專利名稱：一種克隆植物減數分裂基因的方法和一種植物減數分裂基因的cDNA序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域。
本發明提供了利用簡并性引物通過嵌合式PCR克隆植物減數分裂基因的方法，提供了水稻減數分裂基因OsDMC1的cDNA序列及其編碼的蛋白質序列。
植物的生活史由有性世代和無性世代交替完成，減數分裂是完成這種交替的關鍵事件。減數分裂的重要特征是核DNA經過一次復制并伴隨兩次連續的細胞分裂，使最終形成的生殖細胞的染色體數減半。因此，雌雄性細胞受精形成的合子的染色體數能恢復到正常數量。在減數分裂過程中，染色體的正常分離依賴于合線期同源染色體精確配對形成二價體，而同源重組和聯會復合體是影響同源染色體配對的主要因素(Kleckner N.，Proc Natl Acad Sci.USA，1996，938167-8174；Zikler D.和Kleckner N.，Annu Rev Genet，1998，32619-697)。
酵母減數分裂基因DMC1已被克隆(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456)。DMC1是酵母減數分裂特異的基因，僅在減數分裂前期I表達，是減數分裂DNA重組和聯會復合體形成所必需的(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456；Bishop DK.，Cell，1994，791081-1092)。DMC1蛋白(Dmc1)是大腸桿菌(E.coli)RecA蛋白(recA)的同源蛋白，RecA蛋白能在DNA上聚合形成螺旋狀的DNA-蛋白質纖維，是一種DNA重組和修復蛋白(Story RM.等，Nature，1992，355318-324；Nature，1992，355374-376)。酵母dmc1突變體喪失DNA重組功能，不能形成聯會復合體，其減數分裂被阻斷在前期I(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456)。已從人(Habu T.等，Nucleic Acid Res，1996，24470-477)、鼠(Habu T.等，Nucleic Acid Res，1996，24470-477；Pittman DL.等，Mol Cell，1998，1697-705；Yoshida K.等，Mol Cell，1998，1707-718)等動物體內克隆到DMC1同源基因。人HsDmc1有與酵母Dmc1相似的功能(Li I.等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9411221-11226)，鼠MmDmc1是減數分裂同源染色體聯會必需的(Yoshida K.等，Mol Cell，1998，1707-718)。
在植物中，已克隆了雙子葉植物擬南芥的DMC1同源基因AtDMC1(KlimyukVI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4；Doutriaux MP.等，Mol Gen Genet，1998，257283-291)，報道了AtDMC1的DNA序列(登記號U43652)。T-DNA插入AtDMC1基因內，缺失AtDMC1的功能，完全破壞了減數分裂同源染色體配對能力，而對植株的營養生長無明顯影響，突變體的同源染色體不能配對形成二價體，減數分裂期的花粉母細胞和大胞子母細胞僅包含10個單價體，但該突變體能產生約1.5％的正常后代。本發明人認為，這是由于擬南芥染色體數少(5對)，染色體隨機分離組合形成了少數可育的雌雄配子。確切原因尚待研究(Couteau F.等，Plant Cell，1999，791081-1092)。該結果暗示，減數分裂基因DMC1的功能在植物中是保守的。
除AtDMC1外，在GenBank數據庫中報道了單子葉植物大麥DMC1同源基因的DNA序列(登記號AF234170)和雙子葉植物大豆DMC1同源基因的cDNA序列(登記號U66836)。但這僅僅是兩個基因序列報告，沒有分析基因的表達特性，不知它們是否是在生殖器官特異性表達以及基因結構特性，因此它們的可用性尚不確定。
從現有的數據已知，DMC1及其同源基因的DNA序列都含有內含子，例如，酵母DMC1有一個內含子，人HsDMC1有12個內含子，擬南芥AtDMC1有13個內含子。這些內含子在基因轉錄成成熟的mRNA時被剪切掉，mRNA僅包含了基因的外顯子序列。擬南芥是目前已知的基因組最小的植物，植株較小，容易用T-DNA誘導，也易于篩選由T-DNA插入的目的基因的突變體，但這種方法不適于其它植物基因功能的分析。除T-DNA外，反義RNA(或稱反義基因)技術是研究基因功能的另一重要與常用的技術。反義RNA技術是利用基因的cDNA序列，將其反向與植物表達載體上的啟動子連接。該重組載體被轉到植物體后產生與植物體內該基因正常(正義)mRNA互補的反義RNA，兩者結合形成二聚體，使正義mRNA不能翻譯成蛋白質，基因的功能隨之喪失。因此，用反義RNA技術比較容易獲得所需要的突變體，也不受植物物種的限制，應用廣泛。獲得的基因cDNA序列是進行反義RNA構建的首要條件。
