專利名稱：：細胞系、復制狂犬病毒的方法及定量檢測該病毒的方法
技術領域：
：本發明涉及一種持久性細胞系、一種復制傳染性狂犬病毒的方法，以及利用該細胞系通過致細胞病變效應(CPE)定量檢測該病毒的方法，以及檢測狂犬病毒復制抑制物的方法。為了產生蛋白質和病毒抗原需要有存活的細胞。在目前的技術狀況下，當雙倍體細胞株或持久性細胞系適用于產生所需的蛋白質或病毒抗原時，就把它們用于這個目的。與雙倍體細胞株相比較，持久性細胞系具有表現出無限生長的優點，就是說它們是無限增殖化的。經過多次傳代，這種持久性細胞株表現出細胞和抗原復制的持久特性，因為在這方面，它們并不象雙倍體細胞株那樣發生細胞的分化。除了雙倍體細胞株的有限壽命(傳代數)之外，這些細胞株的另一個嚴重缺點在于，需要作為雙倍體細胞株原材料的器官、組織以及雞胚并不能足量和隨時供應。再者，原材料會潛在地和/或暗暗地受到污染(病毒、支體和細菌)，其結果是優化再現性抗原生產得不到保證。我們知道，狂犬病毒可以在衍生自多種種類的細胞培養物中進行復制，而有關致細胞病變效應的文獻非常少[Egert等人，病毒學記述33(1989)，353-358，Consales等人，病毒數學雜志27(1990)，227-286，Campbell和Charlton，見獸醫病毒學進展狂犬病Kluwer專業出版物，Boston，Dordrecht，倫敦，1988]。致細胞病變效應(CPE)是一種由病毒所決定的特異性細胞破壞(胞溶作用)，可以在光學顯微鏡下容易地進行檢測。不過，一般來說，在沒有任何CPE[Campbell和Charlton(1988)]或病毒決定的細胞病理變化下所進行的組織培養中，狂犬病毒復制僅僅是不規律的[Kaplan和Koprowski，狂犬病實驗室技術，第3版，世界衛生組織專著叢書23，日內瓦(1973)]或者僅僅是瞬間出現的[Smith等人，交叉病毒學8(1977)，92-99]，因此在使用這些細胞株時，并不能通過對CPE的評估來可靠地檢測狂犬病毒。因此本發明基于提供無這些缺點的持久性細胞系及方法的技術問題，換言之，其通常可以使傳染性狂犬病毒復制產量得以改善并出現CPE，可使用敏感性方式對其進行定量測定。可通過權利要求中的實施方案來解決該技術問題。我們驚奇地發現，在新型的持久性細胞系PH-2中，具有CPE的狂犬病毒的復制產量很高。來自不同病毒科的其它病毒種類(如微小RNA病毒、皰疹病毒、副黏液病毒、呼吸道腸道病毒和披膜病毒)也同樣可以在該細胞系中進行復制。該細胞系適用于病毒抗原的生產和病毒及抗體的檢測。特別令人驚奇的是，在該細胞系中進行復制時，屬于桿狀病毒的狂犬病毒總是產生CPE，因此該細胞系尤其適用于對狂犬病毒和(中性)狂犬病毒抗體的簡易檢測和定量測定。因此，本發明涉及持久性細胞系PH-2和由其衍生出的細胞系。該細胞系PH-2保藏于位于Braunschweig的DSMDeutscheSammlungfurMikroorganismen(德國微生物保藏所)，號碼為DSMACC2165。在優選的實施方案中，本發明涉及具有CPE的狂犬病毒的復制方法，包括用所要復制的病毒感染新型細胞系，在適宜的條件下進行溫育，當其達到足夠高的滴定度之后分離并提純病毒粒子。所使用的方法都是目前技術水平熟悉的，例如超離心法、超過濾法、層析法等等。可使用這些方法從由該方式所得到的病毒粒子中分離并提純出病毒抗原，然后進行化學或物理裂解。可以使用由該方式所得到的這些抗原來制備疫苗或用于診斷目的。在更為優選的實施方案中，本發明還涉及獲得狂犬病毒粒子的方法，包括在獲得病毒粒子之后，從病毒粒子中分離和提純病毒抗原。與使用目前技術水平所知道的細胞系相比，使用新型細胞系不僅可更有效地復制狂犬病毒并且能同時產生CPE，這使得用靈敏及簡易的方法來檢測樣品中的狂犬病毒并定量測定成為可能。而另外的優選實施方案涉及一種根據CPE來檢測狂犬病毒的方法，其包括將新型細胞系與懷疑含有待檢測狂犬病毒的樣品相接觸，將細胞溫育，通過在顯微鏡下測定CPE來檢測所復制的病毒。為了實施該方法，例如可將病毒樣品加入到種植在微滴平皿或其它細胞培養器皿(均為本領域技術人員所熟知的)上的細胞培養物中，可以擱置至實驗最后或在與細胞培養基一起經一定吸附時間之后去除并用新鮮細胞培養基來代替。接種之后通過光學顯微鏡對該細胞培養物進行定時的CPE檢測，如可在第5天至第7天時。在更為優選的實施方案中，同目前使用的方法[熒光抗體技術(FITC)]相比較，新型檢測方法的檢測靈敏性約高出1個log10階。除此之外，還可以通過新型細胞系來確定病毒復制的抑制物。這些抑制物在病毒復制的所有階段都是有活性的－吸附/滲透、病毒核酸脫殼、轉錄和轉譯以及翻譯后的蛋白質修飾、病毒組裝和出芽。在本說明書中，抑制物例如可以是中和抗體、抗病毒及細胞受體的化學或是生物性配體、化學治療劑或干擾素或其它細胞分裂素。