專利名稱：：來自逆轉錄病毒調節蛋白的無毒免疫原、抗體、其制備方法和含有它們的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及利用逆轉錄病毒調節蛋白的新逆轉錄病毒免疫原，所述調節蛋白的基本生物特性已預先滅活而保留或提高其免疫原性；其制備方法和含有它們的藥物組合物。這些新的“無活性”免疫原用于在人體誘導主動免疫，以預防或校正作為該免疫原來源之天然蛋白可產生的失調。同樣，本發明還涉及通過使用這些“無活性”免疫原而獲得的新抗體，其制備方法和含有它們的用于被動免疫的藥物組合物。Tat分子是一種在病毒顆粒中找不到而由HIV-1基因組編碼的HIV調節蛋白。在感染細胞內，這種由原病毒DNA編碼的蛋白起病毒或細胞基因的反式激活蛋白的作用。但這種基因調節蛋白也可以存在于細胞外循環介質中，死亡細胞碎片中排泄的原始狀態的蛋白或片段，或者由分泌過程中排出。其在循環介質中的存在解釋了某些陽性血清主體中可檢測到抗Tat抗體的存在。這種Tat處于細胞外的情況下，該分子帶有細胞表面整聯蛋白可識別的RGD殘基的C-末端片段和堿性區域(45-70殘基)將使其象細菌毒素造成的那樣作用于許多組織的非感染細胞。這樣，作為真正病毒毒素的循環Tat蛋白可對內皮細胞產生毒性，與生長因子BFGF結合參與卡波濟肉瘤的新血管生成，后者構成艾滋病的特征。循環Tat蛋白還可以加重免疫抑制(其在艾滋病中逐步發展)，這是通過對T細胞的直接免疫抑制作用或使抗原遞呈細胞(稱為APC)(巨噬細胞或樹枝狀細胞)生產α干擾素失調而產生的。獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)在臨床上定義為由免疫抑制產生的機會性疾病或卡波濟肉瘤。獲得性免疫缺陷在HIV感染過程中逐步發展，其生物學表現為T細胞在先用應答抗原、再用同種抗原、最后用促細胞分裂原(PHA)刺激后免疫反應活性的喪失(白細胞郁滯和IL-2產量降低)。這種免疫抑制與α和γ干擾素的過量產生有關。導致免疫抑制的細胞致病機制很復雜，涉及許多病毒來源的因子，它們直接作用于免疫細胞，T淋巴細胞和APC，或通過細胞因子網間接作用。例如HIV-1顆粒攜帶的gp120包膜蛋白(其在細胞外的存在通過血清病毒數量測定)所直接引起CD4表型T細胞的無應性。以循環病毒毒素的細胞外形式存在的HIV調節蛋白(特別是Tat)，似乎也引起T細胞的直接免疫抑制或其他致病作用，因為例如在體外被應答抗原或被抗CD3抗體激活的T細胞在Tat分子存在下不再增殖。另外，循環Tat蛋白似有助于APC過量產生可加重艾滋病中見到的免疫抑制和編程性細胞死亡的α干擾素、細胞生長抑制性細胞因子和apoptogene。實際上，在Tat存在下α干擾素的分泌似不再被反向調節(返饋)中止，該反向調節正常狀態下控制α干擾素的產生(耐受期)。卡波濟肉瘤的臨床表現是出現血管結節，這代表從內皮細胞形成的新血管生成。被產生細胞因子(γ干擾素，IL1和IL6)的炎性過程所激活的細胞產生BFGF(堿性成纖維細胞生長因子)并增殖。激活的內皮細胞體外在Tat蛋白培養基中增殖加快。抗Tat抗體體外阻滯Tat蛋白的增殖作用。Tat與粘附表面帶有整聯蛋白家族的內皮細胞的作用，通過這些分子識別的RGD序列的存在得以說明。新血管形成是體內卡波濟肉瘤形成的基礎，細胞外形式的Tat調節蛋白應對其形成有利，而Tat由于其含RGD序列的C末端片段而可被皮內細胞的整聯蛋白所識別。另外，Tat還可以通過其富K和R殘基的堿性區作用，從而易于與細胞外基質的硫酸肝素相結合，這使生長激素BFGF的濃度升高。因而這些生長因子誘導的內皮細胞增殖在Tat存在下加快，并引起新血管生成。對內皮細胞生長的這種影響在體外被抗Tat抗體的作用所減小。因此希望阻滯真正病毒毒素-細胞外介質(血液、淋巴、間隙液)中的逆轉錄病毒調節蛋白，特別是循環Tat的有害活性。關于HIV病毒，迄今人們已進行了利用這些病毒的結構蛋白或其片段免疫接種的努力，但從來沒有用過這些病毒的調節蛋白或調節蛋白片段。但現令人驚異地發現，就象細菌毒素(破傷風、白喉或肉毒桿菌毒素)的毒性被特異抗體中和一樣，病毒調節蛋白特別是Tat(細胞外形式的HIV真正毒素)的有害作用(它們引起T細胞免疫抑制、APC生成α干擾素的失調或作為卡波濟肉瘤基礎的新血管生成)，如在下述實驗部分將看到的，在抗Tat特異抗體存在下被消除。