專利名稱：馬鈴薯淀粉分支酶Ⅱ的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型馬鈴薯淀粉分支酶。更具體地說，本發明涉及馬鈴薯的第二種淀粉分支酶(SBE II)的氨基酸序列和它的片段以及它們相應的DNA序列。并且，本發明涉及含有這種DNA序列的載體、產生轉基因馬鈴薯的方法和所說的馬鈴薯在產生淀粉方面的用途。
淀粉是一種不同分子形式的復雜混合物，所說的分子在葡萄糖鏈的聚合和分支程度上不同。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中直鏈淀粉由本質上線型的α-1，4-葡聚糖組成，支鏈淀粉由彼此通過α-1，6-鍵連接的α-1，4-葡聚糖組成，這樣，形成了分支的多葡聚糖。因此，淀粉不是均一的原材料。
淀粉是通過至少三種酶促反應合成的，其中涉及到ADP葡萄糖磷酸化酶(EC 2.7.7.27)、淀粉合成酶(EC 2.4.1.21)和淀粉分支酶(EC 2.4.1.18)。淀粉分支酶(SBE，也稱為Q-酶)具有兩種不同的酶促活性。它催化α-1，4-糖苷鍵的水解以及在淀粉的分支成分合成期間形成α-1，6-糖苷鍵，即支鏈淀粉。
植物淀粉是一種有價值的可再生原材料的來源，例如用于化學工業(Visser和Jacobsen，1993)。然而，淀粉的質量必須滿足加工工業的要求，其中，結構的均一性是一項重要的指標。為了便于在工業上應用，要求植物分別只含有直鏈淀粉和支鏈淀粉。
已經提出了改變淀粉中直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的方法。例如，WO95/04826中描述了編碼脫支酶的DNA序列，此酶能夠減少或者增加轉基因植物(如馬鈴薯)中的支鏈淀粉的分支程度。
在WO92/14827中描述了包含DNA序列的質粒，所說的DNA序列在插入到植物的基因組中后，能夠使再生的植株的碳水化合物濃度和碳水化合物的組成發生變化。這些變化是由于位于這些質粒中的分支酶序列引起的。這種分支酶可用來改變植物(特別是商業上使用的植物)中淀粉的直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例。
WO92/14827中描述了迄今為止馬鈴薯中唯一已知的淀粉分支酶，在本領域中還不知道其它的淀粉分支酶是否與馬鈴薯分支淀粉的合成有關。
在分子基因遺傳學(1991)225289-296(Visser等)中描述了通過反義構建體來抑制與顆粒結合的淀粉合成酶基因的表達。在馬鈴薯塊莖淀粉中此酶的抑制作用可達100％，因此可以提供不含直鏈淀粉的淀粉。
然而，現有的抑制支鏈淀粉的方法還不成功，因此還非常需要抑制支鏈淀粉的替代性方法(Mülller-Rber和Koβmann，1994；Martin和Smith，1995)。
本發明的目的在于改變馬鈴薯淀粉中的支鏈淀粉的分支程度和支鏈淀粉/直鏈淀粉的比例。
按照本發明，其目的是通過提供一種新型的編碼第二種淀粉分支酶(SBE II)的分離的DNA序列和它的片段來達到的，將所說的DNA序列插入到植物的基因組后，可以使再生植株的淀粉分支程度和比例發生變化。
SBE II的氨基酸序列和它的片段也包括在本發明的范圍內。
另外，由于遺傳密碼的簡并性而產生的上述DNA序列的變體也包括在本發明的范圍內。
所說的編碼SBEII的新型DNA序列(包含3074個核苷酸)以及相應的氨基酸序列(包含878個氨基酸)如SEQ ID No.1所示。一段上述DNA序列的1393個核苷酸長的片段(相當于SEQ ID No.1 DNA序列的核苷酸1007至2399)以及相應的氨基酸序列(包含464個氨基酸)如SEQ ID No.2所示。
此外，本發明提供了包含所說的分離的DNA序列和在馬鈴薯中有活性的調節元件的載體。可以將所說的DNA序列以相對于正好在此DNA序列上游的啟動子有意義或反義(相反)方向插入到此載體中。
此外，本發明也提供了產生轉基因馬鈴薯的方法，所說的馬鈴薯支鏈淀粉的分支程度降低，這種方法包括下列步驟a)將按照權利要求的載體轉移并摻加到馬鈴薯細胞的基因組中；和b)由轉化細胞再生完整的植株。
最后，本發明提供了所說的轉基因馬鈴薯在產生淀粉方面的用途。
結合實驗部分和附圖來更詳細地描述本發明，其中


圖1為由正常馬鈴薯(A道)和轉基因馬鈴薯(B道)淀粉提取的蛋白質的SDS聚丙烯酰胺電泳。箭頭表明切除的蛋白質帶。M道分子量標記蛋白質(kDa)。
圖2為來源于馬鈴薯塊莖淀粉消化的蛋白質的4種肽序列。
實驗部分從馬鈴薯塊莖分離淀粉田間種植馬鈴薯(Solanum tuberosum)。4℃下，將栽培種EarlyPuritan或實質上缺乏與顆粒結合的淀粉合酶I(Svalf Weibull AB，國際申請PCT/SE91/00892)的轉基因馬鈴薯系的去皮塊莖在水果榨汁器中勻漿。向含有大部分淀粉的“汁液組分”中，立即加入Tris-HCl(pH 7.5)、連二亞硫酸鈉和乙二胺四乙酸(EDTA)，其終濃度分別為50mM、30mM和10mM。使淀粉顆粒沉降30分鐘，然后用10倍于柱床體積的洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA)洗滌4次。最后用3倍于柱床體積的丙酮將淀粉(即每次洗滌之間在+4℃下靜止30分鐘沉淀下來的淀粉)洗滌3次，過夜空氣干燥，并貯存在-20℃。從塊莖淀粉中提取蛋白質85℃下，通過移液管吸打將貯存的淀粉(20g)與200毫升提取緩沖液((50mM Tris-HCl，pH 7.5，2％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，5mM EDTA)充分混合，直到淀粉成為膠狀。然后將樣品在-70℃下冷凍1小時。50℃下解凍后，10℃下將樣品以12,000xg離心20分鐘。收集上清液，以3,000xg再離心15分鐘。將最后的上清液通過0.45μ的濾膜過濾，并加入2.25倍體積冰冷的丙酮。4℃下溫育30分鐘后，通過離心(4℃下，以3,000xg離心30分鐘)收集蛋白質沉淀，然后溶解在50mM Tris-HCl，pH7.5中。按照Laemmli(1970)通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每種制劑的等份樣品(
