專利名稱：：一種鑒定白化苗基因型愈傷的方法
技術領域：
：本發明屬于植物基因工程領域。本發明涉及一種鑒定白化苗基因型愈傷的方法；更具體的說，本發明涉及一種鑒定由T-DNA插入造成的水稻白化突變體，篩選白化苗純合基因型愈傷，用于功能互補實驗的方法。
背景技術：
：水稻是最重要的糧食作物之一，全世界二分之一以上的人口以其為主食。水稻也是單子葉植物的模式植物，開展其基因功能研究具有重要的經濟價值和科研價值。近年來，隨著國際水稻基因組測序計劃的完成，對水稻基因進行研究分析并最終闡明其功能成為當前緊迫的任務。在克隆基因過程中，當得到一系列的侯選基因后，一般要進行下列分析來確定目標基因(1)檢測cDNA是否與目標基因共分離；(2)檢測cDNA時空表達特點與表型是否一致；(3)測定cDNA序列，進行生物信息學分析，以了解該基因的功能；(4)篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關系；(5)進行功能互補實驗，通過轉化突變體觀察突變體表型是否恢復正常或發生預期的表型變化。目前利用新興的RNA干擾(RNAi)也可有效地確定目的基因，但是功能互補實驗是最直接、最終鑒定基因的方法。隨著大量的基因的分離，基因的功能亟需得到驗證，為實現這一目的必然要依托于高效的水稻遺傳轉化體系，因此水稻遺傳轉化研究越來越為人們所關注。水稻遺傳轉化體系已比較完善，農桿菌介導法、基因槍法、PEG法、花粉管通道法等方法均在水稻遺傳轉化中應用并獲得轉基因植株，但目前用的最多的方法是基因槍法和農桿菌介導法。理論上水稻幾乎所有具有潛在分裂分化能力的組織和細胞都可以作為受體材料，但要想獲得理想的轉化結果，根據水稻品種的不同，選擇適當的轉化受體材料是十分關鍵的。目前最常用遺傳轉化受體材料包括成熟胚、幼胚、花藥和幼穗。王秀紅等通過對水稻不同外植體的培養效果進行分析，四中外植體的培養存在基因型差異，不同外植體的培養效果差異明顯。花藥愈傷組織誘導率明顯偏低，幼胚出愈傷比較容易但存在明顯的基因型差異，幼穗和成熟胚的培養易于操作，成熟胚的培養污染明顯減少。而且成熟胚的取材不受生長季節的限制，因而成為當前廣泛采用的受體材料(水稻不同外植體培養效果及其相關性分析。中國水稻科學，2005，19(2)187-189)。由于T-DNA的插入破壞了基因的功能，造成純合隱性基因失活，產生一些如白化苗、致死、早衰、不育等無法收獲種子的突變體，給互補實驗利用成熟胚幼導愈傷帶來了一些困難。為了研究這些基因是否具有該功能，必須用這些突變體來誘導愈傷，作為遺傳轉化的受體材料。因此要獲得具有純合突變基因型的愈傷，才能進行功能互補實驗。
發明內容本發明的目的是在于提供了一種鑒別白化苗基因型愈傷的方法。由于白化苗突變體生長一個月左右后就逐漸死亡，不能獲得純合突變基因型種子，無法進行功能互補實驗。利用本方法可以從T-DNA插入造成的白化突變體雜合體后代種子誘導的愈傷中，鑒定出白化苗純合基因型愈傷，進行遺傳轉化實驗。本發明還包括應用該方法，篩選鑒定由T-DNA插入造成的純合隱性基因失活而導致的致死、不育、早衰等無法收到種子的突變體的純合基因型的愈傷篩選。為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施，其步驟為1、用雜合基因型水稻植株收獲的種子誘導愈傷，通過篩選T-DNA的插入的突變體庫，得到由于T-DNA的插入造成基因失活而在T1代產生白化苗突變體家系，如圖1所示。利用Tail-PCR(熱不平衡交錯PCR)技術分離T-DNA插入位點的水稻DNA序列，把基因組序列與水稻基因組數據庫進行比較，得到插入T-DNA前后的水稻DNA序列信息。如果出現的白化苗是由于T-DNA插入造成，在T1代植株中在該T-DNA插入位點將出現三種基因型兩條姐妹染色體全有T-DNA插入的為白化苗純合基因；僅有一條染色體上有T-DNA插入的為雜合基因；該位點染色體上無T-DNA插入的為陰性純合基因，根據分離的水稻基因組序列，在T-DNA兩端的水稻基因組上各設計一條引物a5’-GCAAAACAGACTGCGGTGAG-3’，b5’-GAGCCGAGTTAAGACAACGATC-3’，引物c5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’為載體左末端用于分離基因組序列時測序用的引物，如圖2所示。