通過計算機聯網檢索尚沒有發現可用于研究植物減數分裂基因功能的cDNA序列和與之相關的專利。
本發明的目的是提供一種利用簡并性引物MP1-MP4通過嵌合式PCR克隆植物減數分裂基因的方法，提供高等植物減數分裂基因的cDNA序列，以便通過轉反義基因技術調控植物的有性生殖。本發明的技術方案如下1)RNA的分離實驗材料為水稻。從水稻花粉母細胞減數分裂期的穎花中提取總RNA，隨后用無RNA水解酶的DNA水解酶除去RNA中殘留的DNA，得到無DNA污染的RNA。2)水稻DMC1同源基因cDNA片段的分離根據在酵母Dmc1和擬南芥AtDmc1中保守的氨基酸序列合成的簡并性引物MP1GGNATHAAYGCNGGNGAYGT；MP2GGNAARGTNGCNTAYATHGA；MP3ACNGCNACRTTRAAYTCYTCNGC和MP4GCRTGNGCNARNTGNCCNCC。以由RNA反轉錄的第一鏈cDNA作模板，通過嵌合式PCR(nested PCR)分離水稻DMC1同源基因的cDNA片段。引物對MP1和MP4用于第一輪PCR，而MP2和MP3用于第一輪PCR產物的再擴增。
第一輪PCR產物經第二輪再擴增后，得到一個cDNA片段。該片段經瓊脂糖電泳純化后，克隆到有關載體上并測序。此cDNA片段有一個連續的閱讀框(ORF)，編碼109個氨基酸，該氨基酸序列與酵母Dmc1和擬南芥AtDmc1相應序列的一致性分別為58％和91％，說明此cDNA片段是水稻DMC1同源基因cDNA序列的一部分。此水稻DMC1同源基因稱為OsDMC1。3)cDNA 3′和5′端的分離根據用嵌合式PCR分離得到的水稻OsDMC1 320bp的cDNA序列合成引物MP5CCGGCCTGAACGAATTGT、MP6TGGGATGGATGCCAATGC、MP7TCTCTCAGCAATCGGCACAA和MP8AACAGCATTGGCATCCAT。通過cDNA末端的快速擴增(RACEs)(Forhman MA.等，Proc Natl AcadSci USA，1988，858998-9002)分離OsDMC1 cDNA的3′和5′端。用RNA和寡聚-dT銜接頭(oligo-dT adapter)(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物合成第一鏈cDNA，隨后用基因特異的引物MP5、MP6和銜接頭引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)經兩輪PCR擴增得到OsDMC1 cDNA的3′端，通過瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到有關載體上并測序。
用基因特異的引物MP7與MP8和GIBCO-BRL 5′RACE試劑盒(GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，按試劑盒的說明書通過PCR擴增得到OsDMC1cDNA的5′端，通過瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到有關載體上并測序。
最后將320 bp cDNA序列、3′和5′端序列拼結成OsDMC1全長cDNA序列，如SEQ NO 1所示。4)OsDMC1的表達用非放射性的地高辛(DIG)標記的OsDMC1 cDNA探針，通過Northern印漬雜交分析OsDMC1在水稻穎花、葉、幼芽和根中的表達，檢測不到雜交信號。因此用RT-PCR Southern印漬雜交分析OsDMC1的表達。OsDMC1 cDNA特異的正義和反義引物分別是GTCCAAGCAGTACGACGAAGG和TTCCTCGACATGTGCAAAGT。以水稻微管蛋基因tubA作對照，所用的正義和反義引物分別是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
