專利名稱：表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法
技術領域：
本發明涉及一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，英文簡寫IB)具有急性、高度接觸性傳染特點，是危害全球養雞業最嚴重的傳染病之一，由感染傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，英文簡寫IBV)引起。盡管常規疫苗對控制病害的毀滅性流行發揮了重要作用，但在疫苗接種范圍愈來愈廣，防疫密度愈來愈高(90％以上)，免疫接種量不斷加大的今天，并沒有使上述疾病得到根本控制。但IB的流行形式發生了改變，已由大規模發生轉變為地區性散發，病變類型也由典型或單一病變型轉成非典型或多病變型，甚至在免疫動物群體中也屢屢發生。目前，該疾病每年經濟損失仍達數十億美元，由此可見，IB仍是當今危害全球養雞業最嚴重的傳染病，是全球雞病防治的重中之重。
有效控制IB的流行，選擇疫苗進行。目前廣泛使用的傳染性支氣管炎疫苗依制作工藝不同分弱毒疫苗和滅活疫苗兩類。在控制傳染性支氣管炎的流行起了非常重要的作用。但是，應該指出，在使用弱毒疫苗或滅活疫苗過程中還存在著一些問題有待解決1)安全性問題弱毒活疫苗存在免疫不全、疫苗外源性或垂直傳播性病原污染以及疫苗接種動物后毒力返強的危險。
2)滅活疫苗價格昂貴滅活疫苗由于抗原需要量大，制備成本高，造成價格長期居高不下。
3)滅活疫苗接種較麻煩，需注射，且引起局部疼痛和其它不適等。
IBV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈RNA病毒、核苷酸總長約27.6kb。病毒在復制過程中以RNA(-)為模板合成A、B、C、D、E、F六種mRNA，這些mRNA具有相同的聚腺苷酸化的3’末端形成的巢狀結構，在基因組的5’端存在一個由60bp組成的先導序列；mRNA A、mRNA C、mRNA E分別編碼病毒的N蛋白、M蛋白、S蛋白三種主要的結構蛋白。IBV的致病性、抗原性主要與S蛋白相關。S蛋白可進一步裂解為S1和S2蛋白。IBV的致病性及抗原性主要由S1蛋白的功能來體現。不同IBV病毒株因S基因，尤其是S1基因的變異，造成IBV致病特性發生改變。IBV毒株抗原性變異的氨基酸替換大都發生在S1蛋白；S1蛋白存在可被中和性McAb識別的結構依賴性抗原表位。IBV的致病性及抗原性主要由S1蛋白的功能來體現。
在IB新型疫苗研究方面，Tomley等用痘苗病毒表達IBV的S1蛋白免疫小鼠后，用ELISA和氣管環中和試驗證實其表達產物具有反應原性和免疫原性；Song等用昆蟲桿狀病毒表達的IBV S1蛋白免疫雞后可良好的免疫應答反應。
基因工程研究領域的最新進展使植物表達外源基因成為可能。含有外源基因的植物細胞可再生出完整植株。并將外源基因穩定地遺傳給后代。迄今有些單子葉和雙子葉植物都已進行了成功的轉化。例如煙草、馬鈴薯、番茄、大豆和玉米等。
農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的雙子葉植物轉化已有眾多報道。農桿菌介導的葉盤轉化法可有效地進行基因轉移、選擇和再生。
單子葉植物經農桿菌介導轉化比較困難，但也可以利用其它的轉化方法如PEG和電融合法。有人成功地將外源基因導入玉米、水稻和小麥的原生體質體中。然后從轉化的原生質體再生出完整的植株。一些新的轉化方法如微管注射法和基因槍法在單子葉植物轉化和再生中可能更加有效。
植物是一種多樣化、低成本和可再生的材料資源，而生物技術的迅速發展則進一步拓寬了植物的使用范圍，國外在植物中采用這種“分子農業”的方法，已經成功地生產了越來越多的有用物質，其中包括一些高價值藥用蛋白多肽，如人的細胞生長因子、促紅細胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等，一些研究機構和公司已經開始從這些藥物蛋白的生產中獲得巨大的經濟效益。
特別值得指出的是，1998年4月，美國國家過敏癥和傳染病研究所(NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID)首次報道了人食用轉基因馬鈴薯后體內能夠產生針對大腸桿菌熱不穩定毒素B亞基的特異性抗體。這一研究結果清楚地表明(1)在植物中高效表達一些病原蛋白基因是可行的。
(2)病原蛋白在植物中可完成翻譯后加工過程，如糖基化和高級結構的空間折疊，從而使這些重組蛋白多肽與天然蛋白具有相同的免疫原性，這是原核生物表達系統無法比擬的，后者無法對源自真核生物的蛋白進行糖基化。
(3)植物中產生的抗原蛋白可安全地通過動物的消化道而不會被胃蛋白酶降解，原因是它們能夠與腸粘膜細胞膜表面上的糖蛋白分子受體結合并刺激動物機體產生免疫應答。這類蛋白也被稱謂粘膜性抗原(mucosal immunogen)，但并不是所有的蛋白都具有這種能力，現僅發現少數病毒和細菌含有這種抗原。
(4)研究也證實了粘膜性抗原只需要少量蛋白，就可以產生良好的免疫應答反應，并不比肌肉注射所需要量大。
這些研究結果預示植物將成為繼微生物發酵系統和動物細胞培養系統之后又一個新的蛋白表達系統。

發明內容
本發明的目的是提供一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法。
一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法，其特征在于它的的步驟如下1)傳染性支氣管炎病毒S1或S蛋白抗原基因的植物表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S構建以傳染性支氣管炎病毒毒株核酸為模板，PCR擴增獲得傳染性支氣管炎病毒S1或S基因被直接定向插入到質粒pBlueScriptSK(+)中的相應位點內，得到質粒pBS IBV/S1或pBS IBV/S，然后pBS IBV/S1或pBS IBV/S用限制性內切酶Xba I和BamH I雙酶切可將S1或S基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質粒pBI 121 GUS基因位點上(Xba I和BamH I雙酶切)便構建成雙元表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S。