圖1)。通過三氯乙酸(10％)沉淀來濃縮余下制劑中的蛋白質，然后在8％ SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離這些蛋白質(Laemmli，(1970))。用考馬斯亮藍R-250(在20％甲醇、0.5％乙酸和79.5％ H2O中含有0.2％)將凝膠中的蛋白質染色。肽在凝膠上的消化和測序切下
圖1中箭頭表明的染色的帶(相當于表觀分子量大約為100kDa)，并于35℃下，在0.2M NH4HCO3的50％乙腈溶液中在不斷攪拌下洗滌20分鐘，洗滌兩次。每次洗滌后，除去液體，使凝膠塊在通風櫥中通過蒸發干燥。然后將完全干燥的凝膠塊分開放置在石蠟膜上，并加入2μl 0.2MNH4CO3和0.02％ Tween-20。使凝膠塊吸收改良的胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)(2μl中含有0.25μg)，之后加入0.2M NH4CO3，每次5μl，直到凝膠塊恢復到原來的大小。然后將凝膠塊分成3塊，并轉移到Eppendorf管中。加入0.2M NH4CO3(200μl)，37℃下將凝膠塊中所含的蛋白質過夜消化(Rosenfeld等，1992)。完全消化后，加入三氟乙酸至終濃度為1％，倒出上清液并保存。在37℃下，將所說的凝膠塊用60％乙腈、0.1％三氟乙酸(200μl)在連續震蕩的情況下再提取兩次，每次20分鐘。將這兩次的上清液與第一次的上清液合并。最后用60％乙腈、0.1％三氟乙酸、0.02％ Tween-20(200μl)洗滌凝膠塊。此外，將這些上清液與其它的上清液合并，蒸發使體積減少到50μl。將提取的肽在用μRPC C2/C18SC2.1/10柱裝備的SMART色譜系統(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上分離。用梯度為0-60％的乙腈水溶液/0.1％三氟乙酸以100μl/分鐘的流速洗滌肽60分鐘。根據廠商的說明在應用生物系統470A氣相測序儀(帶有聯機PTH-氨基酸分析器(120A))或者在476A類型(應用生物系統，Foster城，CA，美國)上對此肽進行測序。
四個測序的肽很容易給出可翻譯的序列(圖2)。數據庫檢索表明這四種肽與淀粉分支酶具有相似性，更有趣的是與馬鈴薯的淀粉分支酶相比，這些肽與其它植物的淀粉分支酶更相關。編碼肽1和2的寡核苷酸的構建如上所述，分別合成編碼肽1和2的簡并寡核苷酸作為正向和反向引物寡核苷酸15′-gtaaaacgacggccagt-TTYGGNGTNTGGGARATHTT-3′(肽1的殘基2-8)寡核苷酸25′-aattaaccctcactaaaggg-CKRTCRAAYTCYTGIARNCC-3′t(肽2的殘基2-8，反義鏈)其中H是A，C或T，I是肌苷；K是G或T；N是A，C，G或T；R是A或G；Y是C或T；小寫形式的堿基以尾序列加入。馬鈴薯塊莖中mRNA的純化、cDNA的合成和對應于馬鈴薯淀粉分支酶II的cDNA片段的PCR擴增如上所述(Logemann等，1987)從成熟馬鈴薯塊莖(S.tuberosum cv.Amanda)中分離總RNA。使用2μg的總RNA和作為下游引物的60pmol寡-dT30合成第一條cDNA。所說的引物在60℃下與mRNA的polyA退火5分鐘。使用RiboclonecDNA合成系統M-MLV(H-)(Promega)按照制造廠商的技術手冊完成cDNA的延伸。
使用根據肽1和2(參見上文)設計的兩種簡并引物在下列條件下于Perlin-Elmer GeneAmp9600 PCR熱循環儀(Perkin-Elmer Cetus儀器，CT，美國)上擴增編碼本發明的新型淀粉分支酶II的cDNA1mM dNTP，每種引物1μM，1份上文描述的cDNA，總反應體為20μl，其中含有1×AmpliTaq緩沖液和0,8U的AmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus)。循環條件為96℃，1分鐘；當加入酶時以80℃作為熱起始(大約15分鐘)，非故意降低到25℃；5個循環94℃，20秒；45℃，1分鐘；然后是72℃，1分鐘和72℃，2分鐘；30個循環94℃，5分鐘；45℃，30秒；72℃，(每個循環2秒+2分鐘)并在冷卻到4℃之前以72℃，10分鐘結束反應。
使用下列循環條件重新擴增所說的反應樣品(0.1μl)96℃，1分鐘；當加入酶時以80℃作為熱起始(大約5分鐘)；5個循環94℃，20秒；45℃，1分鐘；然后是72℃，2分鐘；25個循環94℃，5秒；45℃，30秒；72℃(每個循環2分鐘+2秒)并在冷卻到4℃之前以72℃，10分鐘結束反應。PCR擴增完成后，將反應物加入到1.5％Seakem瓊脂糖凝膠(FMC生物產品，Rockland，ME，USA)上。電泳并用溴化乙錠染色后，切下表觀大小為1500bp的主帶，然后在水(200μl)中震蕩洗脫此片段1小時。使用相當于所說的尾序列(在寡核苷酸1和2中)的引物重新擴增此片段、如上所述通過瓊脂糖凝膠電泳純化、使用Qiaex凝膠提取試劑盒按照廠商的說明(DIAGEN GmbH，Hilden，德國)從凝膠中提取此片段，之后，在測序反應中將此片段作為模板。使用DyeDeoxy終止子循環測序試劑盒(Perkin-Elmer Cetus儀器)和尾序列及內部引物完成所說的測序反應。在應用生物系統373A DNA測序儀上按照廠商的方案分析此測序反應。編輯此序列，其包含1393bp。
為了確定淀粉分支酶II的序列，由如上所述的總RNA，使用1393bp序列的特異引物，通過cDNA末端快速擴增方法(RACE)擴增所說的全長cDNA的5’和3’端。在3’端擴增過程中，使用對應于多聚A尾的寡T29G引物，在5’端擴增過程中，使用Boehringer Mannheim的5’/3’RACE試劑盒(產品號1734792)。以上述同樣的方法使用內部和末端引物對擴增的片段進行測序。將兩個末端的序列一起與1393bp序列比較，得到組成型全長cDNA序列。由此序列設計引物，以便擴增第一部分的整個編碼區。擴增的編碼cDNA的部分測序確認了相當于組成型序列的cDNA的存在。全長cDNA是3074bp，翻譯的序列包含878個氨基酸。成熟蛋白質包含830個氨基酸。