分別用來源于穎花、葉、幼芽和根的RNA合成第一鏈cDNA，以稀釋的第一鏈cDNA作PCR模板。PCR產物經1％的瓊脂糖電泳分離后，轉移到尼龍膜上，用DIG標記的OsDMC1 cDNA探針雜交。雜交結果顯示OsDMC1主要在穎花中表達，在根中有微量表達，而在葉和幼芽中不表達。該結果與擬南芥AtDMC1相似，RT-PCR分析結果表明AtDMC1在生殖器官中表達活性最高，在葉中有微量表達(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。而原位雜交和AtDMC1啟動子-GUS融合基因分析顯示AtDMC1僅在花藥和雌蕊的減數分裂細胞中表達。本發明人認為，造成其與RT-PCR結果差異的原因可能是RT-PCR過于靈敏的原因(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4)。5)OsDMC基因的特征OsDMC1 cDNA全長為1348 bp(SEQ NO 1))，由1035bp長的閱讀框(ORF)、45bp的5′端非翻譯區和268bp的3′端非翻譯區組成。閱讀框從核苷酸46開始到核苷酸1080結束，終止密碼是TGA。Poly(A)信號ACTAAA位于核苷酸1168-1173。Poly(A)位點在核苷酸1337。該cDNA編碼由344個氨基酸組成的蛋白質(OsDmc1)(SEQ NO 2)。OsDmc1的分子質量是37.6kD，等電點是5.53，其與酵母Dmc1、鼠MmDmc1、人HsDmc1和擬南芥AtDmc1氨基酸序列的同源性分別為51.8％、59.5％、60％和81.7％。OsDmc1含有在上述提及的Dmc1及其同源蛋白和其它NTP-結合蛋白中存在的ATP/GTP結合位點GXXXXGKT(OsDmc1氨基酸殘基133-140)。本發明人首次從OsDmc1中鑒定出基元(motif)LXXXGIXXXDXXK(氨基酸34-46)和LXXXKGXSXXKV(氨基酸66-77)，分析發現該基元在上述提及的Dmc1及其同源蛋白中是保守的，可能與OsDmc1在減數分裂中作用的特異性有關。本發明人首次發現OsDmc1有一個cAMP/cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點KRKS(氨基酸101-104)、一個酪蛋白激酶II磷酸化位點TGSD(氨基酸94-97)、一個酪氨酸激酶磷酸化位點KKLQDAGIY(氨基酸45-53)、五個蛋白激酶C磷酸化位點[TKK(氨基酸62-64)、SGK(氨基酸137-139)、TFR(氨基酸171-173)、SGR(氨基酸239-141)與TIR(氨基酸302-304)]和七個十四烷酰化位點[GINSGD(氨基酸38-43)、GIYTCN(氨基酸51-56)、GLSEAK(氨基酸71-76)、GGIETL(氨基酸121-126)、GMDANA(氨基酸185-190)、GMFITD(氨基酸282-287)與GIMDAK(氨基酸338-343)]。本發明的有益效果GenBank數據庫報道了擬南芥DMC1同源基因AtDMC1的DNA序列(登記號U43652)。研究表明，AtDMC1在生殖器官雄蕊和雌蕊中特異表達(KlimyukVI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4)。T-DNA插入突變AtDMC1，使之功能缺失，對植株營養生長無明顯影響，但導致減數分裂同源染色體不能配對，使雌雄性不育(Couteau F.等，Plant Cell，1999，791081-1092)。除AtDMC1外，GenBank數據庫還報道了單子葉植物大麥DMC1同源基因的DNA序列(登記號AF234170)和雙子葉植物大豆DMC1同源基因的cDNA序列(登記號U66836)，但這僅僅是兩個基因序列報告，沒有基因的表達分析，不知它們是否是在生殖器官特異性表達以及基因結構特性，因此其可用性尚不確定。
依據本發明人所掌握的資料，在克隆基因的方法上，本發明是第一個用兩對簡并性引物(MP1與MP4及MP2與MP3)、通過嵌合式PCR得到植物DMC1同源基因cDNA克隆。這說明所用的簡并性引物MP1-MP4正位于植物DMC1同源基因的外顯子區。由于是簡并性引物，該引物包含了編碼所對應氨基酸保守區的各種密碼組合，它們能用于分離所有植物DMC1同源基因的cDNA克隆。本發明所設計的引物、由其組成的引物組合和用該引物進行的嵌合式PCR適用于各種高等植物DMC1同源基因cDNA克隆的分離。
本發明報道的水稻減數分裂基因OsDMC1，是首例單子葉植物DMC1同源基因cDNA序列的報道。表達分析證明，該基因在生殖器官中特異(優勢)表達；用該cDNA序列進行的反義RNA分析證明OsDMC1控制水稻減數分裂同源染色體的配對，基因功能缺失導致雌雄性不育。因此它也是首例知道基因功能和表達特性的植物DMC1同源基因cDNA序列。OsDMC1編碼的蛋白質(OsDmc1)與已知功能的酵母Dmc1、鼠MmDmc1、人HsDmc1和擬南芥AtDmc1氨基酸序列的同源性分別是51.8％、59.3％、60％和81.7％，表明OsDMC1是水稻的減數分裂基因。鑒于此，本發明所報道的OsDMC1 cDNA可用于通過反義RNA等技術產生雄性不育、雌性不育或雌雄不育植株；也可用于生產雜交種子，以提高作物的產量；也可根據需要控制植物的育性，例如，使楊樹不育，以減少楊樹種子(白色的毛)對環境尤其是城市環境的污染。
