專利名稱：調控馬鈴薯低溫糖化的蛋白和基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及ー個調控馬鈴薯低溫糖化的關鍵基因SbSnRKl a I及其應用。該基因在調節低溫貯藏的馬鈴薯塊莖低溫糖化程度方面具有顯著的功能，可以在馬鈴薯貯藏后炸片加工方面進行應用。
背景技術：
馬鈴薯油炸加工對塊莖品質的要求非常嚴格，除外觀品質外，更主要的是要求塊莖高淀粉含量和低還原糖含量低于O. 25%(鮮重)并耐低溫貯藏。原因在于，在油炸過程中，塊莖內的還原糖與氮化合物的α-氨基酸進行“ Mai I lard Reaction”致使薯片或薯條表面顔色加深，從而嚴重影響加工品質(屈冬玉等，2001)。為了延長加工周期以及抑制常溫貯藏導致的塊莖品質下降等現象，在馬鈴薯加工業中常將塊莖長期貯藏在低溫下。然而，低溫加速塊莖內淀粉裂解轉化還原糖(葡萄糖和果糖)，這種“低溫誘導的塊莖糖化”現象是大多數品種不適合加工的主要原因。因此，馬鈴薯塊莖低溫糖化的研究既有解釋低溫糖化代謝過程中的分子機理作用，又有對馬鈴薯低溫貯藏后加工的經濟應用價值。馬鈴薯塊莖低溫糖化主要是由于低溫改變了塊莖內淀粉-糖代謝的平衡，導致蔗糖在塊莖中累積，蔗糖又進ー步轉化為葡萄糖和果糖所致(Isherwood，1973)。研究表明，在此代謝途徑中轉化酶(Irwertase)是直接導致還原糖積累的關鍵酶。早在Uppal和Verma (1990)的研究中發現，低溫貯藏期間轉化酶活性與還原糖含量呈極顯著相關(r=0.821)。后續大量的研究同樣表明，低溫貯藏塊莖中轉化酶活性與還原糖含量顯著相關(Richardson et al. 1990; Cheng et al. 2004; McKenzie et al. 2005)。SnRKl (sucrose non-fermenting-l-re lated protein kinase 植物鹿糖非發酵-I相關蛋白激酶)作為植物蛋白激酶家族中ー個重要家族，其與酵母中SNFl (sucrosenon-fermenting-1, SNFl)和哺乳動物中的 AMPK(AMP_activated protein kinase, AMPK)同源并具有與它們相似和自身獨特的功能，在植物體內普遍存在三個亞家族。SnRKl在植物體內的研究今年來發展非常迅速，SnRK在植物的碳水化合物代謝和多種環境脅迫，ABA途徑，抗病抗逆，甚至產量和品質都是關鍵性的調節酶(Halford andHey 2009; Hey et al. 2010; Coello et al. 2011; Halford et al. 2011)。在馬鈴薯 中已經克隆到α，β亞組分別為StubSNFl和Gal83，馬鈴薯SnRKl與塊莖的萌發(Halfordet al. 2003)，淀粉積累，葡萄糖的含量下(McKibbin et al. 2006)密切相關并影響著糖代謝途徑中多種酶例如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的表達(Tiessen et al. 2003)。而關于SnRKl的互作蛋白也在逐漸深入研究中(Beczner et al. 2010; Shen et al. 2011)。但是在低溫糖化代謝過程中的影響卻未見相關文獻的報導，因此轉化酶，轉化酶抑制子與SnRKl各亞基蛋白之間的互作調控關系對低溫糖化的影響具有很好的生物學和經濟意義。

發明內容
本發明的SbSnRKl a I基因是以抗低溫糖化的野生種品系5 berthaultii的優質全長cDNA酵母雙雜交文庫為基礎，以轉化酶為鉺蛋白雜交此文庫篩選獲得的潛在互作蛋白候選基因之一。后續實驗證明SnRKl蛋白激酶a和0亞組(SbSnRKl a 1，StSnRKl^ I)和轉化酶，轉化酶抑制子之間存在一對一的特異選擇性互作關系，同時SbSnRKl a I對低溫糖化起到了極顯著的調節作用。該互作關系以及SbSnRKl a I對低溫糖化的影響在國內外尚均未有相關文獻的報導。
