纖溶活性化合物fgfc1的分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種從發酵液中分離純化FGFC1的方法。所述方法包括步驟：（1）將FGFC1菌絲體和堿性水溶液混合、抽提，得到抽提液；（2）將抽提液和有機溶劑混合后上柱經大孔聚合物填料層析，用有機溶劑與水的堿性混合溶液洗脫，得到FGFC1餾分。
【專利說明】纖溶活性化合物FGFC1的分離純化方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及發酵液的分離純化，尤其涉及一種從發酵液中分離純化FGFCl的方 法。

【背景技術】
[0002] FGFCl是一種具有纖溶活性的微生物天然產物，由海洋真菌長孢葡萄穗霉 Stachybotrys longispora FG216(CCTCC NO. C22010068)發酵產生，活性研究表明，其具有 促進纖溶酶原和單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑相互活化的作用，有望開發成為藥物，具有 良好的應用前景。
[0003] 現有文獻報道的分離純化方法為：
[0004] 甲醇抽提發酵液后用HPLC分離制備，具體工藝如下：FGFCl發酵液與等體積甲醇 混合，超聲15min，在轉速IOOOOrpm條件下離心15min，所得上清液減壓濃縮、真空干燥得到 含有FGFCl的干固物，而后用少量甲醇溶解，溶解后的溶液用半制備型高效液相色譜儀，色 譜柱Sepax HP-C18柱（21. 2mmX 250mm, 10 μ m)分離，色譜條件為：流動相：A相：0· 05M乙酸 銨；B相：甲醇；A :B=30 :70。洗脫條件為：流速10ml/mim，進樣量為0. 5ml，檢測波長265nm。
[0005] 該方法存在以下不足：
[0006] (1)用甲醇進行抽提，成本較高；且甲醇具有一定毒性；
[0007] (2)使用粒徑為10 μ m的反相C18填料進行層析，屬于高壓色譜，對設備要求較高； 層析填料化學穩定性差，不耐酸堿，易污染。層析流動相中含有無機鹽乙酸銨，給FCFGl的 后續精制過程增加了難度。
[0008] 綜上所述，該方法不適于規模化的制備FGFCl。
[0009] 因此，本領域迫切需要提供一種從海洋真菌長孢葡萄穗霉Stachybotrys longispora FG216 (CCTCC NO. C22010068)的發酵液中分離純化纖溶活性化合物FGFCl的 方法。


【發明內容】

[0010] 本發明旨在提供一種從發酵液中分離純化FGFCl的方法。
[0011] 本發明提供了一種從發酵液中分離純化FGFCl的方法，所述方法包括步驟：
[0012] (1)將FGFCl菌絲體和堿性水溶液混合、抽提，固液分離后得到抽提液；和
[0013] (2)將抽提液和有機溶劑混合后上柱經大孔聚合物填料層析，用有機溶劑與水的 堿性混合溶液洗脫，得到FGFCl餾分。
[0014] 在另一優選例中，所述大孔聚合物填料為非極性大孔聚合物填料。
[0015] 在另一優選例中，所述的非極性聚合物填料的骨架選自聚苯乙烯-二乙烯苯或甲 基丙烯酸酯；更優選聚苯乙烯-二乙烯苯。
[0016] 在另一優選例中，所述大孔聚合物填料粒徑為30-200 μ m ;更優選30-150 μ m。
[0017] 在另一優選例中，步驟（1)中所述堿性水溶液為可溶性無機堿的水溶液；更優選， 所述可溶性無機堿的水溶液選自氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液。
[0018] 在另一優選例中，步驟（1)中所述堿性水溶液的pH為8-14 ;更優選為PH11-13。
[0019] 在另一優選例中，步驟（2)中以所述有機溶劑與水的堿性混合溶液的總體積計，其 中含有有機溶劑20-80% ;更優選為30-60%。
[0020] 在另一優選例中，以抽提液和有機溶劑的混合溶液的總體積計，其中含有有機溶 劑5-35% ;更優選為15-30%。
[0021] 在另一優選例中，步驟（2)中所述抽提液和有機溶劑的混合溶液的pH為4-12 ;更 優選pH為6. 5。
[0022] 在另一優選例中，所述方法還包括步驟：經HPLC測定后，將HPLC峰純度> 95%的 FGFCl餾分進行收集，得到FGFCl的純化液。
[0023] 在另一優選例中，所述方法還包括步驟：將收集得到的FGFCl的HPLC純度大于等 于95%的餾分，通過減壓蒸發去除有機溶劑得到水溶液，所得水溶液冷凍干燥后得到FGFCl 的干粉。
[0024] 在另一優選例中，所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮或乙腈；更優選乙 醇。
[0025] 據此，本發明提供了一種從海洋真菌長孢葡萄穗霉Stachybotrys Iongispora FG216 (CCTCC NO. C22010068)的發酵液中分離純化纖溶活性化合物FGFCl的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1顯示了實施例制備得到的FGFCl的MS圖譜。

【具體實施方式】
[0027] 發明人經過廣泛而深入的研究，驚奇地發現將FGFCl發酵液的菌絲體經過堿性水 溶液抽提、大孔聚合物填料層析，可簡單有效地得到高純度的FGFCl。
[0028] 如本文所用，"FGFC1"是指分子式為C51H68N 2Oltl的物質，其結構式為：
[0029]

【權利要求】
1. 一種從發酵液中分離純化FGFC1的方法，其特征在于，所述方法包括步驟： (1) 將FGFC1菌絲體和堿性水溶液混合、抽提，固液分離后得到抽提液； (2) 將抽提液和有機溶劑混合后上柱經大孔聚合物填料層析，用有機溶劑與水的堿性 混合溶液洗脫，得到FGFC1餾分。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料為非極性大孔聚合物 填料。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的非極性聚合物填料的骨架選自聚苯 乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸酯；優選聚苯乙烯-二乙烯苯。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料粒徑為30-200 y m ;優 選 30-150 u m。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述堿性水溶液為可溶性無機堿 的水溶液。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述可溶性無機堿的水溶液選自氫氧化鈉 水溶液或氫氧化鉀水溶液。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述堿性水溶液的pH為8-14 ; 優選 pHll-13。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中以所述有機溶劑與水的堿性混合 溶液的總體積計，其中含有有機溶劑20-80 % ;優選30-60 %。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，以抽提液和有機溶劑的混合溶液的總體積 計，其中含有有機溶劑5-35% ;優選15-30%。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽提液和有機溶劑的混合溶液的pH為 4-12 ;優選 pH 為 6. 5。
11. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟：將HPLC峰純度 彡95%的FGFC1餾分進行收集，得到FGFC1的純化液。
12. 如權利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、異 丙醇、丙酮或乙腈；優選乙醇。
【文檔編號】C07D519/00GK104418868SQ201310379733
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月27日
【發明者】劉永雙, 那可, 趙文杰, 趙波, 馬川川, 魏曉東, 張守雨 申請人:上海醫藥工業研究院, 中國醫藥工業研究總院