抽提苗期DNA進行PCR擴增，白化苗純合基因型中a+b不能夠擴增，a+c可以擴增；雜合基因型中a+b、a+c均能夠擴增；該位點無T-DNA插入的陰性純合基因型中a+b能夠擴增，a+c不能夠擴增。種植該家系綠苗20株，檢測出雜合基因型植株，如圖3所示，收獲種子，剝去谷殼，75％的乙醇浸泡1分鐘，0.15％的升汞浸泡15分鐘，用滅菌水清洗5-6次后置于誘導培養基上，放置在27℃光照培養室50天左右，誘導愈傷。2、抽提愈傷DNA。把誘導的愈傷剝離下來，放在繼代培養基上，挑取一粒誘導出的愈傷，利用CTAB法抽提愈傷總DNA，加入400μl水溶解DNA。3、利用a，b，c引物PCR擴增愈傷DNA，由于白化苗純合基因型中a+b不能夠擴增，a+c可以擴增，1％的TBE膠電泳PCR產物，檢測愈傷基因型。4、挑選出經PCR檢測的白化苗純合基因型愈傷，置于分化培養基上，放置在28℃光照培養室40天，進行分化驗證，得到白化苗再生植株。本發明的方法簡單易行，鑒別快速方便，結果可靠。本實驗中，共誘導雜合種子200粒，誘導出愈傷144粒，經過PCR篩選，得到白化苗純合基因型愈傷39粒，挑21粒白化苗基因型愈傷放置在分化培養基上分化，18個愈傷分化出苗且全部為白化苗，而作為對照的雜合基因型和野生純合基因型愈傷分化出的苗子全部為綠苗。鑒定的白化苗基因型愈傷與7愈傷分化的表型完全一致，說明該方法結果準確可靠。用該方法還可鑒定由T-DNA插入造成的純合隱性基因失活而導致的致死、不育、早衰等無法收到種子的突變體的純合基因型的愈傷，用于功能互補實驗。圖1是T0代種子大田播種后兩個星期后田間篩選的照片，EV57家系出現白化突變性狀，白化苗約一個月左右逐漸死亡；圖2是設計共分離引物及引物位置的示意圖，灰線條代表T-DNA結構，黑線條代表水稻基因組。a和b分別是T-DNA插入位點兩端的基因組序列設計的引物，c是位于T-DNA載體左末端用于側翼序列測序的引物。a+b和a+c配對均能擴增出0.8kb的條帶；圖3是用共分離檢測引物檢測白化苗(a，b)和田間種植綠苗(c，d)的膠圖。4a是用引物a+b擴增20個白化苗和一個中花11未轉基因的植株作為對照，白化苗均未擴增出條帶，對照擴增出條帶；4b是用引物a+c擴增20個白化苗和一個中花11未轉基因的植株作為對照，白化苗均擴增出條帶，對照未擴增出條帶；4c是是用引物a+b擴增20個綠苗和一個中花11未轉基因的植株作為對照，全部擴增出條帶；4d是用引物a+c擴增20個綠苗和一個中花11未轉基因的植株作為對照，1、7、18和對照未擴增出條帶，其余擴增出條帶，表明它們為無T-DNA插入的野生型單株，擴增出電泳帶的為T-DNA插入位點雜和的單株；圖4是引物a+b擴增T1雜合基因型植株種子誘導的愈傷抽提的DNA圖5是引物a+c擴增T1雜合基因型植株種子誘導的愈傷抽提的DNA圖4和圖5表明10，13，16，18，19，22為白化苗純合基因型愈傷；7，21，24為陰性植株，其余為雜合基因型植株。圖6是白化苗純合基因型愈傷分化的圖片。左邊為白化苗純合基因型愈傷分化，長出白苗，右邊為雜合基因型愈傷的分化，長出綠苗；具體實施方式下面以白化苗突變家系為例，介紹一下具體實施方式實施例1檢測白化苗的產生是由于T-DNA插入造成將利用增強子捕獲系統的T-DNA載體pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35418-27.)插入的中花11號粳稻品種(OryzasativaL.subsp.japonicacv.Zhonghua11)的T0代種子25℃浸種4天，37℃催芽3天后，大田播種，兩個星期后田間調查得到白化苗突變表型株系EV57。該突變體在幼苗時表現白化性狀，如圖1所示，生長一個月左右突變體植株逐漸死亡。大田種植20株綠苗用于收獲種子做下一步研究。利用CTAB法(Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandpreciselocationofs5locusinthemolecularmap.TAG，1997，95809-814)抽提白化苗突變體EV57的總DNA，參照Liu等(ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681；EfficientisolationandmappingofArabidopsisthalianaT-DNAinsertjunctionsbythermalasymmetricinterlacedPCR.PlantJ.