鑒于此，本發明的目的在于提供一種調控馬鈴薯低溫糖化的a 7基因和蛋白及其應用。為了實現上述目的，本發明第一個方面提供了一種SbSnRKl a I蛋白，它的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO:2所示。本發明的第二個方面提供了編碼該SbSnRKl a I蛋白的多核苷酸序列；其中優選的多核苷酸為SEQ ID NO: I。本發明的第三個方面提供了包含上述多核苷酸序列的表達載體；其中優選的表達載體是pMD18-T載體或pBIC載體。本發明的第四個方面提供了包含上述表達載體的細胞；其中優選的細胞是大腸桿菌DH5a或農桿菌LBA4404。本發明通過試驗研究發現，在不適宜低溫貯藏后炸片加工的馬鈴薯品系中超量表達SbSnRKl a I基因，可顯著提高該轉基因植株的抗低溫糖化的能力，降低低溫貯藏后的炸片色澤程度，使其4°C貯藏一個月后仍能基本達到商業加工的標準。經基因改良后的馬鈴薯品系，更加耐低溫貯藏，延長了從采后到炸片加工的低溫可貯藏時間。特別適用于馬鈴薯的油炸加工，從而有利于加工品種的改良，新加工品種的創建，商業化生產成本的降低以及原材料利用率的提聞。因此，本發明的第五個方面提供了上述的氨基酸序列SEQ ID N0:2或多核苷酸序列SEQ ID NO: I在馬鈴薯抗低溫糖化中的應用。與現有技術相比，本發明利用克隆的a 7基因在馬鈴薯中超量表達，超量mk SbSnRKl a I基因后可極顯著提高馬鈴薯低溫貯藏過程中的抗低溫糖化的能力。本發明通過在馬鈴薯體內超量表達該基因可以提高植物的抗低溫糖化能力，在馬鈴薯體內干涉該基因的表達可以使植物對低溫糖化更敏感。


圖I -.SbSnRKl a I基因超量表達載體構建流程圖。圖2 pBIC載體結構圖。圖3 ,SbSnRKl a I轉基因株系薯塊低溫4°C貯藏30天炸片色澤指數。圖4 ,SbSnRKl a I轉基因株系薯塊低溫4°C貯藏30天還原糖含量檢測。圖5 ,SbSnRKl a I轉基因株系薯塊低溫4°C貯藏30天轉化酶活性檢測。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明做出更詳細的描述。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。 本發明克隆的基因被命名為5^免欣7 σ 2，可以通過農桿菌介導的遺傳轉化方法或其他轉基因方法把基因轉入植物中，通過篩選鑒定獲得的轉基因植株或株系均屬于本發明的保護范圍。本發明通過在馬鈴薯體內超量表達該基因可以提高植物的抗低溫糖化能力，在馬鈴薯體內干涉該基因的表達可以使植物對低溫糖化更敏感，其在抗逆方面的應用均屬于本發明保護的范圍。I本發明SbSnRKl a I基因的克隆與序列分析
本發明中的基因是通過對構建的馬鈴薯抗低溫糖化野生種品系
S.berthaultii全長cDNA酵母雙雜交文庫以轉化酶為鉺蛋白分別進行雜交實驗所獲得的，發現該基因與轉化酶存在蛋白質-蛋白質互作關系。文庫酵母雙雜以及鑒定篩選結果證明，SbSnRKl 〃 2基因的RD區與轉化酶在酵母體內能實現蛋白質_蛋白質互作并呈現很高的陽性。設計擴增SbSnRKl σ 2基因全長cDNA序列引物
正向引物為5’ -ATGGACGGAACAGCAGTGCAAGGCA-3’
反向引物為5’ -AAGTACTCGAAGCTGAGCAAGAAAA-3，
