一種植物發光轉基因方法及發光仙人球的制作方法
【專利摘要】本發明提出一種植物發光轉基因方法，其包括步驟：熒光素酶基因群PCR擴增；熒光素酶基因群與pM-18T載體的構建；基因測序；融合基因轉入大腸桿菌，測序；目的基因與表達載體的連接；特定啟動子與表達載體的構建；融合基因轉入農桿菌；將基因及熒光素的合成前提物一起轉入植物；以及進行轉代篩選穩定發光植物體。本發明還提出利用上述的轉基因方法獲得的發光仙人球。本發明的植物發光轉基因方法可以實現發光植物的產業化，增強園林景觀效果，開發旅游生態園，促進花卉產業的大發展；同時，利用發光植物造景還可減少花園景觀持續的照明用電的需求，減少能源消耗。
【專利說明】一種植物發光轉基因方法及發光仙人球
【技術領域】
[0001]本發明涉及生命科學【技術領域】，特別涉及一種植物發光的轉基因技術，以及由此技術獲得的一種轉基因發光仙人球。
【背景技術】
[0002]在自然界，能發光的生物包括某些細菌、甲殼動物、軟體動物、昆蟲和魚類，但能發光的植物卻不多見。基因工程的發展使科學家了解到，生物冷光也是由DNA分子中的基因協調控制的，基因工程學家已能把發光基因導人植物細胞中，培育出夜晚能發磷光或螢光的植物。
[0003]首開記錄的是美國紐約洲奧本大學的植物病理學家，他們為了更好地研究甘藍的軟腐病，特意把發光細菌的磷光基因轉移到病原體黃單飽菌中，使它成為能發光的病囷，然后讓它感染一片甘監葉，在暗室中用特制的夜視攝像機逐一拍下細囷在葉脈中移動的情況，由此看出病菌是怎樣感染植物體的。
[0004]把發光基因導入樹木細胞中，培育出夜晚能發光的樹，是基因工程學家努力的又一個目標。在美國，很多生物學家正致力發光樹的研究，他們把熒光基因先導入植物細菌有高度感染力的農桿菌體內，使農桿菌發光，然后用它感染樹木細胞原生質體，把發光基因整合到葉的質粒中，再通過組織培養誘導成幼苗，培育夜晚能發光的樹。但是都沒有獲得真正的成功。
[0005]能催化熒光素或脂肪醛氧化產生生物發光的一類酶為熒光素酶(Luciferase)。從20世紀50年代就已經有人開始了對發光素酶的研究。1954年，有人從哈氏弧菌中提取并純化出細菌熒光素酶；1967.年，有人對從費氏弧菌中提取出的熒光素酶的結構和反應原理進行了分析。1956年，螢火蟲發光素酶被提取出來，在1970年，這種螢火蟲發光素酶的結構第一次被測定了。而從1986年，表達螢火蟲發光素酶基因(Iuc基因)的轉基因煙草第一次被成功地獲得以來，發光素酶的應用和發展進入了一個嶄新的時代。
[0006]目前對螢火蟲發光素酶(Firefly Luciferase, FL)的研究最多，它的應用范圍極廣。它可從北美螢火蟲(Photinus pyralis)、日本螢火蟲(Luciclacr uciata)、北京螢火蟲(Pyrococelia pekinensis)等多種螢火蟲中提取出來。不像細菌突光素酶有兩個多肽鏈白組成，螢火蟲熒光素酶是由單一的多肽鏈組成，而且不同種類的螢火蟲提取出的螢火蟲發光素酶的相對分子質量和結構都各有差異。由北美螢火蟲提取出的蟲發光素酶的相對分子質量約為62ku，是由551個氨基酸殘基構成的含有大量的疏水氨基酸殘基的單一多肽鏈。而從日本螢火蟲提取出的蟲發光素酶的相對分子質量約為61ku,含有548個氨基酸殘基。
[0007]目前，熒光素合成的基因也已經發現幾個，但未能發現合成熒光素的全部基因。
[0008]目前轉基因發光植物實驗還未能真正成功，原因在于熒光素的合成基因還沒有全面找到。
[0009]熒光素(如圖1所示的熒光素的分子結構圖)是發光的關鍵底物，轉入熒光素酶的轉基因植物因缺乏熒光素而不能發光，轉基因植物怎樣獲得熒光素是關鍵。目前有兩個方法:一個是把熒光素的合成基因一起轉入植物中，讓其自身合成，但因合成熒光素的個別基因沒有找到，該方法目前走不通；另一個是由植物吸收熒光素，但因熒光素水溶性差，無法吸收，有的噴灑或侵泡，但都不能真正有效的解決這個問題。

【發明內容】

[0010]針對現有技術的問題，本發明提出一種植物發光轉基因方法，把已發現的熒光素合成基因與熒光素酶基因一起轉入仙人球中，把合成熒光素的水溶性的半成品的氨基酸加入水中，讓植物吸收，就能最終合成熒光素，從而獲得真正意義上的發光植物。