，8457-463)報道的Tail-PCR(熱不平衡交錯PCR)技術分離T-DNA插入位點的水稻DNA序列。為了檢測白化突變表型是否與T-DNA插入的基因共分離，在T-DNA插入的兩端分別設計引物，如圖3所示，引物序列為a5’-GCAAAACAGACTGCGGTGAG-3’，b5’-GAGCCGAGTTAAGACAACGATC-3’，引物c5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’為載體左末端用于測序的引物。由于破壞的為隱性基因，因此，在PCR擴增當中，白化苗突變體a+b引物不能擴增出條帶，a+c引物能夠擴增出條帶；野生型綠苗的a+b能構擴增出條帶。PCR反應條件先94℃3分鐘變性，然后進入PCR循環，94℃變性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘。擴增結果如圖3所示，可以看出，突變表型與白化苗基因共分離。實施例2、篩選雜合單株收獲種子根據T-DNA側翼基因組序列設計PCR引物，針對本實例，a表示在T-DNA插入位點上游設計的引物，b表示在插入位點T-DNA下游設計的引物，c表示根據T-DNA末端序列設計的引物。在T1代植株中，若為T-DNA插入位點純合單株，由于T-DNA片段為10kb以上，一般PCR反應不能擴增10kb以上的片段，因此a與b配對的PCR擴增為陰性，但a和c配對可以擴增得到一個0.8kb的產物。若擴增位點為沒有T-DNA的插入的野生型單株，由于沒有c引物結合的位點，則只有a和b配對是可以得到一個1.0kb的產物。而對于T-DNA插入位點雜合單株，則在a和c配對以及a和b配對時都可以擴增得到產物。根據兩對PCR引物的擴增結果，就可以確定T-DNA插入位點雜合單株上收獲的種子的基因型，將T-DNA插入位點純合基因型的愈傷組織鑒定出來作為基因功能互補驗證轉化的受體。按此方法就可以確定EV57家系T1代雜合植株種子的基因型。收獲T1雜合單株種子。實施例3、誘導愈傷，抽提愈傷DNA，鑒定愈傷基因型選取雜合基因型的植株收獲的種子，剝去谷殼，用75％乙醇浸泡1分鐘，0.15％的升汞浸泡15分鐘，然后用滅菌水清洗5-6次，把米粒放在誘導培養基上誘導愈傷(見下面農桿菌介導的遺傳轉化主要步驟中愈傷組織的誘導部分)。27℃在暗室放置50天左右，即會有愈傷長出，每粒米上誘導出的愈傷挑取一顆用CTAB法(Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandpreciselocationofs5locusinthemolecularmap.TheorApplGenet，1997，95809-814)抽提DNA。用a+b，a+c兩對PCR引物按照實例1的原理篩選出T-DNA插入純合基因型，即表型為白化苗的愈傷組織作為基因功能互補驗證轉化的受體。如圖4和圖5所示。實施例4、把篩選出來的白化苗基因型愈傷組織置于分化培養基上，直接進行分化，放置于28℃的光照培養室中約50天左右，就會分化出苗。挑出21個白化苗基因型愈傷進行分化，得到18株苗且全部為白化突變表型，而作為對照的雜合基因型和野生純合基因型愈傷分化出的苗子全部為綠苗，如圖6所示。以上所述僅為本發明的若干個具體實施方式，應當指出，對于本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應當認為是本發明的保護范圍。農桿菌介導的遺傳轉化步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后20-25℃下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g20-25℃下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存備用。4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存備用。