比較EMBL與GenBank數據庫的共有序列表明所說的序列與馬鈴薯淀粉分支酶I具有68％的等同性，與其它植物種的淀粉分支酶II具有80％的等同性。因此，本發明提供了由新的分支酶序列編碼的酶(馬鈴薯淀粉分支酶II)。馬鈴薯植株的轉化將分離的全長馬鈴薯淀粉分支酶II的cDNA和其它大小為50-3074bp范圍內的功能活性片段以反向克隆到在馬鈴薯塊莖中有活性的啟動子的后面。術語“功能活性”的意思是指能夠影響馬鈴薯塊莖中直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的片段。按照本發明的SBE II的DNA和氨基酸序列以及所說的DNA的一個片段和相應的氨基酸序列分別如SEQ ID No.1和2所示。
例如可以從patatin啟動子、與馬鈴薯顆粒結合的淀粉合酶I基因的啟動子或者由馬鈴薯淀粉分支酶I和II基因中分離的啟動子中選擇所使用的啟動子。
將所說的構建體通過本領域公知的技術克隆到適合于根癌土壤桿菌介導的馬鈴薯轉化的雙元Ti-質粒載體，或者克隆到適合于使用基因槍技術或電激進行直接轉化的載體中。有意義(參見下文)和反義構建體必須包含所有的必需調節元件。
轉基因馬鈴薯植物可以在塊莖中特異性地轉錄反向淀粉分支酶II構建體，導致此酶的反義抑制。因此，在馬鈴薯塊莖中支鏈淀粉的分支模式減少并發生變化，同時淀粉中的直鏈淀粉/支鏈淀粉比例發生變化。
馬鈴薯淀粉分支酶II的反義構建體也可以與馬鈴薯淀粉分支酶I、與馬鈴薯顆粒結合的淀粉合酶II、馬鈴薯可溶性淀粉合成酶II和III、馬鈴薯淀粉歧化酶(D-酶)、或者馬鈴薯淀粉脫支酶的反義構建體結合使用，來轉化馬鈴薯以改變支鏈淀粉的分支程度和直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例。這樣可以為淀粉加工業提供新的有價值的原料。
將不同構建體中的編碼此酶的全長cDNA序列以有意義方向克隆到一個或多個上述提到的啟動子的后面，并將所說的構建體轉移到上述合適的轉化載體中，以便用于轉化馬鈴薯。再生的轉化馬鈴薯植株將在塊莖中產生過量淀粉分支酶II，導致支鏈淀粉的分支程度增加和分支模式發生變化，或者由于共抑制作用抑制了內源淀粉分支酶II的轉錄物的轉錄，結果使支鏈淀粉的分支降低。參考文獻1.Müller-Rber，B.，Koβmann，J.，(1994)影響轉基因植物中淀粉數量和淀粉質量的方法。植物細胞環境學17，601-613。
2.Martin，C.，Smith，A.(1995)淀粉的生物合成。植物細胞7，971-985。
3.Laemmli，U.K.(1979)噬菌體T4頭部裝配過程中結構蛋白質的切割。自然227，680-685。
4.Logemann，J.，Schell，J.和Willmitzer，L.(1987)從植物組織中分離RNA的改進的方法。分析化學163，16-20。
5.Rosenfeld，J.，Capdeville，J，Guillemot，J.C.，Ferrara，P.(1992)在單向或雙向凝膠電泳后為了進行內部序列分析在凝膠上進行蛋白質消化。分析化學203，173-179。
6.Visser，R.G.F.，Jacobsen，E.(1993)改良植物以改變淀粉的含量和組成。TibTech 11，63-68。SEQ ID No.1測序的分子cDNA名稱solanum tuberosum(馬鈴薯)的beII基因(分支酶II)序列長度3074bpAAACCTCCTC CACTCAGTCT TTGTTTCTCT CTCTCTTCAC GCTTCTCTTG GCGCCTTGAA 60CTCAGCAATT TGACACTCAG TTAGTTACAC TNCCATCACT TATCAGATCT CTATTTTTTC 120TCTTAATTCC AACCAAGGAA TGAATAAAAA GATAGATTTG TAAAAACCCT AAGGAGAGAA 180GAAGAAAG ATG GTG TAT ACA CTC TCT GGA GTT CGT TTT CCT ACT GTT CCA 230Met Val Tyr Thr Leu Ser Gly Val Arg Phe Pro Thr Val Pro-45 -40 -35TCA GTG TAC AAA TCT AAT GGA TTC AGC AGT AAT GGT GAT CGG AGG AAT 278Ser Val Tyr Lys Ser Asn Gly Phe Ser Ser Asn Gly Asp Arg Arg Asn-30 -25 -20GCT AAT NTT TCT GTA TTC TTG AAA AAG CAC TCT CTT TCA CGG AAG ATC 326Ala Asn Xaa Ser Val Phe Leu Lys Lys His Ser Leu Ser Arg Lys Ile-15 -10 -5TTG GCT GAA AAG TCT TCT TAC AAT TCC GAA TCC CGA CCT TCT ACA GTT 374Leu Ala Glu Lys Ser Ser Tyr Asn Ser Glu Ser Arg Pro Ser Thr Val1 5 10GCA GCA TCG GGG AAA GTC CTT GTG CCT GGA ACC CAG AGT GAT AGC TCC422Ala Ala Ser Gly Lys Val Leu Val Pro Gly Thr Gln Ser Asp Ser Ser15 20 25 30TCA TCC TCA ACA GAC CAA TTT GAG TTC ACT GAG ACA TCT CCA GAA AAT470Ser Ser Ser Thr Asp Gln Phe Glu Phe Thr Glu Thr Ser Pro Glu Asn35 40 45TCC CCA GCA TCA ACT GAT GTA GAT AGT TCA ACA ATG GAA CAC GCT AGC518Ser Pro Ala Ser Thr Asp Val Asp Ser