[0011]具體的，本發明的所述的一種植物發光轉基因方法包括如下步驟:熒光素酶基因群PCR擴增；熒光素酶基因群與PM-18T載體的構建；基因測序；融合基因轉入大腸桿菌，測序；目的基因與表達載體的連接；特定啟動子與表達載體的構建；融合基因轉入農桿菌(電轉化法)；將基因及熒光素的合成前提物一起轉入植物；以及進行轉代篩選穩定發光植物體。
[0012]根據本發明的另一目的，本發明還提出一種利用上述的轉基因方法獲得的發光仙人球。
[0013]本發明的植物發光轉基因·方法可以實現發光植物的產業化，增強園林景觀效果，開發旅游生態園，促進花卉產業的大發展；同時，利用發光植物造景還可減少花園景觀持續的照明用電的需求，減少能源消耗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中:
[0015]圖1所示為熒光素的分子結構圖；
[0016]圖2所示為本發明的植物發光轉基因方法的步驟流程圖。
【具體實施方式】
[0017]參見圖2所示的為本發明的植物發光轉基因方法的步驟流程圖，所述方法包括步驟:
[0018]螢火中熒光素酶基因群PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)擴增；
[0019]熒光素酶基因群與pM-18T載體的構建；
[0020]基因測序；
[0021]融合基因轉入大腸桿菌，測序；
[0022]目的基因與表達載體的連接；
[0023]特定啟動子與表達載體的構建；
[0024]利用電轉化法將融合基因轉入農桿菌；
[0025]將基因及熒光素的合成前提物一起轉入植物；以及
[0026]進行轉代篩選穩定發光植物體。[0027]本實施例中的螢火中突光素酶為由北美螢火蟲(Photinus pyralis)提取出的螢火蟲熒光素酶，其是由551個氨基酸殘基構成的單一多肽鏈。把該基因與熒光素合成的相關基因群一起轉入仙人球中，把合成熒光素的水溶性的半成品(氨基酸類似物)加入水中，讓植物吸收，就能最終合成熒光素，從而獲得發光仙人球。
[0028]植物在黑暗中發出亮光的情節富有浪漫氣息，頗具吸引力，令人回味無窮。人們對植物和鮮花照亮夜晚的可能性充滿了期待，這是一個具有驚人市場潛力的市場。主要表現在:
[0029]1、發光植物必可撼動花卉業，相信它們將在此行業占據主導地位，消費者在戶內或私人花園中或婚慶看到活的植物發出亮光，那必將賞心悅目；
[0030]2、發光植物技術可以增強園林景觀效果，以此開發旅游生態園。此技術可以用于一年生和多年生景觀和花壇植物，皆可形成獨特而美麗的景觀效果；發光產品也將使季節性展覽受益，其前景廣闊；
[0031]3、用發光植物造景或許還有助于節電，可減少花園景觀持續的照明用電的需求。
[0032]利用本發明的方法獲得的轉入熒光素酶基因及熒光素合成的相關基因的仙人球，能在黑夜中發出明亮的熒光，而在白晝看不到；雖然發光總體上偏弱，但已經證明本發明的技術方案在實際應用中的可行性。應該說，本發明的技術方案已經為上述的發光植物市場打開了大門，并可帶來此領域的可以預見的大力發展。
[0033]本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。.
【權利要求】
1.一種植物發光轉基因方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:螢火中熒光素酶基因群PCR擴增；熒光素酶基因群與PM-18T載體的構建；基因測序；融合基因轉入大腸桿菌，測序；目的基因與表達載體的連接；特定啟動子與表達載體的構建；利用電轉化法將融合基因轉入農桿菌；將基因及熒光素的合成前提物一起轉入植物；以及進行轉代篩選穩定發光植物體。
2.一種利用權利要 求1所述的植物發光轉基因方法獲得的發光仙人球。
【文檔編號】C12N15/82GK103436554SQ201310396243
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】顧洪雁 申請人:無錫添然農林科技有限公司