2)表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S經三親交配法導入到具有較強感染能力的農桿菌菌株EHA105中；3)農桿菌介導的植物遺傳轉化農桿菌介導的植物遺傳轉化是將經過預培養的馬鈴薯無菌苗外植體與含有表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S的農桿菌EHA105共培養后在抗性愈傷組織誘導的培養基上誘導形成抗性愈傷組織，抗性愈傷組織在分化培養基上分化出抗性芽，抗性芽生根培養基上生根發育成完整的再生植株。
4)用PCR、Southern-blot、Northern-blot確定轉基因植株；5)不同轉基因馬鈴薯植株傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白含量的測定用ELISA方法測定轉基因馬鈴薯植株傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白含量，獲得表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因植株；6)表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因植物的田間繁殖和培育。
根據權利要求1所述一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法，其特征在于所說的馬鈴薯的遺傳轉化方法的步驟如下1)預培養在無菌條件下取無菌苗，用手術刀把馬鈴薯切成0.3-0.5cm長度的莖段，接種到愈傷誘導固體培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成的基礎培養基上添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l，蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，pH5.8的平板上面，在光照強度為2000Lx，光照時間為16h/天，溫度為24±2℃條件下預培養2-3天。2)含表達載體的農桿菌轉化從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5ml含抗生素Km50-100μg/ml YEP液體培養基中，在28℃條件下振蕩培養16-24h，取100μL含抗生素Km50-100μg/ml菌液接種到5ml液體培養基中，繼續振蕩培養到OD600為0.4-0.5，大約3-4h。無菌條件下把菌液轉移到1.5mleppendorf中，12000rpm離心20sec，去除上清夜，菌體用液體的MS基礎培養基重新懸浮到OD600為0.1-0.3。3)共培養將經過預培養的外植體進入菌體懸液中作用5min，取出外植體，用滅菌濾紙吸干，立即放置在鋪有一層滅菌濾紙的愈傷組織誘導培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成基礎培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，pH5.7上于黑暗中共培養2-3天。4)洗滌和抗性愈傷組織的誘導將已共培養的馬鈴薯外植體用無菌水漂洗3-5次，用滅菌濾紙吸干，接種到含抗性愈傷組織誘導的培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成基礎培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l，Carb250-500mg/l，pH5.7-5.8平板上。在溫度為24±2℃，光照強度2000Lx，光照時間為16h/天下培養7-9天。基本上外植體可見明顯的愈傷組織生長。5)植株再生將愈傷組織連同外植體一起轉移到芽分化培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成基礎培養基+ZT 2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l，上，隔2周換一次培養基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生長到2-3厘米時，將其切下轉接到含Kan 50-100mg/l，Carb 250-500mg/l生根的固體培養基上，7天左右開始生根，20天左右成為完整的植株。
本發明專提供了一種利用植物表達系統生產傳染性支氣管炎病毒纖突蛋自(S1蛋白和S蛋白)抗原的方法，具有以下優點(1)更安全轉基因植物中除只增加了傳染性支氣管炎病毒重組抗原蛋白外，沒有改變植物其它的遺傳組成，因此，它絕不會含有對動物有害的成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。
(2)價格更低廉因為它不需要純化和冷藏，抗原蛋白的生產可能只是簡單地種植農作物，因此可大大降低生產成本。
(3)使用更方便接種方式只是簡單地飼喂含有該抗原蛋白的植物組織，這種接種方式非常適用于中國或其它國家。
本發明專提供了一種高效的馬鈴薯遺傳轉化方法，其外植體愈傷形成率達成100％，愈傷外植體分化率達90％以上，比國內外報道的馬鈴薯再生體系高得多，且再生周期短。這為轉基因馬鈴薯的獲得奠定良好的基礎。
本發明提供了表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因植株。用這些表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因植物直接飼喂雞或用轉基因植物中純化出的傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白作為注射劑注射給藥的方式免疫雞，引起了對該抗原蛋白的免疫應答反應，說明轉基因表達產物具有良好的免疫原性，為轉基因植物生產傳染性支氣管炎疫苗打下基礎。


圖1是轉基因植株傳染性支氣管炎病毒S1基因的PCR鑒定M1kb DNAMarker；CK非轉基因馬鈴薯；2，3，5，7，8，10轉化馬鈴薯植株示意圖；圖2是轉基因植株傳染性支氣管炎病毒S1基因的Southern Blot鑒定CK非轉基因馬鈴薯；2，3，5，7，8，9轉化馬鈴薯植株示意圖，S1IBV S1基因；圖3是S1蛋白轉基因馬鈴薯的RNA分析CK未轉基因馬鈴薯；1，2，3，5，77，8，C1，D1轉基因馬鈴薯示意圖；圖4是轉基因植株傳染性支氣管炎病毒S基因的PCR鑒定M1kb DNAMarker；14非轉基因馬鈴薯；1-13轉化馬鈴薯植株示意圖；圖5是轉基因植株傳染性支氣管炎病毒S基因的Southern Blot鑒定CK+IBV S基因；CK-非轉基因馬鈴薯；1-6轉化馬鈴薯植株示意圖；圖6是S蛋白轉基因馬鈴薯的RNA分析CK未轉基因馬鈴薯；1，2，3，4，5轉基因馬鈴薯示意圖；