具體實施例方式一、水稻OsDMC1 cDNA的分離1)RNA的分離用Trizol試劑盒(GIBICO-BRL，Life Technologies，USA)從花粉母細胞減數分裂期的穎花中提取總RNA，隨后用無RNA水解酶的DNA水解酶(TaRaKaBiotechnology(Dalian)Co.，Ltd)除去RNA中殘留的DNA。除去DNA后的RNA用于反轉錄合成第一鏈cDNA。2)cDNA片段的分離根據在酵母Dmc1和擬南芥AtDmc1中保守的氨基酸序列合成的簡并性引物MP1、MP2、MP3和MP4。以由RNA反轉錄的第一鏈cDNA作模板，通過嵌合式PCR分離OsDMC1的cDNA片段。引物對MP1和MP4用于第一輪PCR，而MP2和MP3用于第一輪PCR產物的再擴增。
為了合成第一鏈cDNA，將4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加無菌水使混合物體積達到12微升，70℃保溫10分鐘，轉至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉錄酶。
第一輪PCR反應混合物為20微升，含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1微升第一鏈cDNA，40pmol MP1，40pmolMP4，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術服務有限公司)。反應條件是94℃預變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，48-55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進行30個循環；最后在72℃保溫10分鐘。PCR產物經1％瓊脂糖電泳后呈淺的彌散狀。
第二輪PCR反應混合物為20微升，含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1微升第一輪PCR產物，40pmol MP2，40pmolMP3，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術服務有限公司)。反應條件是94℃預變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，48-55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進行30個循環；最后在72℃保溫10分鐘。第二輪PCR擴增后得到OsDMC1的320bp cDNA片段。該片段經瓊脂糖電泳純化后，克隆到pGEM-T載體(Promega Corporation，USA)上，測序。3)cDNA 3′和5′端的分離根據用嵌合式PCR分離的水稻OsDMC1的320bp cDNA序列合成引物MP5、MP6、MP7和MP8。通過cDNA末端的快速擴增方法分離OsDMC1 cDNA的3′和5′端。
對于3′的分離，將5微克RNA和10pmol寡聚-dT銜接頭(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物混合，加無菌水使混合物體積達到12微升，70℃保溫10分鐘，轉至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，LifeTechnologies，USA)，42℃反應50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉錄酶。該cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的體積50微升，含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％ Nonidet P-40，1微升cDNA，10pmol MP5，10pmol銜接頭引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術服務有限公司)。反應條件是94℃預變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，52-60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進行30個循環；最后在72℃保溫10分鐘。第二次PCR使用1微升第一次PCR的產物作模板和MP6與銜接頭引物對，其它條件與第一次PCR的相同。第二次PCR擴增后得到OsDMC1 cDNA的3′端cDNA片段，瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到pGEM-T載體上，測序。