Ser Thr Met Glu His Ala Ser50 55 60CAG ATT AAA ACT GAG AAC GAT GAC GTT GAG CCG TCA AGT GAT CTT ACA566Gln Ile Lys Thr Glu Asn Asp Asp Val Glu Pro Ser Ser Asp Leu Thr65 70 75GGA AGT GTT GAA GAG CTG GAT TTT GCT TCA TCA CTA CAA CTA CAA GAA614Gly Ser Val Glu Glu Leu Asp Phe Ala Ser Ser Leu Gln Leu Gln Glu80 85 90GGT GGT AAA CTG GAG GAG TCT AAA ACA TTA AAT ACT TCT GAA GAG ACA662Gly Gly Lys Leu Glu Glu Ser Lys Thr Leu Asn Thr Ser Glu Glu Thr95 100 105 110ATT ATT GAT GAA TCT GAT AGG ATC AGA GAG AGG GGC ATC CCT CCA CCT710Ile Ile Asp Glu Ser Asp Arg Ile Arg Glu Arg Gly Ile Pro Pro Pro115 120 125GGA CTT GGT CAG AAG ATT TAT GAA ATA GAC CCC CTT TTG ACA AAC TAT758Gly Leu Gly Gln Lys Ile Tyr Glu Ile Asp Pro Leu Leu Thr Asn Tyr130 135 140CGT CAA CAC CTT GAT TAC AGG TAT TCA CAG TAC AAG AAA CTG AGG GAG806Arg Gln His Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Tyr Lys Lys Leu Arg Glu145 150 155GCA ATT GAC AAG TAT GAG GGT GGT TTG GAA GCT TTT TCT CGT GGT TAT 854Ala Ile Asp Lys Tyr Glu Gly Gly Leu Glu Ala Phe Ser Arg Gly Tyr160 165 170GAA AAA ATG GGT TTC ACT CGT AGT GCT ACA GGT ATC ACT TAC CGT GAG 902Glu Lys Met Gly Phe Thr Arg Ser Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Arg Glu175 180 185 190TGG GCT CCT GGT GCC CAG TCA GCT GCC CTC ATT GGA GAT TTC AAC AAT 950Trp Ala Pro Gly Ala Gln Ser Ala Ala Leu Ile Gly Asp Phe Asn Asn195 200 205TGG GAC GCA AAT GCT GAC ATT ATG ACT CGG AAT GAA TTT GGT GTC TGG 998Trp Asp Ala Asn Ala Asp Ile Met Thr Arg Asn Glu Phe Gly Val Trp210 215 220GAG ATT TTT CTG CCA AAT AAT GTG GAT GGT TCT CCT GCA ATT CCT CAT 1046Glu Ile Phe Leu Pro Asn Asn Val Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His225 230 235GGG TCC AGA GTG AAG ATA CGT ATG GAC ACT CCA TCA GGT GTT AAG GAT 1094Gly Ser Arg Val Lys Ile Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp240 245 250TCC ATT CCT GCT TGG ATC AAC TAC TCT TTA CAG CTT CCT GAT GAA ATT 1142Ser Ile Pro Ala Trp Ile Asn Tyr Ser Leu Gln Leu Pro Asp Glu Ile255 260 265 270CCA TAT AAT GGA ATA TAT TAT GAT CCA CCC GAA GAG GAG AGG TAT ATC 1190Pro Tyr Asn Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile275 280 285TTC CAA CAC CCA CGG CCA AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA 1238Phe Gln His Pro Arg Pro Lys Lys Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu290 295 300TCT CAT ATT GGA ATG AGT AGT CCG GAG CCT AAA ATT AAC TCA TAC GTG 1286Ser His Ile Gly Met Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val305 310 315AAT TTT AGA GAT GAA GTT CTT CCT CGC ATA AAA AAG CTT GGG TAC AAT 1334Asn Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn320 325 330GCG GTG CAA ATT ATG GCT ATT CAA GAG CAT TCT TAT TAT GCT AGT TTT 1382Ala Val