5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g20-25℃下溶解并定容至1000ml。6)MSmin母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g20-25℃下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，20-25℃保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，20-25℃保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存備用。10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存備用。12)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存備用。(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2ml脯氨酸(Proline)0.5gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)分化培養基MSmax母液(10X)100mlMSmin母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。權利要求1.一種鑒定白化苗基因型愈傷的方法，它包括下列步驟A、用雜合基因型水稻植株收獲的種子誘導愈傷，通過篩選T-DNA的插入的突變體庫，得到T-DNA的插入造成基因失活而在T1代產生白化苗突變體家系，利用Tail-PCR分離T-DNA插入位點的水稻DNA序列，在T1代植株中在該T-DNA插入位點將出現三種基因型兩條姐妹染色體全有T-DNA插入的為白化苗純合基因型、一條染色體上有T-DNA插入的為雜合基因型和該位點染色體上無T-DNA插入的為陰性純合基因型，在插入位點T-DNA兩端的水稻基因組上各設計一條引物a5’-GCAAAACAGACTGCGGTGAG-3’，b5’-GAGCCGAGTTAAGACAACGATC-3’，引物c5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’為載體左末端用于測序的引物，抽提苗期DNA進行PCR擴增，白化苗純合基因型中a+b不擴增，a+c擴增；雜合基因型中a+b、a+c能擴增，該位點無T-DNA插入的陰性純合基因型中a+b能擴增，a+c不能擴增，種植家系綠苗，檢測出雜合基因型植株，收獲種子，剝去谷殼，75％的乙醇浸泡1分鐘，0.15％的升汞浸泡15分鐘，用滅菌水清洗5-6次后置于誘導培養基上，放置在27℃光照培養室50天，誘導愈傷；B、抽提愈傷DNA，把誘導的愈傷剝離下來，放在繼代培養基上，挑取一粒誘導出的愈傷，利用CTAB法抽提愈傷總DNA，加入400μl水溶解DNA；C、利用a，b，c引物PCR擴增愈傷DNA，白化苗純合基因型中a+b不能擴增，a+c擴增，1％的TBE膠電泳PCR產物，檢測愈傷基因型；D、挑選出經PCR檢測的白化苗純合基因型愈傷，置于分化培養基上，放置在28℃光照培養室40天，進行分化驗證，得到白化苗再生植株。全文摘要本發明公開了一種鑒定白化苗基因型愈傷的方法。首先是用雜合基因型種子誘導愈傷，剝去谷殼，乙醇和汞浸泡一定時間，用滅菌水清洗后置于誘導培養基上，放置在光照培養室誘導愈傷；其次是抽提愈傷DNA，把誘導的愈傷剝離下來，放在繼代培養基上，挑取一粒誘導出的愈傷，利用CTAB法抽提愈傷總DNA，加入水溶解；第三是通過PCR擴增愈傷總DNA，白化苗基因型中a+b不擴增，a+c擴增，用TBE膠電泳PCR產物檢測愈傷基因型；第四是挑選出經PCR檢測的白化苗純合基因型愈傷，置于分化培養基上，放置在光照培養室，進行分化驗證。用該方法可鑒定由T－DNA插入造成的純合隱性基因失活而導致的致死、不育、早衰等無法收到種子的突變體的純合基因型的愈傷，用于功能互補實驗。文檔編號C12Q1/68GK101037705SQ200610018548公開日2007年9月19日申請日期2006年3月15日優先權日2006年3月15日發明者吳昌銀,郭冬,張啟發申請人:華中農業大學