的表型和基因型特征來定義(Warnick等，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,52 :1155-60,2002)。Clostridium phytofermentans 白勺 i角軍白勺■ @ 胃 M 3 1 www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/ entrez上獲得。多個實施方式大體上涉及用于生產燃料和/或其它有用的有機產物的系統、方法和組合物，包括菌株ISDgT和/或源自菌株ISDgT或單獨分離的C. phytofermentans 種的任何其它菌株。可以使用標準的分類學因素對所述種進行定義(Mackebrandt和 Goebel，International Journal of Systematic Bacteriology, 44 :846-9，1994) 與模式株(ISDgT)相比，具有16s rRNA序列同源性值在97%和以上的菌株被認為是 C. phytofermentans菌株，除非顯示它們具有DNA重新組合值小于70%。相當多的證據存在顯示具有70%或以上的DNA重新組合值的微生物同樣具有至少96%的DNA序列一致性并共享限定種類的表型特征。C. phytofermentans菌株ISDgT的基因組序列分析表明存在大量可能涉及植物多糖發酵的機制和途徑的基因和遺傳基因座，導致該微生物不平常的發酵性質。基于上述分類學因素，C. phytofermentans種的所有菌株可能同樣具有所有、或近似所有的這些發酵性質。C. phytofermentans菌株可以是天然分離種或遺傳改良菌株。可以將不同表達載體引入宿主微生物中使得轉化的微生物可以在不同發酵條件下產生大量的燃料。可以將重組微生物改良使得當微生物被培養在包含例如纖維素的培養基上時穩定、高產量地生產燃料。C. phytofermentans,單獨或與一種或多種其它微生物的組合可以大規模地將纖維素生物質材料發酵成易燃的生物燃料，如乙醇、丙醇和/或氫(見如美國專利申請號 2007/0178569 ;Warnick 等，Int J Syst Evol Microbiol (2002), 52 1155-1160，每一篇的全部內容都通過引用的方式結合至本文)。本文所公開的多核苷酸、表達盒和表達載體可以與許多不同宿主微生物一起使用以生產燃料如乙醇和氫。例如，除了 Clostridium phytofermentans，水解纖維素的微生物如 Clostridium cellulovorans、Clostridium cellulolyticum、Clostridium thermocellum、 Clostridium josui、 Clostridium papyrosolvens、 Clostridium eellobioparum、Clostridium hungatei、Clostridium eellulosi> Clostridium stercorarium、Clostridium termitidis、Clostridium thermocopriae、Clostridium thermocellum、 Clostridium celerecrescens、 Clostridium polysaccharoIyticum> Clostridium populeti、 Clostridium lentocellum> Clostridium chartatabidum、 Clostridium aldrichii、Clostridium herbivorans、Acetivibrio cellulolyticus、 Bacteroides cellulosolvens、Caldicellulosiruptor saccharoIyticum> Ruminococcus albus、 Ruminococcus flavefaciens> Fibrobacter succinogenes、 Eubacterium cellulosolvens、Butyrivibrio fbrisolvens、Anaerocellum thermophilum 禾口 Halocella cellulolytica都是特別有希望的宿主，因為它們能夠水解纖維素。能夠使用的其它微生物包括，例如糖分角軍微生物，如 Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum 禾口 Thermo anaerobacterium saccharolyticum。其它潛在的宿主包括其它細菌、酵母、藻類、真菌和真核細胞。在多種實施方式中，本發明所公開的多核苷酸、表達盒和表達載體可以與 C. phytofermentans或其它梭菌屬的種一起使用以增加燃料如乙醇和氫的產量。如本領域技術人員將意識到的，生產能夠生產燃料的重組生物可以具有非常大的益處，特別是對于有效的、劃算的和對環境無破壞的燃料生產。例舉的實施方式下面的描述和實施例詳細描述本發明的一些實施方式。本領域技術人員將意識到它的范圍包括多種變化和改良。因此，優選的實施方式的描述不能被認為限定了本發明的范圍。本發明的多種實施方式提供了使用重組微生物生產燃料的益處。用于燃料生產最優化的多核苷酸、表達盒、表達載體和重組微生物根據本發明的一些實施方式而公開。水解酶本發明描述的一些實施方式涉及包含在C. phytofermentans中鑒定的編碼水解酶的核酸的多核苷酸、多核苷酸盒、表達盒、表達載體和微生物。一些實施方式涉及使用包含在C. phytofermentans中鑒定的編碼水解酶的核酸的多核苷酸、多核苷酸盒、表達盒、表達載體和微生物生產燃料的方法。使用編碼水解酶的核酸的優勢包括改進微生物水解多聚體如多糖和多肽的能力和性能。水解酶可以包括降解多聚體如二糖、三糖和多糖、多肽和蛋白的酶。多聚體同樣可以包括例如纖維素、半纖維素、膠質、木質素和蛋白聚糖。降解多糖的酶和酶活性的例子包括但不限于糖苷水解酶(GH)、糖基轉移酶(GT)、多糖裂解酶(PL)、碳水化合物酯酶(CE) 和包含碳水化合物結合模塊(CBM)的蛋白(可以在互聯網“cazy.org”上獲得；Coutinho， P. Μ.禾口 Henrissat，B. (1999)Carbohydrate-active enzymes :an integrated database approach。