病毒如HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2的其他調節蛋白情況相同。因而為了治療和預防目的希望擁有可用于人體的能夠產生這種抗體的免疫原以及擁有這種抗體。實際上，用作免疫原的現有枝術化合物可能對人體有毒(見例如WO-A-9118454)，特別是帶有堿性區域的那些。這主要涉及“天然”Tat、Nef或Rev的未修飾片段，相反，本發明基于這些蛋白或蛋白片段的滅活。因而本發明的目標是無毒可用于人體的免疫原性化合物，其特征在于它們是經諸如醛的偶聯劑，或經一種醛(優選甲醛或戊二醛)預處理而活化的載體蛋白進行化學處理從HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的調節蛋白衍生而來，使其能被針對所述調節蛋白的抗體所識別并保留足以激發中和或封阻所述天然蛋白的抗體的免疫原性，而喪失了所述天然蛋白的至少50％、特別是至少80％、尤其是95％以上的毒性生物特性。與諸如破傷風類毒素的細菌毒素類似，這些化合物以下將被稱為“類毒素”。實際上，就象經典細菌類毒素一樣，它們失去了特有的毒性，但在給予主體時卻能夠刺激免疫。以下的化學處理可以輔以一種物理處理，例如照射，特別是紫外照射，以降低本發明免疫原性化合物的殘余毒性。上述類毒素例如可以從一種其序列與一種調節蛋白(如Tat)的肽序列相同或相似的肽制備，可以通過例如樹脂上的常規肽合成或通過基因工程而獲得。所有這些方法都是現有技術中熟知的。為了證實按本發明修飾的調節蛋白或其修飾片段確實能被針對所述天然調節蛋白的抗體所識別，如下文實驗部分將看到的，可以通過ELISA檢測特異抗體存在下抗原-抗體復合物的形成。為了確實是否保留了足以刺激中和天然蛋白的抗體的調節蛋白免疫原性，例如可以用本發明的免疫原性化合物免疫哺乳動物(兔、大鼠、小鼠)并驗證所產生的抗體中和調節蛋白的毒性，正如在實驗部分將看到的Tat的情形。為了證實修飾的調節蛋白是否已喪失了其至少50％的毒性生物特性，例如可以研究滅活調節蛋白如Tat對T細胞免疫抑制的作用、或對活性外周血中單核細胞產生α干擾素的作用，或對調節蛋白誘導的新血管生成的作用。Tat調節蛋白的滅活例如通過“Tat援救試驗”來驗證，用Tat缺陷型非感染性HIV變體在HLM-1細胞系上培養，其復制依賴于外源天然Tat的存在。該免疫原性化合物可衍生自病毒HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2的任何調節蛋白，特別是病毒HIV-1和HIV-2的Vif、Rev、Nef和Tat；特別是Rev、Nef和Tat，更特別是Rev和Tat，優選Tat。還可以指出HTLV-1或HTLV-2的Tax蛋白。還可以具體提及堿性區以外的Tat和Rev區域，即Tat中49-57區之外的和Rev中35-50區之外的，或與這些區域至多4個氨基酸(優選至多2個氨基酸)重疊的區域，特別是肽HQVSLSKQPTSQPRGD。從病毒HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2的調節蛋白“衍生”，應理解為免疫原性化合物可由調節蛋白的全部或一個片段構成，并且該蛋白或片段的氨基酸中可有一個或多個修飾如缺失、取代、插入，或官能化如氨基酸的酰化，只要這些修飾保持在如上指明的范疇內(無毒性，免疫特征)。例如，一般用異亮氨酸殘基取代亮氨酸殘基不會改變這些性質；在至少8個氨基酸(尤其是至少12個氨基酸)的調節蛋白同源鏈節上，這些修飾一般應涉及30％以下的氨基酸，優選20％以下，尤其是10％以下。一個片段可含例如8-60個氨基酸，優選12-40個氨基酸，特別是25-40個氨基酸。例如可提及HIV-1Tat(末端的65-80殘基的片段。在優選條件下，本發明的免疫原性化合物含有整個調節蛋白的至少50％，優選至少70％，特別是至少90％，尤其是所述蛋白的全部或幾乎全部。一般而言，關于修飾，修飾后的免疫原與天然蛋白或蛋白片段間的同源性或相似性，以及免疫原性化合物的長度，還有使用模式、本發明免疫原性化合物與諸如破傷風類毒素的免疫原性蛋白的偶聯方法，都可參見WO-A-86/06414，EP-A-0220273或PCT/US86/00831(等價)，其中內容引入此處作為參考。本發明的免疫原性化合物可以如下使用通過例如皮下或肌內途徑給予需要治療的主體以治療有效量的本發明的免疫原性化合物。給藥劑量可為例如皮下100-1000μg，每月一次共三個月，然后根據所誘發的血清抗體率周期性給藥，例如2-6個月一次。