Gln Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe335 340 345 350GGT TAT CAT GTC ACA AAT TTT TTN GCA CCA AGC AGC CGT TTT GGA ACN 1430Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Xaa Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr355 360 365CCC GAC GAC CTT AAG TCT TTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CTA GGA ATT 1478Pro Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile370 375 380GTT GTT CTC ATG GAC ATT GTT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA 1526Val Val Leu Met Asp Ile Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Thr Leu385 390 395GAT GGA CTG AAC ATG TTT GAC GGC ACA GAT AGT TGT TAC TTT CAC TCT 1574Asp Gly Leu Asn Met Phe Asp Gly Thr Asp Ser Cys Tyr Phe His Ser400 405 410GGA GCT CGT GGT TAT CAT TGG ATG TGG GAT TCC CGC CTC TTT AAC TAT 1622Gly Ala Arg Gly Tyr His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr415 420 425 430GGA AAC TGG GAG GTA CTT AGG TAT CTT CTC TCA AAT GCG AGA TGG TGG 1670Gly Asn Trp Glu Val Leu Arg Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp435 440 445TTG GAT GAG TTC AAA TTT GAT GGA TTT AGA TTT GAT GGT GTG ACA TCA 1718Leu Asp Glu Phe Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser450 455 460ATG ATG TAT ACT CAC CAC GGA TTA TCG GTG GGA TTC ACT GGG AAC TAC 1766Met Met Tyr Thr His His Gly Leu Ser Val Gly Phe Thr Gly Asn Tyr465 470 475GAG GAA TAC TTT GGA CTC GCA ACT GAT GTG GAT GCT GTT GTG TAT CTG 1814Glu Glu Tyr Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu480 485 490ATG CTG GTC AAC GAT CTT ATT CAT GGG CTT TTC CCA GAT GCA ATT ACC 1862Met Leu Val Asn Asp Leu Ile His Gly Leu Phe Pro Asp Ala Ile Thr495 500 505 510ATT GGT GAA GAT GTT AGC GGA ATG CCG ACA TTT TNT ATT CCC GTT CAA 1910Ile Gly Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Xaa Ile Pro Val Gln515 520 525GAT GGG GGT GTT GGC TTT GAC TAT CGG CTG CAT ATG GCA ATT GCT GAT 1958Asp Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Ile Ala Asp530 535 540AAA TGG ATT GAG TTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA GTG GGT 2006Lys Trp Ile Glu Leu Leu Lys Lys Arg Asp Glu Asp Trp Arg Val Gly545 550 555GAT ATT GTT CAT ACA CTG ACA AAT AGA AGA TGG TCG GAA AAG TGT GTT 2054Asp Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val560 565 570TCA TAC GCT GAA AGT CAT GAT CAA GCT CTA GTC GGT GAT AAA ACT ATA 2102Ser Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile575 580 585 590GCA TTC TGG CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTT ATG GCT CTG GAT 2150Ala Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp595 600 605AGA CCN TCA ACA TCA TTA ATA GAT CGT GGG ATA GCA TTG CAC AAG ATG 2198Arg Pro Ser Thr Ser Leu Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met610 