對于OsDMC1 cDNA的5′端片段克隆，將5微克RNA與2.5pmol MP7混合，加無菌水使混合物體積達到12微升，70℃保溫10分鐘，迅速轉至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預熱2分鐘后，加入1微升 SuperScript II RNaseH-逆轉錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉錄酶。用GlassMax Cartridge(GIBCO-BRL，LifeTechnologies，USA)純化第一鏈cDNA，除去多余的引物。按GIBCO-BRL 5′RACE試劑盒(GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)的指導，在第一鏈cDNA的5′端加多聚G尾。加尾的cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的體積50微升，含10mM Tris-HCl，pH8.3、50mM KCl、2mM MgCl2、0.05％ Nonidet P-40、1微升加尾的cDNA、10pmol MP7、10pmol UAP引物、200uM dNTPs和2.5UPfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術服務有限公司)。反應條件是94℃預變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，52-60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進行30個循環；最后在72℃保溫10分鐘。第二次PCR使用1微升第一次PCR的產物作模板和MP8與UAP引物對，其它條件與第一次PCR的相同。第二次PCR擴增后得到OsDMC1 cDNA的5′端cDNA片段，瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到pGEM-T載體上，測序。
最后將320bp cDNA序列、3′和5′端序列拼結成全長的OsDMC1 cDNA序列(SEQ NO 1)。二、OsDMC1的表達分析用RT-PCR southern印漬雜交分析OsDMC1的表達。OsDMC1 cDNA特異的正義和反義引物分別是GTCCAAGCAGTACGACGAAGG和TTCCTCGACATGTGCAAAGT。以水稻微管蛋基因tubA作對照，所用的正義和反義引物分別是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
用來源于穎花、葉、幼芽和根的總RNA合成cDNA。將4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加無菌水使混合物體積達到12微升，70℃保溫10分鐘，轉至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉錄酶。稀釋100倍的cDNA用作PCR的模板。50微升的PCR反應混合物含1微升稀釋的cDNA模板、10pmol正義引物、10pmol反義引物、400μM dNTPs、1X GC PCR緩沖液和2.5U的LATaq DNA聚合酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)。PCR反應條件是94℃預變性1分鐘；94℃，1分鐘，55-60℃，1分鐘，72℃，1分鐘30秒鐘，25個循環；72℃，10分鐘。PCR產物經1％的瓊脂糖電泳分離后，通過毛細管作用轉移至Hybond N+尼龍膜上(Amershanm Pharmacia Biotech Ltd，EnGLand)，用DIG標記的OsDMC1 cDNA探針雜交(Boehringer Mannheim，Germany)。雜交結果顯示OsDMC1主要在穎花中表達，在根中有微量表達，而在葉和幼芽中不表達。該結果與擬南芥AtDMC1相似，RT-PCR分析結果表明AtDMC1在生殖器官中表達活性最高，在葉中有微量表達(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。而原位雜交和AtDMC1啟動子-GUS融合基因分析顯示AtDMC1僅在花藥和雌蕊的減數分裂細胞中表達，Klimyuk和Jones認為造成其與RT-PCR的結果差異的原因可能是RT-PCR過于靈敏(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。三、OsDMC1的功能分析1)PCR擴增所需的cDNA片段依據SEQ NO 1的OsDMC1 cDNA全序列，合成正義引物GACTGAGCTCGATGCTGGTATCTACACTTGC和反義引物CTGATCTAGATTCCTCGACATGTGCAAAGT。正義引物的5′端有一個SacI位點，反義引物3′端有一個XbaI位點，以便能將cDNA反向與啟動子連結。