本發明的組合物可經常規用于疫苗領域的任何途徑給藥，特別是皮下、肌肉、靜脈內或口服途徑。可以以單一劑量給藥，或在一定時間間隔后重復一次或多次。因此，本發明還涉及治療或預防性組合物，其特征在于其含有作為活性成分的如上定義的免疫原性化合物。這種免疫原性化合物可單獨使用或與藥物可接受的賦形劑如佐劑混合使用。本發明還涉及藥物，其特征在于它們由如上定義的免疫原性化合物所組成，即上述免疫原性化合物用于治療人體或動物的方法中；以及這種免疫原性化合物在制備用于治療或預防上述調節蛋白(尤其是Tat)有害作用的治療或預防性藥物中的用途。實際上，本發明的化合物已失去其毒性，因而可用于人體，如將在實驗部分所見。給予本發明的免疫原性化合物相當于主動免疫治療。同樣有意義的是進行被動免疫治療，即直接向病人提供其所需抗體，以中和HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的有害作用。這些抗調節蛋白的抗體可以按常規方法獲得，例如用上述定義的免疫原性化合物接種哺乳動物(人或動物)，通過被F-B病毒轉化的人B淋巴細胞的克隆，然后收獲所述轉化B淋巴細胞分泌的目標抗體，或通過從噬菌體文庫開始的基因重組。因此，本申請還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白抗體(特別是抗Tat類毒素的抗體)的制備方法，尤其是制備上述抗體的方法，其特征在于用如上所定義的免疫原性化合物接種哺乳動物。本發明還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的抗體，特別是通過實施上述方法從免疫接種的人或哺乳動物主體獲得的多克隆或單克隆抗體。這些特異抗體可以來自1.主體自身，通過用生物失活但有免疫原性的調節蛋白(特別是Tat)主動免疫(接種)而誘生。這種免疫原性化合物，如Tat的情況，類似于細菌類毒素，稱為Tat類毒素。2.或者同種或異種的其他生物體，通過被動免疫(血清治療)給予主體。同種抗體(對人體)可通過用免疫原性蛋白或本發明的衍生物、特別是Tat(本發明的Tat-類毒素或Tat肽片段)主動免疫(接種)未感染的自愿主體后產生。這些或同種(人的)或異種(動物的)的被動給予的抗體可以是完整單克隆或多克隆抗體或抗體的F(ah’)2或Fab片段。“抗調節蛋白的抗體”應理解為單克隆或多克隆抗體或這些抗體的F(ab’)2或Fab片段，或從噬菌體文庫基因構建而獲得的抗調節蛋白的抗體。源自人的同種抗體為-多克隆的，可以在用本發明免疫原性化合物、特別是Tat類毒素或Tat肽片段免疫的血清陰性自愿個體中獲得；-或者單克隆的，來自免疫個體的EB病毒轉化的B細胞特異克隆(特異EBV-B細胞系)。異種抗體來自用本發明免疫原性化合物、特別是Tat或其衍生物(本發明的無毒性Tat類毒素，Tat肽處段)超免疫的動物，并且是來自超免疫動物的多克隆抗體，-或者單克隆抗體，按Kohler和Milstein的技術將脾細胞或腺細胞與x63型(特別是x63AG3型)細胞系雜交后獲得。此處優選馬抗體或兔抗體。本申請還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白抗體的制備方法，其特征在于用如上所定義的免疫原性化合物免疫一種哺乳動物(人或動物)。本發明還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于使用來自用本發明免疫原性化合物免疫個體的B細胞，所述B細胞已用EB病毒轉化并產生抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的特異抗體。可培養上述EBV+細胞以產生所需抗體。如人們所見，這些細胞尤其來自被天然調節蛋白或被本發明免疫原性化合物免疫的病人。本申請還涉及抗滅活或未滅活HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的本發明單克隆抗體的制備方法，其特征在于按現有技術中熟知的方法(Kohler和Milstein)用特別是被天然調節蛋白或本發明免疫原性化合物免疫之小鼠的脾細胞或腺細胞和骨髓瘤細胞(優選x63細胞系)制備哺乳動物(特別是小鼠)的雜交瘤。