615 620ATT AGG CTT GTA ACT ATG GGA TTA GGA GGA GAA GGG TAC CTA AAT TTC 2246Ile Arg Leu Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe625 630 635ATG GGA AAT GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ATT GAT TTC CCT AGG GCT 2294Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala640 645 650GAA CAA CAC CTC TCT GAT GGC TCA GTA ATT CCC GGA AAC CAA TTC AGT 2342Glu Gln His Leu Ser Asp Gly Ser Val Ile Pro Gly Asn Gln Phe Ser655 660 665 670TAT GAT AAA TGC AGA CGG AGA TTT GAC CTG GGA GAT GCA GAA TAT TTA2390Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Glu Tyr Leu675 680 685AGA TAC CGT GGG TTG CAA GAA TTT GAC CGG GCT ATG CAG TAT CTT GAA2438Arg Tyr Arg Gly Leu Gln Glu Phe Asp Arg Ala Met Gln Tyr Leu Glu690 695 700GAT AAA TAT GAG TTT ATG ACT TCA GAA CAC CAG TTC ATA TCA CGA AAG2486Asp Lys Tyr Glu Phe Met Thr Ser Glu His Gln Phe Ile Ser Arg Lys705 710 715GAT GAA GGA GAT AGG ATG ATT GTA TTT GAA AAA GGA AAC CTA GTT TTT2534Asp Glu Gly Asp Arg Met Ile Val Phe Glu Lys Gly Asn Leu Val Phe720 725 730GTC TTT AAT TTT CAC TGG ACA AAA AGC TAT TCA GAC TAT CGC ATA GGC2582Val Phe Asn Phe His Trp Thr Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Arg Ile Gly735 740 745 750TGC CTG AAG CCT GGA AAA TAC AAG GTT GCC TTG GAC TCA GAT GAT CCA2630Cys Leu Lys Pro Gly Lys Tyr Lys Val Ala Leu Asp Ser Asp Asp Pro755 760 765CTT TTT GGT GGC TTC GGG AGA ATT GAT CAT AAT GCC GAA TAT TTC ACC2678Leu Phe Gly Gly Phe Gly Arg Ile Asp His Asn Ala Glu Tyr Phe Thr770 775 780TTT GAA GGA TGG TAT GAT GAT CGT CCT CGT TCA ATT ATG GTG TAT GCA2721Phe Glu Gly Trp Tyr Asp Asp Arg Pro Arg Ser Ile Met Val Tyr Ala785 790 795CCT AGT AGA ACA GCA GTG GTC TAT GCA CTA GTA GAC AAA GAA GAA GAA2774Pro Ser Arg Thr Ala Val Val Tyr Ala Leu Val Asp Lys Glu Glu Glu800 805 810GAA GAA GAA GAA GTA GCA GTA GTA GAA GAA GTA GTA GTA GAA GAA GAA2822Glu Glu Glu Glu Val Ala Val Val Glu Glu Val Val Val Glu Glu Glu815 820 825 830TGA ACGAA CTTGTGATCG CGTTGAAAGA TTTGAAGGCT ACATAGAGCT TCTTGACGTA 2880***TCTGGCAATA TTGCATCAGT CTTGGCGGAA TTTCATGTGA CAAAAGGTTT GCAATTCTTT 2940CCACTATTAG TAGTGCAACG ATATACGCAG AGATGAAGTG CTGCACAAAC ATATGTAAAA 3000TCGATGAATT TATGTCGAAT GCTGGGACGG GCTTCAGCAG GTTTTGCTTA GTGAGTTCTG 3060TAAATTGTCA TCTC3074SEQ ID No.2測序的分子cDNA名稱Solamum tuberosum(馬鈴薯)的beII基因(分支酶II)序列長度1393 bpT CTG CCA AAT AAT GTG GAT GGT TCT CCT GCA ATT CCT CAT GGG TCC AGA 49Leu Pro Asn Asn Val Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg1 5 10 15GTG AAG ATA CGT ATG GAC ACT CCA TCA GGT GTT AAG GAT TCC ATT CCT97Val Lys Ile Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp Ser Ile Pro20 25 30GCT TGG ATC AAC TAC TCT TTA CAG CTT CCT GAT GAA ATT CCA TAT AAT 145Ala Trp