圖7是轉基因馬鈴薯在田間的生長示圖；圖8是轉基因馬鈴薯示意圖。
具體實施例方式
已有傳染性支氣管炎病毒弱毒活疫苗和滅活疫苗可供利用的情況下，有必要尋找其它新的更加安全和廉價的抗原蛋白生產途徑。利用轉基因植物生產疫苗用抗原重組蛋白是一種較好的選擇，它可能為人類和動物抵御各種傳染性疾病提供了一條新途徑。本發明提供一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的植物遺傳轉化及生產方法和表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯，為利用轉基因植物生產動物疫苗打下基礎。
本發明提供了一種轉傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白基因的轉基因植物的生產方法，它包括以下步驟1.構建一個質粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2.用質粒載體或上述DNA片段轉化植物細胞；3.從轉基因植物細胞中再生出完整的轉基因植物；4.不同轉基因馬鈴薯植株傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白含量的測定；5.食用一定量的這種轉基因植物或注射提純的表達產物，以達到預防疾病的效果。按照一個優先的實施方案，含有抗原蛋白的完整轉基因植物或其某些食用部分可直接進行冷凍、干燥和粉碎，以便加工成其它制劑，并確定其中含有的抗原蛋白數量。
本發明提供了一種馬鈴薯的遺傳轉化體系，其抗性愈傷組織誘導的培養基為基礎培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l，Carb250-500mg/l，pH5.7，其分化培養基為基礎培養基+ZT2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l實施例11.傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原植物表達載體pBIibv/S1構建如圖1所示，以傳染性支氣管炎病毒ZJ971毒株核酸為模板，根據已知的傳染性支氣管炎病毒cDNA核酸序列[26]合成特定的引物，并通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得了傳染性支氣管炎病毒S1基因。因為在5’端和3’端引物中分別引入了Xba I和BamH I位點，所以擴增片段經Xba I和BamH I雙酶切后，被直接定向插入到質粒pBlueScriptSK(+)中的相應位點內。得到質粒pBSIBV/S1，然后通過核苷酸測序，其序列見文后。
質粒pBS IBV/S1含有傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原基因，用限制性內切酶Xba I和BamH I雙酶切可將S1基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質粒pBI 121 GUS基因位點上(Xba I和BamH I雙酶切)便分別構建成雙元表達載體pBIibv/S1。
質粒pBI 121購自美國Clonetech公司，它的Xba I和BamH I限制性內切酶位點分別位于花椰菜花葉病毒35S啟動子和GUS基因起始密碼之間以及GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質粒pBI 121是因為用Xba I和BamH I雙酶切可將GUS基因刪除，而隨后可插入另外一個蛋白基因。新基因將能夠在植物細胞內表達。質粒pBI 121還含有新霉素磷酸轉移酶II基因(NPT II)，它編碼的酶可為植物細胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細胞和組織篩選出來。NPT II基因有自己的啟動子和多聚腺酸信號序列，它們源自胭脂堿(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
質粒pBIibv/S1含有1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供給植物細胞卡那霉素抗性；2)傳染性支氣管炎病毒S1抗原基因及操縱該基因的花椰菜花葉病毒35S啟動子；3)T-DNA左右邊界序列，它可將NPT II基因和傳染性支氣管炎病毒S1、S抗原蛋白抗原基因轉移到植物體內并整合到植物染色體中。pBIibv/S1的結構如圖2所示。
2.將表達載體pBIibv/S1導入根癌農桿菌(A.tumefaciens)含有傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原基因的質粒pBIibv/S1通過三親交配的方式轉移到根癌農桿菌EHA105菌株中，該菌株購自美國Clonetech公司。菌株EHA105現已被廣泛應用是因為它是一改造后的農桿菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已經被刪除。Vir基因可反式調節T-DNA自質粒pSS2L向植物細胞內的轉移。
農桿菌在含有25mg/L鏈霉素50ml YEP培養基中振蕩培養，在OD600nm值達到0.4-0.7時，4000g離心收集細菌細胞，將農桿菌細胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的YEP培養基中待用。含有表達載體pBIibv/S1的DH5α和含有輔助質粒pRK2013的HB101分別接種在含有500mg/L卡那霉素50ml LB培養基中振蕩培養，在OD600nm值達到0.4-0.7時，4000g離心收集細菌細胞，然后將細胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的LB培養基中待用。取上述三種細胞懸浮液各200μL，置于同一1.5ml離心管中，28℃靜置培養過夜，取該培養物5-10μL，均勻涂抹在YEP固體培養基平板上，該培養基中同時含有25mg/L鏈霉素和50ml/L卡那霉素，28℃培養2天后，含有質粒pBIibv/S1質粒的農桿菌菌落開始產生。