用來源于減數分裂期穎花的RNA合成第一鏈cDNA。將4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加無菌水使混合物體積達到12微升，70℃保溫10分鐘，轉至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs，2微升0.1mMDTT，42℃預熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉錄酶。PCR反應混合物為50微升，含1X PCR緩沖液，1微升第一鏈cDNA，10pmol正義引物，10pmol反義引物，200uM dNTPs，2.5單位Taq DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術服務有限公司)，混合物在94℃預變性1分鐘，隨后在94℃，1分鐘，55-60℃，1分鐘和72℃，1分鐘30秒鐘，30個循環，最后在72℃延伸10分鐘。得到的cDNA長1015bp(核苷酸190至核苷酸1205)，覆蓋了近全長的閱讀框。將該cDNA片段連接到pGEM載體(Promega Corporation，USA)上，得到重組質粒pRCM30。2)用限制性內切酶XbaI和SacI在37℃分別雙酶切質粒pRCM30和pBI121(Clontech Laboratories，Inc，USA)，瓊脂糖電泳純化后，得到雙酶切的OsDMC1 cDNA片段和pBI121。用T4DNA連接酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)將cDNA片段連接到pBI121上，得到重組質粒pARM。在pARM中，OsDMC1 cDNA反向與CaMV35S啟動子連接。3)用限制性內切酶HindIII和EcoRI雙酶切pARM，瓊脂糖電泳純化后，得到CaMV 35S啟動子-OsDMC1 cDNA-NOS終止子的構建體，將該構建體與植物表達載體連接，獲得在植物中表達OsDMC1反義RNA的重組表達載體pAEM.。4)用農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織，經頭孢霉素和潮霉素篩選獲得抗性愈傷組織。將生長良好、結構致密的抗性愈傷組織轉至含潮霉素的預分化培養基培養兩周，隨后轉到含潮霉素的分化培養基進一步培養，得到潮霉素抗性的再生植株。5)用CTAB法(Murray和Thompson，Nucl Acid Res，1980，84321-4325)提取基因組DNA，通過PCR和Northern印漬雜交進一步檢測得到轉OsDMC1反義基因的植株。6)將轉基因水稻T1代自交種子在含潮霉素的培養基上發芽，在溫度28℃(白天)/25℃(夜間)和光照14小時/黑暗10小時條件下生長，10天后檢測抗性，并對轉基因植株后代分離比進行統計7)用I2-KI染色檢查轉基因植株花粉育性和最后觀測結實率，證明轉反義基因導致植株雌雄性不育。
附錄SEQ NO 1CGCCGGCCGCCTCCGCCTACAGGTGCGGGGGGTCTGTGTGAGCAGATGGCGCCGTCCAAGCAGTACGACGAAGGCGGGCAGCTCCAGCTCATGGATGCAGAGAGGATCGAGGAGGAGGAGGAGTGCTTCGAGTCCATCGACAAGTTAATCTCGCAAGGGATAAACTCTGGAGATGTGAAGAAGCTGCAGGATGCTGGTATCTACACTTGCAATGGCCTCATGATGCATACAAAGAAGAGCCTGACAGGAATCAAGGGATTATCTGAAGCAAAGGTAGACAAGATCTGTGAAGCAGCTGAAAAGCTTCTGAGCCAGGGCTTCATGACAGGAAGTGATCTCCTTATCAAGCGGAAGTCTGTTGTTCGGATCACCACTGGGAGCCAGGCACTTGATGAGCTGCTTGGCGGAGGGATTGAAACACTCTGCATCACAGAGGCATTTGGAGAGTTCCGATCAGGGAAGACCCAGTTGGCTCACACTCTATGTGTCTCCACTCAGCTTCCAATTCACATGCATGGGGGGAATGGGAAGGTCGCTTATATCGATACTGAGGGAACATTCCGGCCTGAACGAATTGTGCCGATTGCTGAGAGATTTGGGATGGATGCCAATGCTGTTCTTGATAATATCATATATGCTCGTGCATACACCTATGAGCACCAGTACAACCTTCTCCTTGGCCTTGCCGCTAAGATGGCTGAAGAGCCTTTCAGGCCTCTGATTGTGGATTCTGTGATCGCACTATTCCGTGTCGATTTCAGTGGCAGGGGTGAACTTGCAGAGCGCCAGCAAAAATTGGCACAGATGCTCTCCCGCCTTACTAAAATAGCTGAGGAGTTCAATGTTGCAGTGTACATCACCAACCAAGTGATTGCCGACCCAGGTGGTGGAATGTTCATAACTGACCTGAAAAAACCAGCGGGAGGCCACGTGCTGGCGCATGCAGCTACCATCCGGTTGATGCTGAGGAAAGGCAAAGGAGAGCAGCGTGTCTGCAAGATCTTTGATGCCCCTAACCTGCCTGAGGGAGAAGCTGTTTTCCAGGTAACATCAGGTGGAATAATGGATGCGAAAGACTGAATGTTCATTGAGGGTGCTTCCTGTCTTCAAATTATTCAGGTTTCTCCTAGTAAATTCCTGCATAGGCCATATAGGTTTGGTACATTGACTAAACTACTACTGCTACTTTGCCACTGTCGAGGAAATATGCAACCTCATTTATCCAGACGATTATACCTTAAAATGGGTATTTTTCTATGCTTATGAGATCAACAGTTGTACTGAAACAAATACAGTATTGGCTTAAGTGAAAATATATAAGAGGGTTACATGATGGTAAAAAAAAAAASEQ NO 21MAPSKQYDEG GQLQLMDAER21IEEEEECFES IDKLISQGIN41SGDVKKLQDA GIYTCNGLMM61HTKKSLTGIK GLSEAKVDKI81CEAAEKLLSQ GFMTGSDLLI101KRKSVVRITT GSQALDELLG121GGIETLCITE AFGEFRSGKT141QLAHTLCVST QLPIHMHGGN161GKVAYIDTEG TFRPERIVPI181AERFGMDANA VLDNIIYARA201YTYEHQYNLL LGLAAKMAEE221PFRPLIVDSV IALFRVDFSG241RGELAERQQK LAQMLSRLTK261IAEEFNVAVY ITNQVIADPG281GGMFITDLKK PAGGHVLAHA301ATIRLMLRKG KGEQRVCKIF321DAPNLPEGEA VFQVTSGGIM341DAKD
權利要求
1.一種克隆基因的方法，其特征在于用兩對簡并性引物通過嵌合式PCR方法克隆基因；
2.權利要求1的方法，其中所說的基因為植物減數分裂基因；
3.權利要求1的方法，其中所說的簡并性引物包括MP1、MP2、MP3和MP4。其各自的序列為MP1GGNATHAAYGCNGGNGAYGT；MP2GGNAARGTNGCNTAYATHGA；MP3ACNGCNACRTTRAAYTCYTCNGC和MP4GCRTGNGCNARNTGNCCNCC
4.權利要求3的方法，其特征在于簡并性引物中的MP1與MP4進行第一輪PCR，簡并性引物中的MP2與MP3和以上述第一輪PCR的產物作模板進行第二輪PCR；
5.用權利要求1的方法所獲得的一種水稻減數分裂基因OsDMC1的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列具有如SEQ NO 1所示的核苷酸1到1348的序列；
6.權利要求5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的部分序列；
7.權利要求5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的同源序列；
8.一種多肽序列，其特征在于該多肽序列是由權利要求5的cDNA序列所編碼，且具有如SEQ NO 2所示的氨基酸1到344的序列；
9.權利要求8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的部分序列；
10.權利要求8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的同源序列；
11.一種反義RNA(基因)構建體，其特征在于該構建體根據權利要求5至7的任何一種核苷酸序列所構建。
12.權利要求11的反義RNA(基因)構建體，其中所說的反義RNA(基因)構建體可用于轉化植物以控制植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
13.權利要求11的反義RNA(基因)構建體，其中所說的反義RNA(基因)構建體可用于生產雜交種子；
14.權利要求11的反義RNA(基因)構建體，其中所說的反義RNA(基因)構建體可用于使楊樹不育，以減少楊樹種子對環境的污染；
15.權利要求11的反義RNA(基因)構建體，其中所說的反義RNA(基因)構建體能夠轉化單子葉植物，以控制該植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
16.權利要求11的反義RNA(基因)構建體，其中所說的反義RNA(基因)構建體能夠轉化水稻，以控制該植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