Ile Asn Tyr Ser Leu Gln Leu Pro Asp Glu Ile Pro Tyr Asn35 40 45GGA ATA TAT TAT GAT CCA CCC GAA GAG GAG AGG TAT ATC TTC CAA CAC 193Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile Phe Gln His50 55 60CCA CGG CCA AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA TCT CAT ATT 241Pro Arg Pro Lys Lys Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Ile65 70 75 80GGA ATG AGT AGT CCG GAG CCT AAA ATT AAC TCA TAC GTG AAT TTT AGA 289Gly Met Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val Asn Phe Arg85 90 95GAT GAA GTT CTT CCT CGC ATA AAA AAG CTT GGG TAC AAT GCG GTG CAA 337Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln100 105 110ATT ATG GCT ATT CAA GAG CAT TCT TAT TAT GCT AGT TTT GGT TAT CAT 385Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His115 120 125GTC ACA AAT TTT TTN GCA CCA AGC AGC CGT TTT GGA ACN CCC GAC GAC 433Val Thr Asn Phe Xaa Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Asp Asp130 135 140CTT AAG TCT TTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CTA GGA ATT GTT GTT CTC 481Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile Val Val Leu145 150 155 160ATG GAC ATT GTT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA GAT GGA CTG 529Net Asp Ile Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu165 170 175AAC ATG TTT GAC GGC ACA GAT AGT TGT TAC TTT CAC TCT GGA GCT CGT 577Asn Met Phe Asp Gly Thr Asp Ser Cys Tyr Phe His Ser Gly Ala Arg180 185 190GGT TAT CAT TGG ATG TGG GAT TCC CGC CTC TTT AAC TAT GGA AAC TGG 625Gly Tyr His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Asn Trp195 200 205GAG GTA CTT AGG TAT CTT CTC TCA AAT GCG AGA TGG TGG TTG GAT GAG 673Glu Val Leu Arg Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Asp Glu210 215 220TTC AAA TTT GAT GGA TTT AGA TTT GAT GGT GTG ACA TCA ATG ATG TAT 721Phe Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr225 230 235 240ACT CAC CAC GGA TTA TCG GTG GGA TTC ACT GGG AAC TAC GAG GAA TAC 769Thr His His Gly Leu Ser Val Gly Phe Thr Gly Asn Tyr Glu Glu Tyr245 250 255TTT GGA CTC GCA ACT GAT GTG GAT GCT GTT GTG TAT CTG ATG CTG GTC 812Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val260 265 270AAC GAT CTT ATT CAT GGG CTT TTC CCA GAT GCA ATT ACC ATT GGT GAA 865Asn Asp Leu Ile His Gly Leu Phe Pro Asp Ala Ile Thr Ile Gly Glu275 280 285GAT GTT AGC GGA ATG CCG ACA TTT TNT ATT CCC GTT CAA GAT GGG GGT 913Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Xaa Ile Pro Val Gln Asp Gly Gly290 295 300GTT GGC TTT GAC TAT CGG CTG CAT ATG GCA ATT GCT GAT AAA TGG ATT 961Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Ile Ala Asp Lys Trp Ile305 310 315 320GAG TTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA