專利名稱：一種莪術醇的微生物轉化產物及其用途和制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，確切地說它是一種莪術醇的微生物轉化產物及其醫藥用途和制備方法。

背景技術：
病毒作為一種致病源，一直以來都是藥物研究工作者的關注對象。由于其對宿主細胞的侵染性強，破壞不可逆轉并且難以徹底消滅，對人類健康造成了嚴重的威脅。莪術為姜科多年生草本，亦稱“蓬莪術”、“山姜黃”，根莖入中藥。綱目名蓬莪茂，列入草部芳香部。本品為植物蓬莪術Curcuma phaeocaulisValeton、廣西莪術Curcuma kwangsiensis S.G..Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，自古就被認為有行氣破血、消積止痛的功效，用于治療淤血經閉、食積脹痛等癥。近年研究發現其揮發油具有抗病毒功用，莪術靜脈注射液對呼吸道合胞病毒(RSV)有直接滅活作用。(鄭企靜，復方莪術注射液治療嬰幼兒病毒肺炎的試驗和臨床研究。友誼醫刊，1986，19(3)88-92)。研究表明莪術靜脈注射液治療幼兒RSV肺炎有較好療效且無副作用，其機理包括(1)抑制病毒作用；(2)改善肺部微循環；(3)減輕支氣管的高過敏反應(閻田玉，莪術靜脈注射液治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎及其作用原理。中國中西醫結合雜志，1992，12(12)711-715)。莪術醇為莪術揮發油中主要有效成份之一，對病毒有明顯的滅活作用，但其缺點在于水溶性很差，難以制成良好的藥物劑型，而且具有一定的毒性，LD50為250mg/kg(遼寧中醫學院醫學系腫瘤組，溫莪術有效成分抗腫瘤作用的實驗研究。新醫藥學雜志，1976，17(12)28-32)。因此一直以來未被開發為臨床用藥。
所謂微生物轉化反應就是利用微生物代謝過程中某個或一組酶對底物進行催化的反應。具有高度立體選擇性，不僅對結構有化學選擇性和非對映異構體選擇性，并且有嚴格的區域選擇性、面選擇性和對映異構體選擇性。而且反應條件溫和，公害少，成本低廉。對中藥成分生物轉化進行研究，其主要目的就是通過對中藥有效成分在微生物體內的轉化產物的研究來尋找新藥源，以及對新活性成分的發現、新前體物質的制備，都有著極其重要的意義。


發明內容
本發明的目的是尋找較莪術醇更加高效低毒，具有較好水溶性，更適合藥物制劑的有效化合物一種莪術醇的微生物轉化產物及其醫藥用途和制備方法。本試驗使用黑曲霉(AS 3.739)對莪術醇進行了微生物轉化反應，獲得了一種具有抗病毒活性的新化合物--3β羥基莪術醇，該化合物為莪術醇在黑曲霉作用下的主要轉化產物，收率約為26％。
本發明中轉化產物可以由以下方式得到 a)微生物的培養將微生物從固體培養基接種至預先配置好的液體土豆培養基(含2％葡萄糖)中，置于恒溫振蕩器中于180rpm，25C條件下培養兩日。
b)加入底物將底物溶于適量丙酮中，配成10mg/ml丙酮溶液。加入已培養2日的微生物發酵液中，在相同條件下繼續培養5日。
c)發酵液的處理發酵液抽濾后收集濾液，在減壓條件下低溫濃縮至小體積，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏。
d)轉化產物的分離純化將步驟c)得到的粗浸膏用硅膠柱層析分離，以環己烷∶丙酮梯度洗脫(100，50∶1，25∶1，20∶1，10∶1，5∶1)。在10∶1洗脫部分得到無色結晶即為所需轉化產物。其純度經薄層色譜和高效液相色譜(檢測器UV、RID)檢測達到99.1％(見附圖1和2) 轉化產物為(1)
所示的-3β-羥基莪術醇化合物。
所述轉化產物為-3β-羥基莪術醇化合物可用于制備抗病毒藥物。
利用微生物黑曲霉(AS3.739)對底物莪術醇進行生物轉化，并利用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取、利用硅膠柱層析法進行轉化產物的分離制備。
所制得的轉化產物，其純度根據薄層色譜和高效液相色譜檢測可達到99％以上。