用堿裂解法從農桿菌中提取質粒DNA，并用限制性內切酶酶切可檢測pBIibv/S1質粒DNA是否存在。
3.農桿菌介導的植物遺傳轉化植物的遺傳轉化首先是植物組織器官或細胞與農桿菌共培養，在培養約2天后，將植物外植體移置相應的選擇培養基中。植物外植體可以是原生質體、愈傷組織或其它器官組織，因植物而異。選用帶葉子的器官是最常用的方法。
葉片轉化主要依據Horsch等人的方法。馬鈴薯無菌苗[品種為東農3號]，浙江省種子公司提供]保存在24±2℃光照培養箱中，輔之以2000Lx光照強度，每隔2個星期剪取頂端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固體培養基中，生長2星期的葉片最適于轉化。
馬鈴薯均以莖段進行轉化為最好。含有表達載體pBIibv/S1的農桿菌EHA105接種在5ml YEP培養基(含100μg/ml卡那霉素)中28℃培養16-24h，取100μL菌液接種到5ml(抗生素Km 100μg/ml)液體培養基中，繼續振蕩培養到OD600為0.4-0.5(大約3-4h)。無菌條件下把菌液轉移到1.5mleppendorf中，12000rpm離心20sec，去除上清夜，菌體用液體的MS基礎培養基重新懸浮到OD600為0.1-0.3。
將經過預培養的外植體進入菌體懸液中作用5min，取出外植體，用滅菌濾紙吸干，立即放置在鋪有一層滅菌濾紙的愈傷組織誘導培養基上于黑暗中共培養2天。
將已共培養的馬鈴薯外植體用無菌水漂洗3-5次，用滅菌濾紙吸干，接種到含抗性愈傷組織誘導的固體培養基平板上。在溫度為24±2℃，光照強度2000Lx，光照時間為16h/天下培養7天。基本上外植體可見明顯的愈傷組織生長。
將愈傷組織連同外植體一起轉移到芽分化培養基上，隔2周換一次培養基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生長到2-3厘米時，將其切下轉接到生根的固體培養基上(Kan 100mg/l，Carb 500mg/l)，7天左右開始生根，20天左右成為完整的植株。
植株再生將愈傷組織連同外植體一起轉移到芽分化培養基即基礎培養基+ZT2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l上，隔2周換一次培養基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生長到2-3厘米時，將其切下轉接到含Kan 50-100mg/l，Carb250-500mg/l生根的固體培養基上，7天左右開始生根，20天左右成為完整的植株。
4.表達傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因工程植株的PCR篩選和Sorthern雜交印跡轉基因植物傳染性支氣管炎病毒S蛋白基因的PCR檢測0.1g植物組織用液氮于研缽中快速研磨呈粉末。將粉末轉入一小離心管中，加入3倍體積(W/V)的提取緩沖液(500mM NaCl，50mM Tris.HCl pH8.0，50mMEDTA，1％(V/V)2-巰基乙醇)。解凍后放置于冰上，加入冰冷的20％存貯液聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至終濃度為6％，加入固體SDS至終濃度為2％(W/V)，輕輕混勻之后于65℃水浴10分鐘。加入1/10的5M醋酸鉀(Kac)于冰上反應30分鐘，4℃15000rpm離心10分鐘。取上相轉入一新的離心管，加入0.6倍體異丙醇，倒管混勻3次，再置于冰上10分鐘。4℃15000rpm離心10分鐘，去上相。沉淀物抽真空或室溫吹干后，溶解于500μL 1×TE(PH8.0)。用1倍體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，重復三次。離心(12000rpm，10分鐘，20℃)，取上相，轉入一新離心管。加入1倍體積的異丙醇(20℃，5分鐘)，并將管至少顛倒5次，4℃15000rpm離心10分鐘，用70％乙醇沖洗沉淀物，65℃干燥30分鐘最后溶于20μL TE中。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR檢測。結果發現再生植株均能擴增出1.6kb左右的帶子，如圖1.傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因的Sorthern雜交印跡檢測采用CTAB法，參照F.奧斯伯著，顏子穎等譯《精編分子生物學實驗指南》，并略作改進，在CTAB提取液中加入PVP至終濃度為3％，操作步驟1)稱取5g葉片材料，在液氮中將組織研磨成粉末；2)將粉末組織轉移到一個50ml的離心管中，加入20ml的CTAB提取緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.7mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1％CTAB，20mmol/L的2-巰基乙醇)，溫和混勻；3)65℃保溫10～60min，間或輕彈管底，使其充分混勻；4)用等體積的24∶1氯仿/異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合，于4℃7500rpm離心10min，回收上(水)相；5)在回收的上層相中，加入1/10體積的65℃的CTAB/NaCl的溶液，顛倒混勻；6)用等體積的氯仿/異戊醇抽提，混勻，離心，回收上(水)相；7)加入正好1倍體積的沉淀液，顛倒混勻，如果沉淀可見，繼續做步驟8，否則于65℃溫育30min；8)于4℃，2500rpm離心5min；
9)移出上清，但不要丟棄，用高鹽的TE緩沖液重懸沉淀(每克起始材料0.5-1ml)，如果沉淀難于重懸，于65℃溫育30min，重復直至所有的或大部分沉淀溶解；10)加入0.6體積的異丙醇沉淀核酸，充分混勻，于4℃，7500rpm離心15min；11)用80％乙醇洗滌沉淀物，干燥，用盡可能少的緩沖液重懸(每克起始材料0.1-0.5ml)。
用限制性內切酶EcoRI酶切植物基因組DNA，于37℃水浴中反應2，電泳分離DNA片段，在轉移到尼龍膜上后，以α-32P標記的S1蛋白核酸編碼序列作為探針進行雜交。結果發現，外源基因已轉入植物基因組內，拷貝數為1-3，如圖2.
