轉基因馬鈴薯av43-6-g7品系鑒定的引物、探針和方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于轉基因產品檢測鑒定技術，具體地說是使用實時熒光PCR技術進行轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系鑒定的方法。
【背景技術】
[0002]自從轉基因番茄首次被批準于1994年，數量和生產轉基因(GM)作物的不斷增加。按照國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)，轉基因品種已經被廣泛開發與應用。為保護消費者的知情權，許多國家都制定立法，以確定轉基因生物成分的閾值水平。用于混合在飼料轉基因生物和食品的閾值水平在歐盟為0.9%，在韓國3%，在日本，1%。為了符合轉基因生物標識管理規定，并保證產品的合法性和可追溯性，轉基因產品的品系檢測方法是轉基因識別和量化是必不可少的。
[0003]馬鈴薯是最早研究成功轉基因植物之一。基因轉移技術在馬鈴薯應用的主要目的包括改善土豆的質量，增強抗病蟲害等。1997年之前，孟山都公司在美國開發了抗鞘翅目害蟲和馬鈴薯卷葉病毒的轉基因馬鈴薯。近來，越來越商業化轉基因馬鈴薯的特征集中在提高馬鈴薯淀粉特性，如轉基因馬鈴薯Amflora轉基因土豆AM04-1020。這些轉基因馬鈴薯生產通過基因編碼的顆粒結合淀粉合成酶I (GBSSI)的反義抑制直鏈淀粉的淀粉生成。這些改進的功能將被用在造紙和紡織技術方面和食品工業中。轉基因馬鈴薯性狀AV43-6-G7在這項研究中是一個淀粉改良的轉基因馬鈴薯品系，其目的是用于淀粉分離的淀粉產業和淀粉可經歷進一步的處理。
【發明內容】
[0004]本發明測定了轉基因馬鈴薯AV43-6-G7外源基因片段的側翼序列。并根據所確定的序列信息設計了一對引物和Taqman探針以檢測外源基因片段和馬鈴薯內源基因的交界區域。建立了一個特異性檢測轉鑒定基因馬鈴薯AV43-6-G7品系的方法。
[0005]所述引物序列是:
上游引物 Potato AV43-6-G7 primerF:5，-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3，；
下游引物 Potato AV43-6-G7 primerR:5，-tgtcgtgccagctgcatta- ‘3;
探針 Potato AV43-6-G7 Probe:5，-FAM- cccgcgcgttggccgat-3’ BHQ。
[0006]轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系鑒定鑒定方法包括產品DNA的提取、特異性基因的實時熒光PCR擴增和使用熒光定量PCR儀隨機軟件分析擴增結果并進行結果判定。
[0007]本發明涉及的轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系鑒定，其中的試劑包括如下:
(l)PCR擴增反應液A
包括1XPCR Master Mix(內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP),400 nmol/L上下游引物；
上游引物 Potato AV43-6-G7 primerFC5?-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3?)，下游引物 Potato AV43-6-G7 primerR (5，-tgtcgtgccagctgcatta- ‘3)，探針 Potato AV43-6-G7Probe (5，_FAM_ cccgcgcgttggccgat-3? BHQ)
其中上游引物、下游引物和探針比例:2:2:1 ;
其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP: dATP: dGTP: dCTP =
1:1:1:1ο
[0008](2)陽性對照DNA
上面所述PCR擴增反應液A，每管24 μ L的最佳組成為:1XPCR Master Mix(內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400 nmol/L上、下游引物，200nmol/L探針。
[0009]使用上述方法鑒定轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系，依次包括下列步驟(1) - (3):
(1)待檢樣品DNA的提取
DNA提取可使用CTAB法。
[0010](2)轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系來源基因的實時熒光PCR擴增
A.在裝有24PL PCR擴增反應液A的反應管中加入WL待檢樣品DNA，混勻。
[0011]B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
95 °C 15min，1個循環預變性；
95°C 15sec,59°C lmin，40 個循環。
[0012](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定擴增曲線的Ct值。
[0013]有PCR擴增曲線且Ct值彡38判定為檢出，無PCR擴增曲線或者PCR擴增曲線但有Ct值>38判定為未檢出。
[0014]本發明的有益效果:
本發明的優點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低。
【附圖說明】
[0015]圖1是轉基因品系AV43-6-G7馬鈴薯粉的熒光PCR圖譜。
[0016]圖2是50%濃度轉基因品系AV43-6-G7馬鈴薯粉的熒光PCR圖譜。
[0017]圖3是轉基因AV43-6-G7品系馬鈴薯粉濃度梯度樣品的熒光PCR圖譜。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0020]實施例1
按下述方法檢測轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系的馬鈴薯塊莖粉做用作陽性對照。使用98140轉基因玉米粉、DAS-40278-9轉基因玉米粉、305423轉基因大豆粉、M0N87701轉基因大豆粉、M0N87708轉基因大豆粉、3218轉基因大豆粉、PH05轉基因馬鈴薯粉、AM04轉基因馬鈴薯粉、非轉基因大豆粉、非轉基因馬鈴薯粉和非轉基因玉米粉作為實驗的陰性對照:包括1XPCR Master Mix(內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP),400 nmol/L上下游引物；
上游引物 Potato AV43-6-G7 primerF(5，-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3，)，下游引物 Potato AV43-6-G7 primerR (5，-tgtcgtgccagctgcatta- ‘3)，探針 Potato AV43-6-G7Probe (5，-FAM- cccgcgcgttggccgat-3? BHQ)。其中上游引物、下游引物和探針比例:2:2:1 ;其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP: dATP: dGTP: dCTP =
1:1:1:1ο
[0021]按照以下程序進行檢測:
(1)待測樣品DNA的提取
Α.稱取經過預處理的待測樣本1.00 g至50 mL離心管中。
[0022]B.加入10 mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL)，顛倒混勻后于65°C溫育30 min，期間顛倒混勻離心管2~3次；12000 g離心10 min，轉移lmL上清液至2 mL離心管中。
[0023]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000 g離心10 min，轉移上清液600 yL至2 mL離心管中。
[0024]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置1 h ； 12000 g離心10 min,
棄去上清液。
[0025]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5 mL離心管。
[0026]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000 g離心10 min，轉移上層水相至1.5 mL離心管中。
[0027]G.加入0.6倍體積經4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30 min ； 12000g離心10 min，小心棄去上清液。
[0028]H.加入500 μ L70%乙醇，震蕩離心柱管，12000 g離心10 min，棄去上清液，重復一次，在室溫下揮干液體。
[0029]1.加入100 μ L TE溶液溶解DNA，4°C保存備用。
[0030](2 )待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增
A.在PCR反應管中加入24PL PCR反應液A和?μ?樣品DNA，混勻。
[0031]Β.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
95 °C 15min，1個循環預變性；
95°C 15sec,59°C lmin，40 個循環。
[0032](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定擴增曲線的Ct值。
[0033]結果如圖1。轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系塊莖粉有PCR擴增曲線且Ct值為26.2判定為檢出，其他陰性對照無PCR擴增曲線判定為未檢出。
[0034]實施例2
按下述方法檢測轉基因馬鈴薯AV43-6-G7品系的馬鈴薯塊莖粉與等重量的非轉基因馬鈴薯粉混合均勻做用作陽性對照。使用98140轉基因玉米粉、DAS-40278-9轉基因玉米粉、305423轉基因大豆粉、M0N87701轉基