17.權利要求11的反義RNA(基因)構建體，其中所說的反義RNA(基因)構建體能夠轉化雙子葉植物，以控制該植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性。附錄SEQ NO 1CGCCGGCCGCCTCCGCCTACAGGTGCGGGGGGTCTGTGTGAGCAGATGGCGCCGTCCAAGCAGTACGACGAAGGCGGGCAGCTCCAGCTCATGGATGCAGAGAGGATCGAGGAGGAGGAGGAGTGCTTCGAGTCCATCGACAAGTTAATCTCGCAAGGGATAAACTCTGGAGATGTGAAGAAGCTGCAGGATGCTGGTATCTACACTTGCAATGGCCTCATGATGCATACAAAGAAGAGCCTGACAGGAATCAAGGGATTATCTGAAGCAAAGGTAGACAAGATCTGTGAAGCAGCTGAAAAGCTTCTGAGCCAGGGCTTCATGACAGGAAGTGATCTCCTTATCAAGCGGAAGTCTGTTGTTCGGATCACCACTGGGAGCCAGGCACTTGATGAGCTGCTTGGCGGAGGGATTGAAACACTCTGCATCACAGAGGCATTTGGAGAGTTCCGATCAGGGAAGACCCAGTTGGCTCACACTCTATGTGTCTCCACTCAGCTTCCAATTCACATGCATGGGGGGAATGGGAAGGTCGCTTATATCGATACTGAGGGAACATTCCGGCCTGAACGAATTGTGCCGATTGCTGAGAGATTTGGGATGGATGCCAATGCTGTTCTTGATAATATCATATATGCTCGTGCATACACCTATGAGCACCAGTACAACCTTCTCCTTGGCCTTGCCGCTAAGATGGCTGAAGAGCCTTTCAGGCCTCTGATTGTGGATTCTGTGATCGCACTATTCCGTGTCGATTTCAGTGGCAGGGGTGAACTTGCAGAGCGCCAGCAAAAATTGGCACAGATGCTCTCCCGCCTTACTAAAATAGCTGAGGAGTTCAATGTTGCAGTGTACATCACCAACCAAGTGATTGCCGACCCAGGTGGTGGAATGTTCATAACTGACCTGAAAAAACCAGCGGGAGGCCACGTGCTGGCGCATGCAGCTACCATCCGGTTGATGCTGAGGAAAGGCAAAGGAGAGCAGCGTGTCTGCAAGATCTTTGATGCCCCTAACCTGCCTGAGGGAGAAGCTGTTTTCCAGGTAACATCAGGTGGAATAATGGATGCGAAAGACTGAATGTTCATTGAGGGTGCTTCCTGTCTTCAAATTATTCAGGTTTCTCCTAGTAAATTCCTGCATAGGCCATATAGGTTTGGTACATTGACTAAACTACTACTGCTACTTTGCCACTGTCGAGGAAATATGCAACCTCATTTATCCAGACGATTATACCTTAAAATGGGTATTTTTCTATGCTTATGAGATCAACAGTTGTACTGAAACAAATACAGTATTGGCTTAAGTGAAAATATATAAGAGGGTTACATGATGGTAAAAAAAAAAASEQ NO 21MAPSKQYDEG GQLQLMDAER21IEEEEECFES IDKLISQGIN41SGDVKKLQDA GIYTCNGLMM61HTKKSLTGIK GLSEAKVDKI81CEAAEKLLSQ GFMTGSDLLI101KRKSVVRITT GSQALDELLG121GGIETLCITE AFGEFRSGKT141QLAHTLCVST QLPIHMHGGN161GKVAYIDTEG TFRPERIVPI181AERFGMDANA VLDNIIYARA201YTYEHQYNLL LGLAAKMAEE221PFRPLIVDSV IALFRVDFSG241RGELAERQQK LAQMLSRLTK261IAEEFNVAVY ITNQVIADPG281GGMFITDLKK PAGGHVLAHA301ATIRLMLRKG KGEQRVCKIF321DAPNLPEGEA VFQVTSGGIM341DAKD
全文摘要
本發明提供了利用簡并性引物通過嵌合式PCR克隆植物減數分裂基因的方法,提供了水稻減數分裂基因OsDMCl的全長cDNA序列及其編碼的氨基酸多肽序列。該cDNA序列全長1,348 bp,編碼344個氨基酸的多肽。該cDNA可用于構建反義基因構建體。利用該構建體可控制植物的有性生殖。
文檔編號C12N15/10GK1351168SQ0013008
公開日2002年5月29日 申請日期2000年10月27日 優先權日2000年10月27日
發明者王臺, 丁兆軍 申請人:中國科學院植物研究所