5.S1蛋白轉基因馬鈴薯的RNA分析剪取馬鈴薯植株100mg在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol抽提液，放置5分鐘；加入200μl的氯仿，室溫放置2-3分鐘4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清液。加入600μl的異丙醇，室溫放置10分鐘；4℃，12000rpm離心10分鐘，棄去上清液；加1ml 75％酒精輕洗RNA沉淀；4℃，12000rpm離心5分鐘棄去上清，沉淀溶解在30μl DEPC處理的水中。RNA的濃度通過測定OD260和OD280值予以估算。
將0.2g瓊脂糖熔于12.42ml DEPC水，熔化后加入4ml 5×甲醛凝膠電泳緩沖液和3.58ml 37％甲醛溶液，混勻后倒膠；凝膠預電泳5min，5μl RNA提取液中加入20μl滅菌的并經DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液(含溴化乙錠)，70℃處理10min后將樣品加至凝膠加樣孔；3-4V/cm電壓下電泳。DEPC處理水漂洗凝膠數次，核酸通過毛細管法轉移到尼龍膜上，轉膜16-20小時。
將含有靶DNA的硝酸纖維素濾膜漂浮于6×SSC的液面上，濕潤膜裝入雜交爐中，按每平方厘米的硝酸纖維素濾膜加入0.2ml的預雜交液，68℃旋轉保溫1-2h；將標記好的探針于100℃加熱變性5min加入預雜交液中，68℃雜交16-20h；雜交結束后，取出膜并隨即將其置于盛有200ml 2×SSC(含0.5％SDS)盤內，于室溫浸泡5min；膜轉移至200ml 2×SSC(含0.1％SDS)，室溫保溫15min。更換新配的0.1×SSC(含0.5％SDS)溶液，37℃保溫30至60分鐘，68℃的水浴溫育60min。手提式小型探測器檢測膜上的放射性活度。用0.1×SSC于室溫短暫漂洗濾膜后，將濾膜置于一疊紙巾上以除去大部分液體；放射自顯影和Typhoon檢測儀(Apharmacia公司)檢測放射信號。結果發現，外源基因均能轉錄，但轉錄水平不一樣，如圖3.
6.不同轉基因馬鈴薯植株傳染性支氣管炎病毒S1蛋白含量的測定轉基因和非轉基因馬鈴薯塊莖用液氮研磨成粉末，加可溶性總蛋白提取液(1.0g塊莖/ml)再研磨5min，4℃放置20分鐘后把勻漿倒入離心管中，12000rpm，離心5min，上清即為馬鈴薯塊莖提取物。Bradford和ELISA方法測定蛋白質的含量。結果發現，傳染性支氣管炎病毒S1蛋白含量占轉基因馬鈴薯塊莖可溶性總蛋白的0.08-0.22％.
7.表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因植物的繁殖和培育在篩選出穩定表達傳染性支氣管炎病毒S1蛋白的轉基因馬鈴薯植株后，為生產該抗原蛋白必須大量繁殖該轉基因植株。馬鈴薯是通過營養繁殖的，因此，可通過扦插的方法，在短時間內便可獲得大量幼苗和微型薯。然后用這些幼苗或微型薯在田間大量繁殖，得轉基因馬鈴薯。如圖7-8.
8.轉基因馬鈴薯傳染性支氣管炎病毒S1基因表達產物對動物的保護不同劑量的轉基因馬鈴薯分別接種SPF雞，分離接種后不同時間的雞血清，氣管中和試驗測定血清中和抗體效價，免疫雞用傳染性支氣管炎病毒強毒攻擊后可獲得優良的保護。表2表2.雛雞免疫后的中和抗體效價和有效保護率

實施例21.傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白抗原植物表達載體pBIibv/S構建如圖所示，以傳染性支氣管炎病毒(H52毒株)核酸為模板，根據已知的傳染性支氣管炎病毒cDNA核酸序列(26)合成特定的引物，并通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得了傳染性支氣管炎病毒S蛋白基因。因為在5’端和3’端引物中分別引入了Xba I和BamH I位點，所以擴增片段經Xba I和BamH I雙酶切后，被直接定向插入到質粒pBlueScriptSK(+)中的相應位點內。得到質粒pBS IBV/S，然后通過核苷酸測序，其序列見文后。
質粒pBS IBV/S分別含有傳染性支氣管炎病毒S蛋白抗原基因，用限制性內切酶Xba I和BamH I雙酶切可將S基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質粒pBI 121原GUS基因位點上(Xba I和BamH I雙酶切)便分別構建成雙元表達載體pBIibv/S。2.將表達載體pBIibv/S導入根癌農桿菌(A.tumefaciens)含有傳染性支氣管炎病毒S蛋白抗原基因的質粒pBIibv/S被通過三親交配的方式轉移到根癌農桿菌EHA105菌株中，該菌株購自美國Clonetech公司。菌株EHA105現已被廣泛應用是因為它是一改造后的農桿菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已經被刪除。Vir基因可反式調節T-DNA自質粒pBIibv/S向植物細胞內的轉移。
農桿菌在含有25mg/L鏈霉素50ml YEP培養基中振蕩培養，在OD600nm值達到0.5時，4000g離心收集細菌細胞，將農桿菌細胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的YEP培養基中待用。含有表達載體pBIibv/S的DH5α和含有輔助質粒pRK2013的HB101分別接種在含有500mg/L卡那霉素50ml LB培養基中振蕩培養，在OD600m值達到0.5時，4000g離心收集細菌細胞，然后將細胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的LB培養基中待用。取上述三種細胞懸浮液各200μL，置于同-1.5ml離心管中，28℃靜置培養過夜，取該培養物5-10μL，均勻涂抹在YEP固體培養基平板上，該培養基中同時含有25mg/L鏈霉素和50ml/L卡那霉素，28℃培養2天后，含有質粒pBIibv/S質粒的農桿菌菌落開始產生。
用堿裂解法從農桿菌中提取質粒DNA，并用限制性內切酶酶切可檢測pBIibv/S質粒DNA是否存在。3.農桿菌介導的植物遺傳轉化從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5ml YEP液體培養基(抗生素Km100μg/ml)中，在28℃條件下振蕩培養16-24h，取1000μL菌液接種到100ml(抗生素Km 100μg/ml)液體培養基中，繼續振蕩培養到OD600為0.4-0.5。無菌條件下把菌液轉移到50ml eppendorf中，12000rpm離心20秒，去除上清夜，菌體用液體的MS基礎培養基重新懸浮到OD600為0.2-0.3。