通過PCR方法，從抗低溫糖化的馬鈴薯野生種品系5 berthaultii的塊莖cDNA中擴增出SbSnRKl α I全長cDNA序列。擴增方法為先用試劑盒(購自上海生エ公司，中國)抽提馬鈴薯塊莖總RNA，具體過程參見說明書，然后用反轉錄試劑盒(購自Τ0Υ0Β0公司，日本)將mRNA反轉錄為總cDNA，具體過程參見說明書，再以此為模板用以上正反向引物用LA酶(購自Takara公司，日本)擴增SbSnRKl α I基因的全長，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶后，用膠回收試劑盒(購自上海生エ公司，中國，具體過程參見說明書)回收目標條帶，克隆至PMD18-T載體(購自Takara公司，日本)，取5yL連接產物進行熱擊轉化大腸桿菌DH5ci感受態(參照J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)，涂布于新配置的含有氨節青霉素/異丙基_β -D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3- Π引哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固體平板上，37で培養過夜，挑選白斑若干，于含Amp 50 mg/L的液體LB培養基中，于37 0C 200 r/min振蕩培養過夜至渾濁，用引物PCR檢測菌液是否為陽性，送三個陽性克隆至華大基因生物技術公司完成測序工作。測序結果顯示，所克隆的SbSnRKl σ 7的cDNA全長為1545bp (見序列表中SEQ IDNO: I所示),編碼514個氨基酸(SEQ ID N0:2所示)。用GenBank的Blastn分析顯示，與已知的馬鈴薯StubSNFl(U83797. 4)的cds區域序列相似性有99 %，有17個堿基的不同。該蛋白質與馬鈴薯StubSNFl蛋白(NP_001233965. I)的氨基酸相似性同樣高達99 %，在分別在第286、334、438和462位有4個氨基酸的區別。預測該蛋白質分子量為58. 881KD，等電點為8. 61,用SignalP預測沒有找到序列前導序列或特殊區室革巴蛋白信號，Expasy蛋白結構預測的結果顯示無明顯跨膜區。 2 SbSnRKl a I基因的載體構建
在擴增的SbSnRKl a I基因的引物兩側分別加上及和feci酶切位點，隨后以已構建的pMD18-T載體為模板進行PCR擴增，并將擴增產物克隆重新至pMD18-T載體，具體步驟見本發明的SbSnRKl a I基因的克隆與序列分析部分。隨后以BernHl和feci雙酶切帶有目的基因全長的PMD18-T載體，同時以及麗TI和5^1雙酶切以塊莖優勢表達的啟動子CIPP替換了 35S啟動子的PBI121載體pBIC，各自的酶切產物經I %瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒(購自上海生工公司，中國)回收目標條帶，并將目的基因片段與pBIC載體大片段以0.8:1的比例混合，加入T4DNA連接酶(購自Takara公司)1U，I X反應緩沖液，無菌水補充至10 ii L體系，16°C鏈接10小時，取5 ii L連接產物進行熱擊轉化大腸桿菌DH5 a感受態，涂布于新配置的卡那(Km) 50 mg/L抗性平皿上篩選陽性克隆并酶切檢測。pBIC的載體圖以及超量表達載體構建流程見圖I和圖2。對獲得的重組質粒利用電轉化儀在1800V的電壓下轉化農桿菌LBA4404，用含利福平(Rif) 100mg/L，卡那(Km)50 mg/L的YEB固體抗性平皿篩選轉化陽性斑，挑取若干個陽性斑于含利福平(Rif)100mg/L，卡那(Km)50 mg/L的YEB液體培養基中28°C，150r/min培養4小時，取I y L做模板進行重組質粒的PCR陽性檢測，確認為陽性的菌株保存用于后續的遺傳轉化。3遺傳轉化