本申請還涉及通過基因重組技術獲得抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白抗體的方法，其特征在于使用如上定義的免疫原性化合物作為免疫原。本申請還涉及所述抗體的F(ab’)2或Fab片段，它們可通過例如酶消化而獲得。本發明還涉及被動免疫HIV病毒感染主體的方法，其中使用抗HIV病毒復制調節蛋白、更具體為抗Tat的、中和或阻滯該蛋白細胞外形式之有害作用的、如上所述制備的特異抗體，或這些抗體的F(ab’)2或F(ab)片段。本申請還涉及抗HIV或艾滋病的主動免疫方法，其中使用如上所述的免疫原性化合物，結合HIV病毒的一種結構蛋白，特別是gp120或gp160包膜糖蛋白或其修飾或未修飾的肽片段，或滅活的HIV病毒，或例如通過堿水解基因組RNA被耗竭的HIV病毒。本發明還涉及抗HIV或艾滋病的主動免疫方法，其中使用如上所述的免疫原性化合物，結合基于滅活細胞因子(更精確地講為α干擾素、βTGF或TNF)的一種或多種免疫原。實際上，如在實驗部分將看到的，本發明抗調節蛋白抗體和抗特別是α-干擾素抗體之效果的結合，可完全恢復HIV誘導的免疫抑制。因而本發明還涉及一種含兩種免疫原性化合物的組合物，即如上所述的免疫原性化合物和能夠誘導抗細胞因子(如α干擾素或TNF)抗體的免疫原性化合物(如WO-A-9118454中所述)，以及含有抗細胞因子(特別是α-干擾素)的抗體及以上抗調節蛋白抗體的組合物。本申請還涉及一種主動免疫方法，其特征在于用與無機、油性或合成的免疫佐劑結合的如上所定義的免疫原性化合物作為免疫原，或與一種提高其免疫原性的蛋白偶聯或結合的如上所述免疫原性化合物作為免疫原。這種免疫可用于治療或預防目的。用于上述或下述方法中的免疫原，優選使用Tat蛋白的衍生物。本發明還涉及HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2血清陰性或血清陽性主體的超免疫方法，其特征在于使用如上所定義的免疫原產生超免疫人血清，后者特別可用于被動血清治療，給予純化的特異抗體或其F(ab’)2或Fab片段。另外，本發明還涉及含有如上所定義的或按上述方法獲得的至少一種抗病毒調節蛋白抗體作為治療或預防活性成分的藥物組合物。本發明最后涉及上述免疫原性化合物或抗體在制備用于治療HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白有害作用的藥物中的用途。綜上所述，本發明涉及特異抗體在ARC/艾滋病血清陽性主體或患者上的預防或治療作用，以阻滯HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白(特別是循環Tat)的有害作用。這些特異抗體可來自1.主體自身，通過用生物滅活但有免疫原性的Tat(類似于細菌類毒素，稱為Tat類毒素)主動免疫(接種)而誘導產生，或2.同種或異種的其他生物體，給予主體進行被動免疫(血清治療)。同種抗體(對人體)可用調節蛋白如Tat或其衍生物(本發明的Tat類毒素或Tat肽片段)主動免疫(接種)后在未感染自愿個體中產生。這些同種(人的)或異種(動物的)的被動給予的抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，或抗體的F(ab’)2或Fab片段。如上文所指出的那樣，Tat類毒素應理解為用化學試劑處理過的Tat肽或蛋白。這種處理已使該分子喪失循環Tat的毒性生物特性(T細胞的免疫抑制；誘導產干擾素的細胞產生α-干擾素；內皮細胞的新血管生成；阻礙干擾素對巨噬細胞的抗病毒作用)，但保留了當以適當方式遞呈和制備、與“載體”偶聯或不偶聯、聚合或不聚合、存在或不存在佐劑時能夠誘導抗體生成的特性。已將Tat類毒素這一術語擴展到Tat免疫原性肽片段，即當以適當方式遞呈、與載體偶聯或否、佐劑存在或否時能夠誘導抗Tat抗體生成的Tat肽序列。本發明還涉及藥物組合物。a)一種含有本發明病毒類毒素或調節蛋白(特別是Tat)的片段或類似物作為預防或治療成分的藥物組合物。b)一種含有按本發明從Tat蛋白或其(Fab’)2或Fab片段免疫的生物體產生的抗Tat抗體作為預防或治療成分的藥物組合物。另外，本發明還提供含有一種疫苗藥物組合物的試劑盒，其中除活性成分(Tat類毒素或其衍生物或抗Tat抗體)外還可含有佐劑和/或另一具有抗逆轉錄病毒特性的免疫原。最后，本發明提供一種常規制劑形式的藥物組合物。特別是將治療有效量的本發明活性成分與藥物可接受的稀釋劑或載體結合。