在無菌條件下，取無菌苗，用手術刀把馬鈴薯切成0.3-0.5cm長度的莖段，接種到愈傷誘導固體培養基(在基礎培養基基礎上添加2，4-D 2mg/l，6-BA0.3mg/l，蔗糖3％，pH5.8)平板上面，在光照強度為2000Lx，光照時間為16h/天，溫度為24±2℃條件下預培養2天。將經過預培養的外植體浸入菌體懸液中作用5-8min，取出外植體，用滅菌濾紙吸干，立即放置在鋪有一層滅菌濾紙的愈傷組織誘導培養基上(基礎固體培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，pH5.7)于黑暗中共培養48小時，使農桿菌在與外植體接觸的過程中，將Ti質粒所帶的外源基因引入植物細胞內。將已共培養的馬鈴薯外植體用無菌水漂洗3-5次，用滅菌濾紙吸干，接種到含抗性愈傷組織誘導的固體培養基平板上(基礎固體培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，Km100mg/l，Carb 500mg/l，pH5.7)。在溫度為24±2℃，光照強度2000Lx，光照時間為16h/天下培養7天。轉化的外植體可見明顯的愈傷組織生長。
植株再生將愈傷組織連同外植體一起轉移到芽分化培養基即基礎培養基+ZT 2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l上，隔2周換一次培養基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生長到2-3厘米時，將其切下轉接到含Kan 50-100mg/l，Carb250-500mg/l生根的固體培養基上，7天左右開始生根，20天左右成為完整的植株。4.表達傳染性支氣管炎病毒S蛋白基因工程植株的篩選完整的植株可檢測轉基因植株是否含有傳染性支氣管炎病毒S蛋白，可用PCR和Southern blot予以確定。
1)轉基因植物傳染性支氣管炎病毒S蛋白基因的PCR檢測0.1g植物組織用液氮于研缽中快速研磨呈粉末。將粉末轉入一小離心管中，加入3倍體積(W/V)的提取緩沖液(500mM NaCl，50mM Tris.HCl pH8.0，50mMEDTA，1％(V/V)2-巰基乙醇)。解凍后放置于冰上，加入冰冷的20％存貯液聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至終濃度為6％，加入固體SDS至終濃度為2％(W/V)，輕輕混勻之后于65℃水浴10分鐘。加入1/10的5M醋酸鉀(Kac)于冰上反應30分鐘，4℃15000rpm離心10分鐘。取上相轉入一新的離心管，加入0.6倍體異丙醇，倒管混勻3次，再置于冰上10分鐘。4℃15000rpm離心10分鐘，去上相。沉淀物抽真空或室溫吹干后，溶解于500μL 1×TE(PH 8.0)。用1倍體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，重復三次。離心(12000rpm，10分鐘，20℃)，取上相，轉入一新離心管。加入1倍體積的異丙醇(20℃，5分鐘)，并將管至少顛倒5次，4℃15000rpm離心10分鐘，用70％乙醇沖洗沉淀物，65℃干燥30分鐘最后溶于20μL TE中。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR檢測。結果發現再生植株均能擴增出3.5kb左右的帶子，如圖4。
2)轉基因植物傳染性支氣管炎病毒S蛋白基因的Sothern blot檢測取5g植物材料在液氮中研磨成粉末；將粉末組織轉移到一個50ml的離心管中，加入20ml的60℃預熱的緩沖液，60℃保溫10～60min；加入等體積的24∶1氯仿/異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合，輕輕搖晃20min，重復一次。于4℃5000rpm離心15min，取上清液加入等體積的異丙醇，鉤出DNA絮狀沉淀，吸干，溶于100μLTE。加入5μLRNase A37℃消化(10μg/μL)10min，加入1/10體積的3M的NaAC和2倍體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置30min，用玻璃棒鉤出DNA沉淀，70％的乙醇漂洗，干凈的吸水紙吸干，并將DNA重新溶解于100μLTE中。取2μLDNA樣品在0.8％的Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小，并測定OD260/280數值，確定DNA的含量和質量。
限制性內切酶BamH I酶切植物基因組DNA，0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠放入0.25mol/L HCl中，溫和振蕩30min，去離子水稍稍漂洗；凝膠在0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl變性液中溫和振蕩30min，使DNA變性，然后在0.5mol/L Tris·HCl，1.5mol/L NaCl中和液中振蕩30min，使之中和。在10×SSC溶液中，通過毛細管法將DNA轉移至硝酸纖維素膜上。轉移結束后，揭去凝膠上方的紙巾和濾紙，翻轉凝膠和硝酸纖維素濾膜，以凝膠的一面在上，置一干濾紙上，用鉛筆在濾膜上標記加樣孔的位置。以6×SSC室溫浸泡濾膜5min，以除去粘著在濾膜上的瓊脂糖碎片。從6×SSC溶液中取出濾膜，待濾膜上的溶液滴盡后平放在一張紙巾上，于室溫晾干30min，80℃烤膜2h，取出用保鮮膜包好備用。
將含有靶DNA的硝酸纖維素濾膜漂浮于6×SSC的液面上，待其完全濕潤，將濕潤濾膜裝入雜交爐中，加入預雜交液，58℃旋轉保溫1-2h；將變性好的探針溶液加入預雜交液中，58℃雜交16-20h；雜交結束后，將濾膜轉移至200ml 2×SSC中，于室溫保溫15min，手提式小型探測器檢測膜上的放射性活度，濾膜上含正確DNA的部分應發出可檢測到的信號；放射自顯影和Typhoon檢測儀獲得傳染性支氣管炎病毒S蛋白基因信號。結果發現，外源基因已轉入植物基因組內，拷貝數為1-3，如圖5.5.S蛋白轉基因馬鈴薯的RNA分析剪取馬鈴薯植株100mg在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol抽提液，放置5分鐘；加入200μl的氯仿，室溫放置2-3分鐘4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清液。加入600μl的異丙醇，室溫放置10分鐘；4℃，12000rpm離心10分鐘，棄去上清液；加1ml 75％酒精輕洗RNA沉淀；4℃，12000rpm離心5分鐘棄去上清，沉淀溶解在30μl DEPC處理的水中。RNA的濃度通過測定OD260和OD280值予以估算。