該化合物具有以下理化數據colorless needles；[α]25D＝-49.4 (c 0.13，MeOH)；HRMScalcd for C15H25O3[M+H]+，253.1798，found 253.1795；IR νmax(KBr)3433，3073，2968，1646，1460，1367，1333，1281，1131，1053，989，893，799，613cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.87(d，J＝6.5Hz，3H，H-13)，1.00(d，J＝6.4Hz，3H，H-12)，1.10(d，J＝7.0Hz，3H，H-15)，1.25(q，J＝6.7Hz，1H，H-6β)，1.45(m，J＝6.8Hz，1H，H-7)，1.62(o，1H，H-2a)，1.71(o，1H，H-11)，1.80(o，1H，H-4)，2.15(t，J＝12.3Hz，1H，H-6α)，2.18(o，1H，H-2b)，2.49(t，J＝14.6Hz，1H，H-9a)，2.51(o，1H，H-1)，2.55(t，J＝14.9Hz，1H，H-9b)，4.11(t，J＝6.5Hz，1H，H-3)，4.91(t，J＝3.0Hz，2H，H-14).13C NMR(CDCl3，100MHz)δ10.1(C-15)，21.4(C-12)，23.0(C-13)，28.5(C-11)，35.0(C-6)，38.5(C-9)，38.9(C-2)，49.4(C-4)，51.7(C-1)，56.2(C-7)，79.3(C-3)，88.1(C-5)，104.6(C-8)，113.6(C-14)，143.4(C-10).(見附圖2) 經實驗證實該化合物具有顯著的抗病毒活性。可望制備抗病毒藥物。



圖1為莪術醇轉化產物正相高效薄層色譜圖。(薄層條件正相高效薄層板，展開條件環己烷∶丙酮(2∶1)，顯色條件10％H2SO4) 圖2為莪術醇轉化產物反相高效薄層色譜圖。
圖3為莪術醇轉化產物高效液相色譜分析圖(紫外檢測器)(分析色譜柱VP-ODS；流動相50％MeOH；流速1ml/min) 圖4為莪術醇轉化產物高效液相色譜分析圖(示差檢測器)(分析色譜柱VP-ODS；流動相50％MeOH；流速Iml/min)
具體實施例方式 實施例1取底物莪術醇500mg，溶解后加入已培養2日的微生物發酵液中，繼續培養5日后取下搖瓶。發酵液抽濾除去菌絲體，合并濾液，濃縮至小體積，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，得1.2g粗浸膏。將該浸膏用甲醇溶解，拌入3g100-140目硅膠，揮發溶劑至于，待上樣。取50g200-300目硅膠，濕法裝柱，然后加入處理好的樣品，進行柱層析。用環己烷∶丙酮梯度洗脫(100，50∶1，25∶1，20∶1，10∶1，5∶1)。在10∶1洗脫部分獲得無色結晶130mg(收率為26％)，即為轉化產物。
試驗例1本發明轉化產物的體外抗病毒試驗 用Hela細胞接種于96孔培養板內，待細胞長成單層。
(1)細胞毒性試驗將莪術醇和轉化產物分別稀釋為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml.等濃度，將上述用培養液稀釋好的不同濃度的藥品滴加于Hela單層細胞上，每孔0.2ml，37℃5％CO2孵箱培養，每天鏡下觀察細胞病變(CPE)，求出藥液致細胞毒性，計算藥物對細胞毒性濃度。結果表明莪術醇在25μg/ml及以上稀釋的各濃度對Hela細胞無毒性作用；轉化產物在50μg/ml及以上稀釋的各濃度對Hela細胞無毒性作用。
(2)藥物對病毒致細胞病變作用的影響在Hela細胞上分別加入6種病毒液(流感病毒FM1株，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒3型(AdV-III)，柯薩奇病毒B3(CVB3)株，副流感病毒，單純皰疹病毒I型(HSV-I)SM44株)在37℃吸附1h后洗去病毒液，加入無毒界限藥液(莪術醇25μg/ml、轉化產物50μg/ml、病毒唑62.5μg/ml)，同時設病毒對照，細胞對照。置37℃ CO2培養箱內培養，每天在倒置顯微鏡下觀察病變，連續7d，記錄各孔病變情況。結果表明轉化產物在體外有較好的抑制抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒III型和單純皰疹病毒I型的致細胞病變作用，如下表所示 表1莪術醇及其轉化產物對病毒致細胞病變作用的影響 病毒株 流感病毒 副流感病毒 CVB5RSV AdVIII HSV-I 感染量3050 莪術醇+±++±++ 轉化產物± -+-±± 病毒唑± -±-±- 細胞對照- --- --病毒對照++++++++++++ ++++++++ ++++ (注-示無細胞病變；±示有延緩細胞病變作用；+示1/4以下的細胞病變；++示1/4～1/2的細胞有病變；+++示1/2～3/4的細胞有病變；++++示3/4以上的細胞有病變。) 體外抗病毒試驗結果表明轉化產物較底物莪術醇的毒性降低了一倍，在相同毒性條件下，轉化產物的抗病毒活性較強，和陽性對照藥病毒唑基本相當。