實驗1循環Tat蛋白的致病作用Tat存在下T細胞的免疫抑制研究了Tat對外周血活化的T淋巴細胞的作用。用免疫磁分離法分離的單核細胞(PMBC)和T淋巴細胞(HLA35DR-)在有或無Tat分子存在下用抗CD3抗體活化。培養5天后，通過攝入的3H胸苷測定了細胞增殖。結果顯示Tat抑制HLADR-T細胞的增殖(1.5μg/ml濃度下抑制85％)。在抗Tat特異抗體(Intracel，英國)存在下這種抑制消失。實驗2循環Tat蛋白的致病作用Tat存在下對干擾素對巨噬細胞作用的抑制用VSV病毒在MDBK細胞中的細胞致病能力按常規生物試驗測定了Tat對α干擾素抗病毒作用的影響。Tat對外源干擾素的影響從低濃度開始遞增劑量的Tat按Tat濃度1-20μg/ml間的劑量效應曲線抑制外源干擾素的抗病毒能力。在一代表性的實驗中，α干擾素直至1/4800稀釋度的顯著保護作用(相當于150U.I)在10μg/mlTat濃度下被降至1/300稀釋度。因此在10μg/mlTat濃度和4800外源干擾素稀釋度下，VSV的滴度從103.8(無Tat干擾素樣品)升至105.5(有Tat的干擾素樣品)。這些實驗中，Tat分子對α干擾素抗病毒作用的抑制在抗Tat特異抗體(Intracel，英國)存在下被消除，同樣被我們制備的馬抗體(見以下實施例)消除。實驗3在HIV-1感染主體中體現Tat蛋白的細胞外形式血清陽性病人血清中抗Tat抗體的存在a)在50個血清陽性和15個血清陰性主體中用天然Tat分子作為抗原進行血清抗Tat抗體的ELISA研究。所有血清陰性主體血清和20個血清陽性血清沒有顯示抗Tat抗體的存在，光密度小于閾值(O.D.＝0.250)。30個HIV感染主體的血清超過了閾值，其中6個O.D大于0.500。在抗Tat抗體的存在與臨床狀態及每毫升血中CD4細胞的數目間沒有發現任何顯著相關性。b)在HIV感染不同階段的血清陽性主體(無癥狀主體)，具有艾滋病前(ARC)臨床癥狀的病人和患艾滋病病人中，用各種Tat肽作為抗原進行血清抗Tat抗體的ELISA研究。該研究的結果如下1)Tat的肽序列MEPVDPRLEPWKHPG(N末端1-15殘基)HQVSLSKQPTSQPRGD(C末端65-80殘基)被大部分血清陽性血清而不被任何血清陰性的血清(對照)所識別。這些反應為強陽性，但沒能顯示與主體HIV感染的發展和CD4數目的任何相關性。2)所研究的其他序列不被無論是血清陽性或對照個體的血清顯著識別(見表1)。每個序列只有極個別血清顯示大于閾值(對照血清平均值的2倍)的光密度。表1*HIV感染主體的感染階段各異無癥狀主體、ARC患者和艾滋病患者。**當光密度為血清陰性平均值的2倍以上時認為反應為陽性。3)有趣的是注意到最強反應性序列(AA65-80)是含有被整聯蛋白識別的RGD殘基的序列。實施例1免疫原性Tat蛋白(Tat類毒素)的制備Tat蛋白在甲醛存在下的滅活向70mM磷酸氫二鈉(pH8.0)中的Tat溶液(1mg/ml)中加入終濃度為33mM的甲醛。將混合物37℃溫育1、3、5、7和9天。在每一溫育期未取樣，加入終濃度為100mM的甘氯酸終止與甲醛的反應。每個樣品對100倍體積的PBS(磷酸鹽水緩沖液)4℃透析一夜。實施例2免疫原性Tat蛋白(Tat類毒素)的制備Tat蛋白在戊二醛存在下的滅活向70mM磷酸氨二鈉(pH8.2)中的Tat溶液(1mg/ml)中加入終濃度為0.026M或0.0026M的戊二醛。讓與戊二醛的反應持續1分鐘到3小時的不同時間。在所選反應時間后，在實驗室溫度下，加入終濃度100mM的甘氨酸終止該反應。各個樣品對100倍體積的PBS4℃透析16小時。實施例3免疫原性Tat蛋白(Tat類毒素)的制備Tat滅活同時與破傷風毒素偶聯向70mM-100mM磷酸鹽緩沖液(pH在6.8-8.2之間)中的破傷風毒素與Tat的摩爾比1-15的混合物中，加入終濃度為0.0026M-0.026M的戊二醛，讓該滅活及偶聯反應在室溫下進行不同的時間(3-15分鐘)。加入終濃度為100mM的甘氨酸終止反應，各個樣品對100倍體積的PBS4℃透析16小時。實施例4Tat類毒素的致免疫能力和抗原性小鼠中的免疫原性Tat類毒素ELISA測定抗體在小鼠體內測定了不同滅活Tat制劑的致免疫能力甲醛滅活(Tat類毒素)、戊二醛滅活(Tat-polan)、或與破傷風毒素偶聯后(Tat-TT偶聯物)，即實施例1-3的免疫原性化合物。