將生長7-9周、直徑0.5 cm左右的試管薯切成1-2 mm厚的薄片，在含有相應質粒的農桿菌菌液中浸泡10 min。浸染結束后取出薯片，用無菌濾紙吸干表面菌液。轉入灌有共培養培養基 A1(MS 基本培養基+3% 蔗糖+1 mg/L IAA+0. 2 mg/L GA3+0. 5 mg/L BA+2 mg/L ZT)的培養皿中，于24°C暗培養2 d。暗培養后，薯片再轉到灌有再生培養基A2 (Al+ 75 mg/LKam+400 mg/L Cef)的培養皿中，置于光照強度2000 lux,光周期16 h/d,溫度24°C的條件下培養直到抗性芽再生。待抗性芽長出達0.5-1 cm時，將其切下轉入生根培養基A3(MS基本培養基+3%蔗糖+50 mg/L Kam+200 mg/L Cef，pH 5. 8)，轉化成功的小芽因為有Kam抗性，能在A3上生根。4 SbSnRKl a I基因的功能鑒定
SbSnRKl a I基因在馬鈴薯抗低溫糖化方面的功能，申請人將13個超量基因轉基因株系(PS株系)和對照植株栽培種鄂馬鈴薯3號(Ep3)同時于2011下半年種植于華中蔬菜分中心基地同一個大棚中，每個株系種植24盆，植株長勢良好，薯塊成熟度高，轉基因株系在田間農業形狀上與對照并無顯著差異。取各轉基因株系單薯重>50g無病斑無機械損傷的塊莖分別在常溫20°C和低溫4°C下貯藏30天，進行油炸薯片和還原糖，轉化酶酶活等測定，每個時間點取3個生物學重復。對不同溫度不同貯藏時間下各超量表達株系與對照之間的的炸片色澤指數做比較，直觀的結果發現，，對照和轉基因株系之間20°C貯藏30天炸片色澤均無明顯差別。但是4°C貯藏下，各轉基因株系的炸片色澤均明顯低于對照株系Ep3，其中PS3，PS8，PS15表現尤 為明顯(圖3)。此結果表明超量表達a 7對低溫糖化均起到了非常明顯的抑制作用，使得原本不適用于低溫貯藏后炸片加工的栽培種Ep3獲得了貯藏I個月后仍能達炸片色澤指數較低的能力。
還原糖的含量測定結果顯示轉基因株系與対照的差異更為顯著，與對照相比，低溫貯藏下超量株系的各株系大多比對照明顯低(圖4)，其中PS3表現最為明顯，4°C 30天貯藏時還原糖含量下降程度超過90%，即低溫下轉基因株系中還原糖的積累速率非常慢，這也是炸片色澤很低的主要直接原因。同樣轉化酶酶活水平也顯示出來同樣的趨勢，4°C貯藏 過程中在超量株系中轉化酶的酶活極顯著低于對照(圖5)。實驗檢測結果證明，轉％免欣7ひ7基因的馬鈴薯在抗低溫糖化方面效果極其顯著，是ー個在馬鈴薯抗低溫糖化應用上非常有潛力的功能基因。
權利要求
1.StSnRKl α蛋白，它的氣基酸序列為序列表SEQ ID NO:2所不。
2.編碼StSnRKla蛋白的多核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于該序列為SEQID NO: I。
4.包含權利要求2或3所述多核苷酸序列的表達載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于它是PMD18-T載體或pBIC載體。
6.包含權利要求4或5所述表達載體的細胞。
7.根據權利要求6所述的細胞，其特征在于它是大腸桿菌DH5a或農桿菌LBA4404。
8.權利要求I所述的氨基酸序列SEQID N0:2在馬鈴薯抗低溫糖化中的應用。
9.權利要求2或3所述的多核苷酸序列SEQID NO: I在馬鈴薯抗低溫糖化中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一個調控馬鈴薯低溫糖化的關鍵基因StSnRK1α及其應用。克隆到與馬鈴薯低溫糖化顯著相關的基因StSnRK1α，該基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示。生物學功能驗證和轉基因株系表型證明，本發明的StSnRK1α基因在馬鈴薯抗低溫糖化中有顯著功效，為馬鈴薯抗低溫糖化的機理研究以及現有品種的改良提供了新的有效途徑。
文檔編號C12N1/21GK102634497SQ201210077910
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者劉勛, 宋波濤, 林原, 柳俊, 謝從華 申請人:華中農業大學