試驗例2本發明轉化產物在小鼠體內抗RSV病毒試驗 取昆明種小鼠95只，雌雄各半，隨機分為4組A組22只，RSV感染(感染組)；B組23只，RSV感染后，腹腔注射乙醇異丙醇溶液(1∶10)(對照組)；C組25只，RSV感染后，腹腔注射轉化產物的乙醇異丙醇溶液(1mg/ml)(治療組)；D組25只，RSV感染后，腹腔注射病毒唑水溶液(1mg/ml)(藥物對照組)。小鼠經戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經鼻腔滴入1∶5稀釋的RSV懸液0.2ml，4h后，B組給以乙醇異丙醇溶液0.5ml/只；C組給以藥液0.5ml/只；D組給以病毒唑0.5ml/只。每日一次，7日為一療程，分別于5、8天將鼠處死，無菌取肺，用于RSV分離。
表2感染RSV病毒5、8天鼠肺RSV分離陽性率比較 組別 鼠數5天鼠數8天感染數感染率％感染數感染率％感染組對照組治療組 藥物對照組 11 11 12 10041.733.3 11 12 13 91.723.123.1 經X2檢驗，治療組與感染組及對照組之間有較顯著差異(5天P＜0.001，8天P＜0.0001)，而與藥物對照組的感染率接近(P＞0.05)，該結果表明轉化產物在動物模型體內具有抑制RSV病毒作用。
試驗例3本發明轉化產物在小鼠體內抗副流感病毒試驗 取昆明種小鼠70只，雌雄各半，隨機分為5組，每組14只。A組副流感病毒感染(感染組)；B組副流感病毒感染后，腹腔注射乙醇異丙醇溶液(1∶10)(對照組)；C組副流感病毒感染后，腹腔注射轉化產物的乙醇異丙醇溶液(1mg/ml)(治療組)；D組副流感病毒感染后，腹腔注射病毒唑水溶液(1mg/ml)(藥物對照組)；E組不感染病毒，腹腔注射乙醇異丙醇溶液(陰性對照組)。小鼠經戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經鼻腔滴入未稀釋的病毒液0.05ml，1h后，B組給以乙醇異丙醇溶液0.5ml/只；C組給以藥液0.5ml/只；D組給以病毒唑0.5ml/只；E組不感染病毒，給以乙醇異丙醇溶液0.5ml/只。每日一次，7日為一療程，連續觀察14天，記錄小鼠死亡情況。
表3感染副流感病毒14天后小鼠的死亡情況組別鼠數死亡數死亡率(％)感染組對照組100治療組 藥物對照組 陰性對照組.414.30 經X2檢驗，治療組與感染組及對照組之間有較顯著差異(P＜0.0001)，而與藥物對照組的死亡率接近(P＞0.05)，該結果表明轉化產物在動物模型體內具有抑制副流感病毒作用。
實施例3 取3β羥基莪術醇50g，加入淀粉細粉160g，用等量遞增法混勻，用80％的乙醇，制成顆粒，干燥，整粒，混勻，加入化石粉4g，硬脂酸鎂1.6g壓片即得(1000片)，每日兩次，每次一片。
實施例4 取3β羥基莪術醇100g，加入淀粉細粉200g，化石粉10g，硬脂酸鎂5g，制成顆粒，干燥，裝入膠囊(2000粒)，每日兩次，每次一粒。
實施例5 取3β羥基莪術醇50g，微晶纖維素250g，交聯聚乙烯吡咯烷酮70g，混勻，加入適量乙醇制粒，干燥、整粒，在加入羧甲基淀粉鈉8g，硬脂酸鎂4g，混勻，壓片(1000片)，每日兩次，每次一片。
權利要求
1、一種莪術醇的微生物轉化產物，其特征在于轉化產物為(1)
所示的3β-羥基莪術醇化合物。
2、根劇權力要求1所述的一種莪術醇的微生物轉化產物，其特征在于所述轉化產物3β-羥基莪術醇化合物可用于制備抗病毒藥物。
3、一種如權力要求1所述的莪術醇的微生物轉化產物的制備方法，其特征在于利用微生物黑曲霉(AS3.739)對底物莪術醇進行生物轉化，并利用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取、利用硅膠柱層析法進行轉化產物的分離制備。
4、據權利要求3所述的莪術醇的微生物轉化產物的制備方法，其特征在于所制得的轉化產物，其純度根據薄層色譜和高效液相色譜檢測可達到99％以上。
全文摘要
本發明公開了一種莪術醇的微生物轉化產物及其用途和制備方法。轉化產物為3β－羥基莪術醇化合物。所述轉化產物3β－羥基莪術醇化合物可用于制備抗病毒藥物。利用微生物黑曲霉(AS3.739)對底物莪術醇進行生物轉化，并利用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取、利用硅膠柱層析法進行轉化產物的分離制備。所制得的轉化產物，其純度根據薄層色譜和高效液相色譜檢測可達到99％以上。
文檔編號C07D493/08GK1680568SQ20051004577
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月26日 優先權日2005年1月26日
發明者邱峰, 姚新生, 張卉, 曲戈霞 申請人:沈陽藥科大學