GTG GGT GAT ATT GTT1019Glu Leu Leu Lys Lys Arg Asp Glu Asp Trp Arg Val Gly Asp Ile Val325 330 335CAT ACA CTG ACA AAT AGA AGA TGG TCG GAA AAG TGT GTT TCA TAC GCT1057His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val Ser Tyr Ala340 345 350GAA AGT CAT GAT CAA GCT CTA GTC GGT GAT AAA ACT ATA GCA TTC TGG1105Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp355 360 365CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTT ATG GCT CTG GAT AGA CCN TCA1153Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser370 375 380ACA TCA TTA ATA GAT CGT GGG ATA GCA TTG CAC AAG ATG ATT AGG CTT1201Thr Ser Leu Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu385 390 395 400GTA ACT ATG GGA TTA GGA GGA GAA GGG TAC CTA AAT TTC ATG GGA AAT1249Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn405 410 415GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ATT GAT TTC CCT AGG GCT GAA CAA CAC1297Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala Glu Gln His420 425 430CTC TCT GAT GGC TCA GTA ATT CCC GGA AAC CAA TTC AGT TAT GAT AAA1345Leu Ser Asp Gly Ser Val Ile Pro Gly Asn Gln Phe Ser Tyr Asp Lys435 440 445TGC AGA CGG AGA TTT GAC CTG GGA GAT GCA GAA TAT TTA AGA TAC CGT1393Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Glu Tyr Leu Arg Tyr Arg450 455 460
權利要求
1.一種淀粉分支酶II(SBE II)的氨基酸序列，所說的氨基酸序列包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.淀粉分支酶II(SBE II)的氨基酸序列的片段。
3.按照權利要求2的片段，所說的片段具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的編碼馬鈴薯淀粉分支酶II(SBE II)的DNA序列，這種DNA序列包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和由于遺傳密碼的簡并性而形成的它的變體。
5.一種分離的編碼馬鈴薯淀粉分支酶II(SBEII)的DNA序列的片段。
6.按照權利要求5的片段，所說的片段包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
7.一種載體，這種載體包含權利要求4-6之任一項所要求的分離的DNA序列的全部或功能活性部分以及在馬鈴薯中有活性的調節元件。
8.按照權利要求7的載體，其中所說的DNA序列與正好位于其上游的啟動子呈相反(反義)方向。
9.一種產生轉基因馬鈴薯的方法，所說的馬鈴薯的支鏈淀粉的分支程度增加或減少，其特征在于該方法包括下列步驟a)將按照權利要求7的載體轉移并摻加到馬鈴薯細胞的基因組中；和b)由轉化細胞再生完整的植株。
10.一種產生轉基因馬鈴薯的方法，所說的馬鈴薯的支鏈淀粉的分支程度降低，其特征在于該方法包括下列步驟a)將按照權利要求8的載體轉移并摻加到馬鈴薯細胞的基因組中；和b)由轉化細胞再生完整的植株。
11.按照權利要求10的方法，其中所說的載體也包含淀粉分支酶I(SBE I)的反義構建體。
12.按照權利要求10或者11的方法，其中所說的載體也包含馬鈴薯顆粒結合淀粉合成酶II的反義構建體。
13.按照權利要求10-12的一個或多個的方法，其中所說的載體也包含馬鈴薯可溶性淀粉合成酶II和III的反義構建體。
14.按照權利要求10-13一個或多個的方法，其中所說的載體也包含馬鈴薯淀粉歧化酶(D-酶)的反義構建體。
15.按照權利要求10-14的一個或多個的方法，其中所說的載體也包含馬鈴薯淀粉脫支酶的反義構建體。
16.一種轉基因馬鈴薯，這種馬鈴薯是通過權利要求9-15任一之方法獲得的。
17.按照權利要求16的轉基因馬鈴薯在產生淀粉方面的用途。
全文摘要
本發明涉及馬鈴薯第二種淀粉分支酶的氨基酸序列(SBEⅡ)和它的片段以及相應的分離的DNA序列。并且,本發明涉及含有這種分離的DNA序列的載體、產生轉基因馬鈴薯的方法和所說的馬鈴薯在產生淀粉方面的用途。所獲得淀粉的支鏈淀粉的分支模式發生變化,并且直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例發生變化。
文檔編號A01H5/00GK1207125SQ9619951
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月28日 優先權日1995年11月29日
發明者B·愛克, J·科斯努迪, C－T·拉森, H·拉森, L·拉斯克 申請人:阿邁羅基因公司