專利名稱：轉基因禽類的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種制備轉基因禽類尤其是轉基因雞的方法。
轉基因動物是近年來才發展起來的生物高技術。通過這一技術可以使外源基因導入動物基因組中，而使這種轉基因動物具有新的特性。如快速生長、抗病、抗逆，以達到培育優良新品種的目的；或者導人外源基因改變體內基因的結構，使動物和人的某些遺傳疾病得以治療。或者培育在動物體中表達外源蛋白的動物，即“動物生物反應器”。要達到上述目的，轉基因動物制備方法是首要的問題。
與哺乳動物胚胎相比，雞的受精卵有卵黃包圍，位于胚盤中央。當從受精到產出時已經過24小時，發育到九至十階段。此時的細胞數目多達60000-80000個，進行外源DNA的注射顯然是太晚了，根本不能與細胞中染色體整合。因而轉基因雞技術和轉基因哺乳動物相比更加困難。在80年代初，Grittenden等人(1989，Theor.Appl.Genet.77，505-515)用反轉錄病毒，即禽白血病病毒(ALY)作載體，感染剛產出的受精卵的胚盤，使外源基因通過病毒的感染而插入到雞的染色體中，得到了轉基因雞。后來許多人也得到同樣的結果，但這一方法具有很多缺點，如插入基因的長度受到限制，制備高效感染病毒也很困難。另外，用病毒作載體得到的轉基因雞，使人們立即想到，這種雞本身是否染上了這種病毒，對它產生了排斥心理，很難為世人所接受。到90年代以后，這種方法就逐漸為其它方法所代替。
Naito.M等人(荷蘭阿姆斯特丹第XIX界世界禽類大會論文集1518-522，1992年9月22-24日)將帶β-肌動蛋白啟動子的β-半乳糖苷酶(LacZ)基因，用顯微注射法，注入單細胞階段雞受精卵胚盤中。263個注入外源基因的蛋4日的成活率為48.7％，孵化率為11.8％。得到了19只公雞和6只母雞，并達到性成熟，取其血液和精液進行分析，得到兩只DNA陽性的公雞，為了測定兩只公雞所帶DNA是否能轉至它們的后代，用這兩只公雞與母雞交配。其中一只公雞(W-9266)得到75只后代，另一只公雞(W-9237)得到34只后代。但經測定在這些后代中沒有發現外源DNA存在。
英國愛丁堡AFRC Roslin研究所Love，J.等人(Bio/Technology，1994，1260-63)首次報道了他們的研究成果。他們將帶有報道基因的質粒DNA微注射入雞受精卵的胚盤中，體外培養12小時后分析存活的胚胎，發現近一半胚胎含有質粒DNA，在所有組織分析中，有6％相當于每個細胞有一個拷貝。有7只小雞(占注射受精卵總數的5.5％)成活至性成熟，其中一只未滿一年的小公雞將3.4％的外源DNA傳給其后代。這些雞達到性成熟，并繁殖了子代轉基因雞，這一實驗證實了微注射能將外源DNA穩定地導入種系中。
Rottmann.O.J(J.Anim.Breed.Genet.1992，10964-70)將新采集的雞精液，用Krebs Ringer溶液洗滌3次，取1ml精子懸浮液(120×106精子)與500μl脂質體懸液混合，脂質體含有質粒DNA。在37℃下保溫30分鐘，混合物用作人工授精。每只母雞輸入100μl精子-脂質體懸液，每日早上收集雞蛋，在37℃下孵化12天。經過12天孵化的雞胚中，對其中158個進行了外源DNA分析，有41個(26％)含有外源基因。但進一步研究證實，DNA沒有完全整合到雞胚染色體中，而是處在“游離”狀態。Rottmann.O.J(J.Anim.Breed.Genet.1996，113401-11)進行了類似的試驗，結果只在12天雞胚中檢測到外源基因，而在青年雞或成年雞體內未檢測到外源基因的存在，由于這一方法操作簡單，很可能成為生產大批轉基因的方法。
從上述可見，顯微注射法技術難度高，成功率低；逆轉錄法難以為公眾接受；精子載體法尚未完全成功；嵌合體法得到的不是真正的轉基因雞。制備真正的轉基因禽類特別是轉基因雞尚需深入的研究和努力。