可通過所要求的細胞系中CPE缺乏來容易地檢測出對病毒復制的抑制。本領域技術人員知道如何進行檢測抑制作用的實驗。因此，本發明還涉及一種狂犬病毒復制抑制物的檢測方法，其包括在存在抑制物的情況下，通過CPE的缺乏來檢測新型細胞系中病毒復制的抑制作用。下述實施例將闡述本發明。實施例1獲得PH-2細胞系為了開發出持久性細胞系PH-2，將初生馬皮細胞與少量持久性猴腎細胞(VeroM，其同時已在實驗室中進行過復制)相摻混。當該過程實施時，在形態上與Vero細胞有所區別的細胞令人驚奇地過度生長出了馬皮成纖維細胞。分離這些細胞并命名為PH-2細胞。表1將PH-2細胞同VeroM細胞的染色體組型分析進行了比較。PH-2細胞在其染色體組和染色體分布模式上同VeroM細胞都有所不同。表1</tables>狂犬病毒PH-2細胞系中進行復制，同時產生CPE，而在起始細胞系(Vero)中并非如此。實施例2在雞成纖維細胞培養物(標準方法)和PH-2細胞培養物中進行狂犬病毒、FluryLEP株(ATCCVR-138)的比較滴定。得到作為BehringwerkeAG標準產物的病毒(其已在雞成纖維細胞培養物中進行過復制)。在進行病毒滴定24小時之前，依據本方案在微滴定平皿上種植雞成纖維細胞。在開始滴定之前立刻將PH-2細胞保持于微滴定平皿中。對雞成纖維細胞而言，種植細胞用的培養基為3號培養基，含有1％的胎牛血清(FCS)和NSP，而對PH-2細胞來說則是EME培養基和2％的FCS及NSP。在3號培養基中以log10階對狂犬病毒進行稀釋。在每次稀釋步驟中，在8個對應培養物類型的小格中接種200μl的稀釋液/小格。然后在37℃下在CO2恒溫箱中對培養物進行溫育。對雞成纖維細胞培養物而言，在開始測試的第3-5天中讀滴定值，一旦FITC標記的抗體把細胞染色(熒光法)。對PH-2培養物而言，根據由狂犬病毒所引起的CPE，在開始測試的第5-7天中進行顯微鏡讀數。通過Karber方法來計算滴定度。比較滴定的結果見下表2。表2</tables>從比較性研究可以清楚地看出，與雞成纖維細胞的滴定度相比較，通過顯微鏡檢測所測定的PH-2細胞的滴定度平均要高出1個log10階。它說明，除了極大地簡化了檢測狂犬病毒的程序之外，同目前
技術領域：
所用的檢測方法相比，本方法的靈敏度更高。實施例3狂犬病毒在PH-2細胞中的復制(復制曲線)在將培養基換成無血清的EME培養基之后，對在Roux皿上濃密生長過的PH-2細胞用狂犬病毒以0.01的感染復數進行感染并在37℃下溫育。在如表3所示的時間間隔之后從所感染的Roux皿中取出樣品，測定所感染的病毒粒子含量。所得到的數值如下列表3所示。表3</tables>從表3的數值可清楚地看出，狂犬病毒在PH-2細胞系中可復制成高滴定度。這個細胞系因此非常適合產生狂犬病毒抗原。實施例4在不同代的PH-2中測試狂犬病毒的繁殖能力用相同的狂犬病毒制劑(FluryLEP株)來測定PH-2細胞在第36、85和100代時的滴定度。下列表4包括實驗的結果。表4</tables>n.i.＝未調查從上表的結果可以清楚地看出，在所測試的傳代范圍中(即第36和100代之間)，PH-2細胞系對狂犬病毒的敏感性保持不變。權利要求1.名稱為PH-2(保藏號DSMACC2165)的一種持久性細胞系，或由其衍生的細胞系。2.一種復制具有致細胞病變效應(CPE)的狂犬病毒的方法，其包括a)用所要復制的病毒感染如權利要求1中所述的細胞系；b)對細胞進行溫育；和c)當其達到足夠高的滴定度之后分離并提純病毒粒子。3.如權利要求2中所要求的方法，其中，在步驟c)之后，再從病毒粒子中分離出病毒抗原并提純。4.根據由權利要求1中所要求的細胞系中復制病毒所造成的致細胞病變效應來檢測狂犬病毒的方法，其包括a)將細胞系與懷疑含有待檢測狂犬病毒的樣品相接觸；b)將細胞溫育；c)在開始溫育之后，通過在顯微鏡下測定因病毒感染所造成的CPE來檢測病毒。5.如權利要求4所要求的方法，其中，同熒光抗體技術(FITC)相比較，檢測靈敏性約高出1個log10階。6.一種檢測狂犬病毒復制抑制物的方法，其包括在存在抑制物的情況下，通過CPE的缺乏來檢測細胞系中病毒復制的抑制作用。全文摘要本發明涉及由vero－M細胞系衍生的持久性細胞系。該細胞系能用于復制具有致細胞病變效應(CPE)的狂犬病毒和通過CPE靈敏檢測狂犬病毒。除了利用該細胞系復制和檢測狂犬病毒之外,本發明還涉及檢測狂犬病毒復制抑制物的方法,所述抑制物例如是中和抗體或抗病毒受體的配體。文檔編號C12N7/00GK1180376SQ96193034公開日1998年4月29日申請日期1996年1月30日優先權日1996年1月30日發明者D·伯恩哈特,A·格羅納申請人:柏林魏克股份公司