皮下注射配有福氏完全佐劑的實施例1、2和3的免疫原2次，免疫18-20g的瑞士小鼠，第二次注射在第1次之后3周進行，注射存在福氏不完全佐劑的20μg乳液制劑。加強注射后15天，通過心內途徑采取血樣。用ELISA方法測定血清中抗-Tat的抗體。490nm測定光密度。結果列于表2中，其表明除用戊二醛短時間(3分鐘)處理的Tat-破傷風毒素偶聯物外，所有Tat制劑具有不同程度的免疫原性，前者顯示毒性，在24小時內毒死小鼠(破作風毒素滅活太弱)。應指明的是未免疫小鼠的血清對天然Tat和對Tat類毒素的應答低于0.200(O.D.)。另外，這些結果表明，天然Tat以與類毒素同樣的方式被抗體識別，這證實了它們的抗原性等價，也證明了可以用Tat類毒素進行免疫。表2</tables>實施例5急性毒性通過給18-20g的瑞士小鼠皮下注射，測定了Tat類毒素和Tat-polan制劑的毒性。Tat-類毒素(7天)和Tat-polan(15分鐘；0.026M)制劑以100μg劑量給予小鼠。觀察動物7天。沒有觀察到任何明顯的毒性跡象。動物體積繼續增長。尸解后的器官經放大鏡檢查沒發現異常。實施例6抗Tat抗體按如下制備抗Tat抗體在G蛋白柱上以Tat-polan免疫的小鼠血清分離了IgG成分。還通過胃蛋白酶消化從分離的IgG成分制備了F(ab’)2片段。這些成分的免疫反應性已用ELISA進行了驗證。實施例7Tat類毒素的生物失活在依賴于HIV-1“長末端重復序列”(LTR)的氯霉素乙酰轉移酶(CAT)報道基因的表達活性實驗中，測試了滅活1、3、5和9天的實施例1中不同的Tat類毒素。該實驗的要點如下將帶有HIVLTR控制下之CAT基因的Hela細胞與天然Tat或類毒素接觸6小時。培養24小時后，裂解細胞，用CAT活性實驗測定了所產CAT的量，其中測定連結于氯霉素上的乙酰輔酶A的百分比。如果Tat分子是活性的，將有很高百分比的乙酰化氯霉素，否則該百分率將低。按標準方法在含10％FCS的RPMI培養基中培養這些粘附細胞。效應劑量曲線中，所加Tat的濃度為每ml上清液1-10μg。此處所示結果表明Tat類毒素在3天后完全失活，在第一天有弱的殘余活性。</tables>實施例8Tat類毒素致病作用喪失a)Tat類毒素存在下無T細胞的免疫抑制(與實驗1和2相反)。研究了Tat類毒素(5天)對外周血激活的T淋巴細胞的作用。用免疫磁分離方法分離的單核細胞(PMBC)和T淋巴細胞(HLA35DR-)在有或無實施例1的免疫原性化合物存在下用抗CD3抗體活化。培養5天后，按3H胸苷的攝入測定了細胞增殖。結果顯示，與天然Tat不同，Tat類毒素不抑制HLADR-T細胞的增殖。例如，Tat類毒素在培養液中以5μg/ml劑量存在下，細胞增殖與對照細胞相同。b)Tat類毒素存在下不抑制α干擾素對巨噬細胞的作用用VSV病毒在MDBK細胞中的細胞致病能力按常規生物試驗測定了Tat類毒素對α干擾素抗病毒作用的影響。Tat類毒素對外源干擾素的影響與天然Tat不同，相當劑量的實施例1Tat類毒素沒有抑制外源干擾素的抗病毒能力。在一代表性的實驗中，α干擾素直至1/4800稀釋度(相當于150U.I)的顯著保護作用在50μgTat類毒素存在下仍保持，而被天然Tat降至1/300。在4800外源干擾素稀釋度下，VSV滴度保持在103.8的對照水平(用Tat類毒素的干擾素樣品)，而不是升至105.5(存在Tat的干擾素樣品)。實施例9抗Tat-類毒素抗體針對天然Tat作用的保護作用在超免疫的馬中制備了抗實施例1的Tat類毒素(甲醛處理3天)的抗體。按實施例6描述的方法，還從這些抗體制備了F(ab’)2片段。這些抗體及F(ab’)2片段在不同的試驗中抑制天然Tat的各種生物活性HIVLTR的反式激活(CAT試驗)(見實施例7)，免疫抑制(見實驗1)，對外源α干擾素對培養物作用的抑制(見實驗2)。以40μg抗體/1μg天然Tat的劑量，天然Tat與抗體或F(ab’)2片段37℃預培養1小時或否，用天然Tat重復實驗1、2和實施例7。結果顯示這些抗體抑制天然Tat的作用。實施例10由于抗Tat抗體和抗α-干擾素抗體的結合，細胞增殖系統恢復抗Tat抗體與抗α干擾素抗體的協同作用。觀察到健康主體的PBL(外周血單核細胞)在體外用HIV-1感染并培養6天后發揮免疫抑制活性。實際上如果向葡萄球菌外毒素B蛋白(SEB)活化的自體細胞中以1比5的比例加入這種感染6天的細胞或非感染/照射細胞，發現在第4天末自體細胞的增殖與對照(未感染細胞)相比降低80％。