本發明的目的就在于提供一種新的轉基因禽類的制備方法，其特點是方法簡便、操作簡單、易于應用和推廣，導入率高，整合率高。
本發明描述了一種適用于將外源基因或DNA序列導入基因組中以制備包括雞、鴨、鵝和鵪鶴等轉基因禽類的方法。本方法采用了將外源DNA(或基因)包埋在中空螺旋狀的脂質體中，再與精子共同孵育，使脂質體與精子融合，隨后電擊，增加精子膜的通透性，使DNA進入精子細胞內。再用此帶有外源基因的精子給母雞(禽)進行人工授精。最終DNA將隨受精過程進入卵細胞，達到導入外源基因的目的。
具體地，本發明方法包括如下步驟1)制備脂質體/外源DNA混合液，即將脂質體和外源DNA按一定比例混合在室溫孵育45分鐘備用；2)采集新鮮精液，經處理后與上述步驟1)的脂質體/外源DNA液混合，在室溫孵育45分鐘備用；3)125uF/300V電擊步驟2)的混合物后，立即給雌禽輸精，收集48小時后所產禽蛋；4)用步驟3)的禽蛋孵化雛禽，采血提取DNA，檢測外源DNA的整合，具有外源DNA整合的禽類即為轉基因禽類。
在本發明方法步驟1)中，外源DNA和脂質體的比例為1∶4。所述外源DNA可以是任何希望轉入禽類體內的基因或DNA序列，在本發明的實施例中以含有報道基因β-半乳糖苷酶基因的表達載體pOVΔβ和pOVβ(其構建見實施例，詳見本發明人的中國專利申請99122092.7)為例說明了本發明轉基因禽類制備方法的有效性。所用脂質體可以是任何市售的產品，例如Boehringer Mannheim公司的產品。脂質體是多陽離子化合物，與DNA有很高的親和性，本領域廣泛應用。
在本發明方法的步驟2)中，精子處理方法是用等體積的精液稀釋液洗滌精子，并在3000轉/分離心5分鐘；再用2倍體積的精液稀釋液懸浮精子。所述的精液稀釋是任何能保持精子活性的緩沖液，例如本發明的實施例中采用如下配方的精液稀釋液每100毫升稀釋液含0.8g D-果糖(C.P.)，1.92g谷氨酸鈉，0.5g無水醋酸鉀，0.032g硫酸魚精蛋白和0.3g聚乙烯氯戊環酮(分子量10000)，pH6.4，滲透壓為300-320mOs/kg。經步驟2混合精液后，外源DNA與精子比例為每1毫升精液內含15-20微克外源DNA。
另外，本領域熟練技術人員還應理解的是，本發明方法步驟3)中，輸精量根據不同的禽類等可發生變化，例如每只禽輸入精液/外源DNA混合液0.05-010毫升。
本發明方法步驟4)中用于檢測外源DNA的整合的方法可以是本領域已知的任何方法，例如PCR法和Southern印跡法。本領域技術人員應理解的是PCR法所用引物和Southern印跡法所用探針應特異于所導入的外源DNA或基因。
本發明的轉基因禽類制備方法使基因能進入禽的基因組中，該方法所用的載體不含有任何有害病毒成分，完全是在禽類自然受精的狀態下進行的。根據所用外源基因的設計，可用這種方法培育優質、高產、特殊用途的禽類。也可以提供禽類生物反應器，在禽類的器官、組織或是蛋中含有的外源目的蛋白，并可用于分離提純的目的。
以下參照附圖和實施例對本發明進行詳細描述，其中


圖1為表達質粒pCMVβ示意圖。
圖2為表達質粒pOVβ示意圖。
圖3為表達質粒pOVΔβ示意圖。
實施例1本例中使用表達質粒pOVΔβ，按本發明方法進行了轉基因試驗。其中，表達質粒pOVΔβ是將含報道基因β-半乳糖苷酶基因(β-gal)的市售質粒pCMVβ(
圖1，Promega公司產品)經HindIII和SalI酶切后再自連接為pCMVβΔ，pCMVβΔ隨后經PstI和SmaI酶切打開一缺口，用T4連接酶在缺口處插入事先制備好的雞卵清蛋白啟動子(OV)而得到，該質粒的具體構建過程詳見中國專利申請99122092.7。
制備轉基因禽類的具體步驟如下