在"Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering，，中，H. J. Gilbert, G. Davies,B. Henrissat禾口B. Svensson, The Royal Society of Chemistry,劍橋，3-12頁)。在一些實施方式中，GH、GT、PL、CE和CMB可以是具有不同活性的單獨的酶。在其它實施方式中，GH、GT、PL、CE和CMB可以是具有具體催化活性的酶域。例如，具有多種活性的酶可以具有多種酶域，包括例如GH、GT、PL、CE和/或CBM催化域。0-糖基水解酶是廣泛分布的一組酶，水解兩個或多個碳水化合物之間、或碳水化合物和非碳水化合物部分之間的糖苷鍵。基于序列相似度的糖基水解酶分類系統已經導致鑒定 85 種不同家族 PUBMED :7624375, PUBMED :8535779, PUBMED。該分類可以在 CAZy (碳水化合物活性酶)網站PUBMED中獲得。由于蛋白折疊比它的序列更保守，一些家族可以以 “部族(clan)”分組。糖苷水解酶家族9包括具有幾種已知活性的酶，如內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。在C. phytofermentans中，典型的GH9纖維素酶是ABX43720。任何水解酶可以選自C. phytofermentans的注解的基因組中以在本發明的產物和方法中使用。例子包括如一種或多種內切葡聚糖酶、幾丁質酶、纖維二糖水解酶或內進行纖維素酶(在還原端或非還原端)。
此外，可以改良微生物如C. phytofermentans以改進一種或多種纖維素酶或水解酶的生產，或一種或多種這樣的酶可以在不同的宿主(如其它細菌或酵母)中異源表達。 對于異源表達，可以通過重組技術改良細菌或酵母(如Brat等，Appl. Env. Microbiol. 29 ； 75 :2304_2311，公開了 Saccharomyces cerevisiae 中木糖異構酶的表達)。可以采取其它改良以提高在本發明的重組微生物中的末端產物(如乙醇)產量。 例如，所述宿主可以進一步包括額外的異源DNA片段，其表達產物是涉及單糖和/或寡聚糖運輸至重組宿主的蛋白。同樣地，來自糖酵解途徑的額外的基因可以整合至宿主。在這樣的途徑中，可以提高乙醇生產速度。C. phytofermentans基因組的最顯著和意想不到的特征之一是編碼碳水化合物活性酶基因的數量和多樣性。這個多樣性在與C. phytofermentans相關的生物中是獨一無二的。表1說明了涉及其它生物的碳水化合物基因的多樣性。表1 碳水化合物活性基因數量和多樣性
權利要求
1.一種用于生物燃料生產的產物，包括木質纖維生物質、能夠直接水解和發酵所述生物質的微生物，其中所述微生物被改良以提高一種或多種纖維素酶的活性。
2.根據權利要求1所述的產物，其特征在于，所述微生物能夠直接發酵五碳糖和六碳 糖。
3.根據權利要求2所述的產物，其特征在于，所述微生物是細菌。
4.根據權利要求1所述的產物，其特征在于，所述微生物是梭菌屬的種。
5.根據權利要求1所述的產物，其特征在于，所述微生物是Clostridium phytofermentans0
6.根據權利要求1所述的產物，其特征在于，所述微生物是非重組體或重組體。
7.根據權利要求2所述的產物，其特征在于，所述微生物包含一種或多種能夠提高所述一種或多種纖維素酶活性的異源多核苷酸。
8.一種用于生物燃料生產的產物，包括含碳的生物質、能夠直接水解和發酵所述生物質的微生物，其中所述微生物被改良以提高一種或多種纖維素酶的活性。
9.根據權利要求8所述的產物，其特征在于，所述微生物能夠生產發酵終產物，其實質部分是乙醇。
10.根據權利要求8所述的產物，其特征在于，所述微生物能夠生產包括乳酸、乙酸和蟻酸的發酵終產物。
11.根據權利要求8所述的產物，其特征在于，所述微生物能夠吸收一種或多種復雜碳水化合物。
12.根據權利要求8所述的產物，其特征在于，所述生物質包含比單體碳水化合物更高濃度的寡聚碳水化合物。
13.根據權利要求8所述的產物，其特征在于，所述一種或多種纖維素酶選自由 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163 組成的組。
14.根據權利要求8所述的產物，其特征在于，所述一種或多種纖維素酶是Cphy3367。
15.用于生產生物燃料的方法，所述方法包括(a)用能夠直接水解和發酵含碳的生物質的微生物接觸含碳的生物質，其中所述微生物被改良以提高一種或多種纖維素酶的活性；以及(b)對所述水解和發酵給予足夠時間以生產生物燃料。
16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述一種或多種纖維素酶選自由 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163 組成的組。
17.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述微生物能夠吸收一種或多種復雜碳水化合物。
18.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物質包含比單體碳水化合物更高濃度的寡聚碳水化合物。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，所述水解產生比單體碳水化合物更高濃度的纖維二糖和/或更大的寡聚體。
20.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述一種或多種纖維素酶是Cphy3367。
21.根據SEQID NO 1的分離核苷酸。
全文摘要
本發明提供在微生物中改進產物生產的方法和組合物，所述產物如燃料產物如乙醇。更具體地，本文描述了用于利用在Clostridium phytofermentans中鑒定的基因改進乙醇生產的方法和組合物。
文檔編號C12P7/06GK102224249SQ200980138193
公開日2011年10月19日 申請日期2009年7月28日 優先權日2008年7月28日
發明者埃爾莎·珀蒂, 杰弗里·布蘭查德, 約翰·費伯爾, 蘇珊·萊申, 馬蒂亞斯·施馬利士 申請人:特瑞斯有限公司, 馬薩諸塞大學