將0.2g瓊脂糖熔于12.42ml DEPC水，熔化后加入4ml 5×甲醛凝膠電泳緩沖液和3.58ml 37％甲醛溶液，混勻后倒膠；凝膠預電泳5min，5μl RNA提取液中加入20μl滅菌的并經DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液(含溴化乙錠)，70℃處理10min后將樣品加至凝膠加樣孔；3-4V/cm電壓下電泳。DEPC處理水漂洗凝膠數次，核酸通過毛細管法轉移到尼龍膜上，轉膜16-20小時。
將含有RNA的硝酸纖維素濾膜漂浮于6×SSC的液面上，待其完全濕潤，將濕潤濾膜裝入雜交爐中，加入預雜交液，58℃旋轉保溫1-2h；將變性好的探針溶液加入預雜交液中，58℃雜交16-20h；雜交結束后，將濾膜轉移至200ml 2×SSC中，于室溫保溫15min，手提式小型探測器檢測膜上的放射性活度，濾膜上含正確DNA的部分應發出可檢測到的信號；放射自顯影和Typhoon檢測儀獲得傳染性支氣管炎病毒S蛋白信號。結果發現，外源基因均能轉錄，如圖6.
6.表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因植物的繁殖和培育在篩選出穩定表達傳染性支氣管炎病毒S1蛋白的轉基因馬鈴薯植株后，為生產該抗原蛋白必須大量繁殖該轉基因植株。馬鈴薯是通過營養繁殖的，因此，可通過扦插的方法，在短時間內便可獲得大量幼苗和微型薯。然后用這些幼苗或微型薯在田間大量繁殖，得轉基因馬鈴薯。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大學繼勇，周<120> 一種傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白基因<130> 無<140> 無<141> 2003-04-08<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1596<212> DNA<213> chicken<400> 1atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgttttg60tatgacagta gttcttacgt gtactactac caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg120catttacatg ggggtgcgta tgcggttgtt aatatttcta gtgaatctaa taatgcaggc180tcttcatctg ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct240atagctatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca300tactgtaact tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gtcataaaca tgttgggtgt360cctttaactg gcatgcttca acagcatcct atacctgttt ctgctatgaa aaatggccag420cttttttata atttaacagt tagtgtagct aagtacccta cttttaaatc atttcagtgt480gtttataatt taacatccgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgagacc540acagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt600atgagagaag ttagagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg660tgtgatgggt cacctagagg cttgttagca tgccagtata atactggcaa tttttcagat720ggcttttatc cttttactaa 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2<211> 3540<212> DNA<213> chicken<400> 2ttagtcttta atttaattaa gtgtggtaag ttactggtaa gagatgttgg taacacctct 60tttactagtg actcttttgt gtgcactatg tagtgctgtt ttgtatgaca gtagttctta120cgtgtactac taccaaagtg ccttcagacc acctgatggt tggcatttac atgggggtgc180gtatgcggtt gttaatattt ctagtgaatc taataatgca ggctcttcat ctgggtgtac240tgttggtatt attcatggtg gtcgtgttgt taatgcttct tctatagcta tgacggcacc300gtcatcaggt atggcttggt ctagcagtca gttttgtact gcatactgta acttttcaga360tactacagtg tttgttacac attgttataa acatgttggg tgttctttaa ctggcatgct420tcaacagcat tctatacgtg tttctgctat gaaaaatggc cagctttttt ataatttaac480agttagtgta gctaagtacc ctacttttaa atcatttcag tgtgttaata atttaacatc540cgtatattta aatggtgatc ttgtttacac ctctaatgag accacagatg ttacatctgc600aggtgtttat tttaaagctg gtggacctat aacttataaa gttatgagag aagttagagc660cctggcttat tttgttaatg gtactgcaca agatgttatt ttgtgtgatg ggtcacctag720aggcttgtta gcatgccagt ataatactgg caatttttca gatggctttt atccttttac780taatagtagt ttagttaagc agaagtttat tgtctatcgt gaaaatagtg 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權利要求