在此模型中，如果體外向感染細胞培養物中加入抗α干擾素抗體，在50％主體中這些細胞喪失其抑制作用。20％的主體中，抑制性細胞喪失其60％的抑制作用，30％的主體中，這種抑制作用顯著保持。如果向抗α干擾素抗體中加入抗Tat抗體(實驗1中描述的單克隆抗體，或實施例9的馬的多克隆抗體)，則100％的體外感染細胞喪失其抑制作用。這些實驗證明Tat和α干擾素在HIV-1誘發的免疫抑制中的聯合毒性作用，而抗干擾素抗體和抗Tat抗體結合可恢復正常的免疫。實施例11HIV-1感染病人的免疫接種CD4淋巴細胞率為250-500的6名志愿病人用實施例2制備的Tat-polan(15分鐘)免疫。為此，他們以一月的間隔接受3次肌內起始注射Tat類毒素(400μg/次)，第6個月加強注射一次。用于這些注射的佐劑為磷酸鈣。表中列出了接種前后個體中觀察到的應答(第一次注射后7個月)。這些結果表明，由于用實施例1的Tat類毒素接種，抗天然Tat的抗體應答明顯提高，CD4淋巴細胞率在此期間保持穩定。該1期試驗表明用Tat類毒素接種的無毒特性，并證實了其免疫原性。特別是，病人的生物常數特別是CD4表型保持穩定。實施例12制備免疫原性Nef蛋白(Nef類毒素)Nef蛋白在甲醛存在下的滅活向70mM磷酸氫二鈉(pH8.0)中的Nef溶液(1g/ml)中加入終濃度為33mM的甲醛。將混合物37℃溫育1、3、5、7和9天。在每一溫育期末取樣，加入終濃度為100mM的甘氨酸終止與甲醛的反應。每個樣品對100倍體積的PBS(磷酸鹽水緩沖液)4℃透析一夜，并分離Nef類毒素。實施例13免疫原性Nef蛋白(Nefpolan)的制備Nef蛋白在戊二醛存在下的滅活向70mM磷酸氫二鈉(pH8.2)中的Nef溶液(1mg/ml)中加入終濃度為0.026M或0.0026M的戊二醛。讓與戊二醛的反應持續1分鐘到3小時的不同時間。在所述反應時間后、在實驗室溫度下，加入終濃度100mM的甘氨酸終止該反應。各個樣品對100倍體積的PBS4℃透析16小時，分離Nef-polan。實施例14Nef類毒素的致免疫能力和抗原性小鼠中的免疫原性Nef類毒素ELISA測定抗體在小鼠體內測定了不同滅活Nef制劑的致免疫能力甲醛滅活(Nef類毒素)或戊二醛滅活(Nef-polan)，即實施例12和13的免疫原性化合物。皮下注射配有福氏完全佐劑的實施例12和13的免疫原2次，免疫18-20g的瑞士小鼠，第二次注射在第1次之后3周進行，注射存在福氏不完全佐劑的20μg乳液制劑。加強注射后15天，通過心內途徑采取血樣。用ELISA方法測定血清中抗Nef的抗體。在490nm測定光密度。結果列于下表中，其表明所有Nef制劑具有不同程度的免疫原性。應指明的是未免疫小鼠的血清在ELISA試驗中的應答低于0.2(O.D.)。這些結果表明，天然Nef以與類毒素同樣的方式被抗體識別，這證實了它們的抗原性等價，也證明了可以用Nef類毒素進行免疫。>序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱NEOVACS(B)街道VieilleduTemple大街117號(C)城市巴黎(E)國家法國(F)郵編75003(ii)發明名稱新免疫原、新抗體、其制備方法和含有它們的藥物組合物(iii)序列數1(iv)計算機可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，#1.25版(EPO)(2)SEQIDNo.1的信息(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數單鏈(D)構型線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNo.1HisGlnValSerLeuSerLysGlnProThrSerGlnProArgGlyAsp15101權利要求1.一種無毒可用于人體的免疫原性化合物，其特征在于它是經諸如醛的偶聯劑，或經一種醛預處理而活化的載體蛋白進行化學處理從HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的調節蛋白衍生而來，使其能被針對所述調節蛋白的抗體所識別并保留足以激發能中和或封阻所述天然蛋白的抗體的免疫原性，而喪失了所述天然蛋白的至少50％的毒性生物特性。2.