取50微克pOVΔβ質粒DNA溶于200微升無菌蒸餾水中，慢慢加至200微升(相當于200微克)脂質體(Boehringer Mannheim公司產品，產品號1781995)中，混勻，于室溫孵育45分鐘備用；采集雞精液3毫升，加3毫升精液稀釋液(每100毫升稀釋液含0.8g D-果糖(C.P.)，1.92g谷氨酸鈉，0.5g無水醋酸鉀，0.032g硫酸魚精蛋白和0.3g聚乙烯氯戊環酮(分子量10000)，pH6.4，滲透壓為300-320mOs/kg)，用吸管輕輕吹打均勻，室溫下3000rpm離心5分鐘，倒掉上清，精子重新懸于6毫升精液稀釋液中，將所得液體與上述質粒DNA/脂質體溶液混合，室溫孵育45分鐘；上述混合物用Bio-Rad公司的電脈沖儀(Genepulser)經125uF/300V電擊后，立即給100只母雞進行人工輸精，收集48小時后所產雞蛋，連續收集3天；用所收集的雞蛋孵化出189只雛雞，30天后采血，常規方法提取DNA，以引物OVFWD和BetaRev經PCR法分析法檢測外源基因的整合。OVFWD和BetaRev序列如下OVFWD 5＇-TTA CTG TTG TAG TAG CCT ACC ATA G-3＇BetaRev5＇-CCA CAG ATG AAA CGC CGA GGT AA-3＇PCR測定的結果如表1所示表1F1代PCR測定結果
總整合率為5.29％實施例2本例中使用表達質粒pOVβ，按本發明方法進行了轉基因試驗。其中，表達質粒pOVβ是將pOVΔβ用BamHI酶切，去掉SV40片段后再插入事先制備的雞卵清蛋白基因3＇端646bp片段而得到。該質粒的具體構建過程詳見中國專利申請99122092.7。
除了使用pOVβ外，其余操作同實施例1，PCR測定結果如下表2表2F1代PCR測定結果
總整合率為5.91％
權利要求
1.一種制備轉基因禽類的方法，其特征在于包括如下步驟1)制備脂質體/外源DNA混合液，即將脂質體和外源DNA按一定比例混合在室溫孵育45分鐘備用；2)采集新鮮精液，經處理后與上述步驟1)的脂質體/外源DNA液混合，在室溫孵育45分鐘備用；3)125uF/300V電擊步驟2)的混合物后，立即給雌禽輸精，收集48小時后所產禽蛋；4)用步驟3)的禽蛋孵化雛禽，采血提取DNA，檢測外源DNA的整合，具有外源DNA整合的禽類即為轉基因禽類。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的禽類為雞。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中DNA和脂質體比例為1∶4，孵育時間為45分鐘。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中精子處理方法是用等體積的精液稀釋液洗滌精子，并在3000轉/分離心5分鐘；再用2倍體積的精液稀釋液懸浮精子。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中外源DNA與精子比例為每1毫升精液內含15-20微克外源DNA。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其中輸精量為每只禽輸入精液/外源DNA混合液0.05-010毫升。
全文摘要
本發明描述了一種適用于將外源基因或DNA序列導入基因組中以制備包雞、鴨、鵝和鵪鶉等的轉基因禽類的方法。本方法采用了將外源DNA(或基因)包埋在中空螺旋狀的脂質體中,與精子共同孵育,使脂質體與精子融合,再加之電擊,增加精子膜的通透性,使DNA進入精子細胞內。再用此帶有外源基因的精子給雌禽進行人工授精。最終DNA將隨受精過程進入卵細胞,達到導入外源基因的目的。
文檔編號C12N15/87GK1372791SQ0110437
公開日2002年10月9日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年2月28日
發明者李建凡, 梁志清, 王小珂 申請人:中國農業科學院畜牧研究所, 香港大學, 北京實驗動物研究中心