1.一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法，其特征在于它的的步驟如下1)傳染性支氣管炎病毒S1或S蛋白抗原基因的植物表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S構建以傳染性支氣管炎病毒毒株核酸為模板，PCR擴增獲得傳染性支氣管炎病毒S1或S基因被直接定向插入到質粒pBlueScriptSK(+)中的相應位點內，得到質粒pBS IBV/S1或pBS IBV/S，然后pBS IBV/S1或pBS IBV/S用限制性內切酶Xba I和BamH I雙酶切可將S1或S基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質粒pBI 121 GUS基因位點上(Xba I和BamH I雙酶切)便構建成雙元表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S。2)表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S經三親交配法導入到具有較強感染能力的農桿菌菌株EHA105中；3)農桿菌介導的植物遺傳轉化農桿菌介導的植物遺傳轉化是將經過預培養的馬鈴薯無菌苗外植體與含有表達載體pBIibv/S1或pBIibv/S的農桿菌EHA105共培養后在抗性愈傷組織誘導的培養基上誘導形成抗性愈傷組織，抗性愈傷組織在分化培養基上分化出抗性芽，抗性芽生根培養基上生根發育成完整的再生植株。4)用PCR、Southern-blot、Northern-blot確定轉基因植株；5)不同轉基因馬鈴薯植株傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白含量的測定用ELISA方法測定轉基因馬鈴薯植株傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白含量，獲得表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因植株；6)表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因植物的田間繁殖和培育。
2.根據權利要求1所述一種表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因馬鈴薯生產方法，其特征在于所說的馬鈴薯的遺傳轉化方法的步驟如下1)預培養在無菌條件下取無菌苗，用手術刀把馬鈴薯切成0.3-0.5cm長度的莖段，接種到愈傷誘導固體培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成的基礎培養基上添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l，蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，pH5.8的平板上面，在光照強度為2000Lx，光照時間為16h/天，溫度為24±2℃條件下預培養2-3天。2)含表達載體的農桿菌轉化從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5ml含抗生素Km 50-100μg/ml YEP液體培養基中，在28℃條件下振蕩培養16-24h，取100μL含抗生素Km 50-100μg/ml菌液接種到5ml液體培養基中，繼續振蕩培養到OD600為0.4-0.5，大約3-4h。無菌條件下把菌液轉移到1.5mleppendorf中，12000rpm離心20sec，去除上清夜，菌體用液體的MS基礎培養基重新懸浮到OD600為0.1-0.3。3)共培養將經過預培養的外植體進入菌體懸液中作用5min，取出外植體，用滅菌濾紙吸干，立即放置在鋪有一層滅菌濾紙的愈傷組織誘導培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成基礎培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，pH5.7上于黑暗中共培養2-3天。4)洗滌和抗性愈傷組織的誘導將已共培養的馬鈴薯外植體用無菌水漂洗3-5次，用滅菌濾紙吸干，接種到含抗性愈傷組織誘導的培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成基礎培養基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l，Carb250-500mg/l，pH5.7-5.8平板上。在溫度為24±2℃，光照強度2000Lx，光照時間為16h/天下培養7-9天。基本上外植體可見明顯的愈傷組織生長。5)植株再生將愈傷組織連同外植體一起轉移到芽分化培養基即MS培養基無機成分加B5培養基的有機成分組成基礎培養基+ZT 2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，瓊脂0.7-1.2％，，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l，上，隔2周換一次培養基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生長到2-3厘米時，將其切下轉接到含Kan 50-100mg/l，Carb 250-500mg/l生根的固體培養基上，7天左右開始生根，20天左右成為完整的植株。
全文摘要
本發明公開了傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白轉基因馬鈴薯的生產方法。傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白基因插入到植物表達載體pBI121上，經三親交配的方法把重組表達載體導入農桿菌中，外源基因經農桿菌介導法轉化馬鈴薯莖段，通過再生植株的抗生素抗性篩選和PCR、Southern blot及Northern blot等分子分析，獲得表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因植株。用這些表達傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白的轉基因植物直接飼喂雞或用轉基因植物中純化出的傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白作為注射劑注射給藥的方式免疫雞，引起了雞對該抗原蛋白的免疫應答反應，說明轉基因表達產物具有良好的免疫原性，為轉基因植物生產傳染性支氣管炎疫苗打下基礎。
文檔編號C12N15/40GK1460718SQ03116340
公開日2003年12月10日 申請日期2003年4月11日 優先權日2003年4月11日
發明者周繼勇, 吳建祥, 程麗琴 申請人:浙江大學