根據權利要求1的免疫原性化合物，其特征在于它衍生自HIV-1或HIV-2病毒的下列調節蛋白Ner、Tat、Vif或Rev。3.根據權利要求2的免疫原性化合物，其特征在于它衍生自Tat蛋白。4.根據權利要求2的免疫原性化合物，其特征在于它衍生自HTLV-1或HTLV-2病毒的Tax蛋白。5.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權利要求1-4之一所定義的免疫原性化合物。6.如權利要求1-4之一所定義的免疫原性化合物用于人或動物體的治療方法中。7.如權利要求1-4中之一所定義的免疫原性化合物的制備方法，其特征在于將HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的一種調節蛋白用一種醛進行化學處理，篩選，然后純化目標化合物。8.根據權利要求7的化合物，其特征在于化學處理包括用一種醛處理，然后與一種載體蛋白偶聯。9.抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白之抗體的制備方法，其特征在于用如權利要求1-4之一定義的免疫原性化合物免疫哺乳動物。10.抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白之抗體的制備方法，其特征在于進行EB病毒轉化的B淋巴細胞的克隆，然后收獲從所述轉化B淋巴細胞分泌的目標抗體。11.抗HIV-1或HIV-2病毒Tat蛋白之抗體的制備方法，其特征在于進行EB病毒轉化的B淋巴細胞的克隆，然后收獲從所述轉化B淋巴細胞分泌的目標抗體。12.抗HTLV-1或HTLV-2病毒Tax蛋白之抗體的制備方法，其特征在于進行EB病毒轉化的B淋巴細胞的克隆，然后收獲從所述轉化B淋巴細胞分泌的目標抗體。13.抗HIV-1、HIV-2、HTIV-1或HTLV-2病毒調節蛋白之抗體的制備方法，其特征在于從一種噬菌體文庫經基因重組制備所述抗體。14.如權利要求9-13之一制備的一種抗體的F(ab’)2或F(ab)片段的制備方法，其特征在于對這種抗體進行酶消化。15.用如權利要求1-4之一定義的免疫原性化合物免疫哺乳動物所獲得的抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的抗體。16.權利要求15所定義抗體的F(ab’)2或F(ab)片段。17.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權利要求15或16定義的抗體。18.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權利要求1-5之一定義的免疫原性化合物，并結合有HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的Gag、Pol或Env蛋白。19.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權利要求1-5之一定義的免疫原性化合物，并結合有天然的或經物理、化學、遺傳或免疫處理滅活的gp120/gp160蛋白，或該蛋白的修飾或未修飾的肽片段。20.具有下式HQVSLSKQPTSQPRGD或MEPVDPRLEPWKHPG或相應于用醛滅活后HIV-1或HIV-2的天然Tat的免疫原性化合物。21.含有下列成分的疫苗組合物-如權利要求1-4之一定義的免疫原性化合物，-一種如下免疫原性化合物不同與其天然形式且失活的細胞因子，或細胞因子的無活性類似物、或無活性或失活的片段。22.含有下列成分的組合物-抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調節蛋白的抗體，-諸如抗人α干擾素抗體的一種抗細胞因子抗體。全文摘要一種無毒可用于人體的免疫原性化合物,其特征在于它是經諸如醛的偶聯劑,或經一種醛預處理而活化的載體蛋白進行化學處理從HIV－1、HIV－2、HTLV－1或HTLV－2病毒的調節蛋白衍生而來,使其能被針對所述調節蛋白的抗體所識別并保留足以激發中和或封阻所述天然蛋白之抗體的免疫原性,而喪失了所述天然蛋白的至少50%的毒性生物特性。文檔編號C12N15/09GK1181020SQ9619319公開日1998年5月6日申請日期1996年3月7日優先權日1995年3月8日發明者J·F·薩古里,B·比茲尼,D·薩古里申請人:新疫苗公司