專利名稱：一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法
技術領域：
本發明涉及種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法，屬轉基因植物的分 子檢測領域。
背景技術：
隨著植物基因工程技術的發展，將外源基因轉入植物中以提高植物的產量、 品質、抗逆性或用于某些次生代謝產物的生物反應器等成為可能。轉基丙植物 在現代農業技術中扮演越來越重要的角色。轉基因的效果有賴于外源基因在轉 基因植物中穩定表達。然而，多拷貝重復轉基因序列的轉基因植物常常使外源 基因不能在轉基因植物中穩定表達，甚至完全不表達。這是在轉基因植物很容 易發生的現象。特別是花粉管轉基因法是外源基因插入有很大的隨機性而更易 于產生這種現象。因此，在轉基因植物早期篩選中，通過分子檢測篩選出已插 入外源基因的轉基因植物，同時篩選出單拷貝數轉基因植物具有重要的理論價 值和實踐意義。 一則可大大減少轉基因后期篩選的工作量，二則可提高外源基 因的表達水平和獲得穩定表達的轉基因植株。
檢測轉基因植物拷貝數最常ffi且準確的方法是Southerii分子雜交法和實時 定量PCR法。Southern分子雜交法需要放射性同位素操作的實驗室條件，雖然 也可用非同位素地高辛做標記，但檢測的靈敏度降低，也不能改變長而復雜實 驗過程。植物種內特異單拷貝數基因常常被用作參照基因來鑒定轉基因植物的 拷貝數，如棉花的特異單拷貝數基因SADI(Xu et a1.，2006)，番茄特異單拷貝 數基因液泡轉化酶(杜春芳等，2004),水稻單拷貝基因67^適于做為轉基因 水稻PCR檢測(Ding et a]. ， 2004 )。然而，這種方法是基于實時定量PCR 的方法實現的，其實驗設備、試劑、耗材都較昂貴。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用普通或梯度PCR循環儀和植物種內特異單拷
4貝數基因實現轉基因植物拷貝數鑒定的簡單新方法。PCR產物的多少在瓊脂糖電 泳圖像中所形成產物帶的光密度的高低不同，并在一定范圍內有線性相關關系，
PCR的產物多少與樣品模板基因的拷貝數和PCR的循環數有直接相關關系。本方 法利用了這一原理，首先將所有待檢測樣品的DNA濃度調整一致。保證了樣品 之間的可比性。然后做目標基因和內標基因在事先確定的相同循環數下的平行 PCR反應及瓊脂糖電泳，最后根據目標基因與內標基因PCR產物在電泳圖像中的 光密度值的比值來確定目標基因的拷貝數。
本方法與轉基因植物的檢測緊密結合，并利用其結果。在轉基因植物PCR檢 測的基礎上，選取目標基因在電泳圖像中最亮帶的樣品為確定PCR最佳循環數 的樣品。 一般說來不同樣品同一基因的PCR，在相同的DNA模版濃度和相同的循 環數的條件下，基因的拷貝數多，PCR產物就多。選擇目標基因在電泳圖像中最 亮帶的樣品有可能在所檢測的樣品中選擇了基因拷貝數多的樣品。用這個樣品 做DNA模板，做系列循環數(20， 22， 24，……38)條件下的PCR反應及產物 電泳，在數字化電泳圖像中，隨著PCR循環數增加，目標帶的光密度值增加， 選擇目標基因帶光密度值出現拐點，內標基因的帶也清晰可見的循環數確定為 最佳循環數。在PCR循環數拐點以下，會出現一個PCR產物與光密度值之間相 關的線性區間，為相對定量計算提供了可能。單拷貝基因樣品在這個循環條件 下的PCR產物相對較少，其產物在電泳圖像中的光密度值會落在這個線性區間 內，有利于鑒別。如果PCR循環數高于拐點，PCR產物與光密度值之間就會失去
線性關系，難以分辨差異。
當最佳循環數確定之后，做同一樣品的目標基因和內標基因在同樣循環數 下的平行PCR反應。即做同一樣品模板的PCR反應混合液，均分成等份后再加 入不同的引物，在相同循環數下再做相同循環條件的PCR反應及產物電泳，保 證除引物不同之外，PCR反應液、循環數、循環條件(使用梯度PCR循環儀時， 兩對引物的退火溫度可不同)、產物電泳條件抝相同。使目標基因和內標基因產物間的系統誤差減至最小，使單拷貝的內標基因與待測目標基因的拷貝數達到 好的可比性。在電泳圖像中，待測目標基因的PCR產物帶亮度與內標基因PCR 產物帶相似，可S測鑒定為單拷貝外源基因插入樣品，亮度顯著高于內標基因
PCR產物的，為多拷貝外源基因插入樣品。然而，目測失之準確，我們引入了 MATLAB軟件的自編程序來完成數字化電泳圖像中PCR產物帶的光密度值計算。 其PCR產物帶的光密度值包括了基因擴增帶所形成區域的大小和灰度值高低兩 個因子。將目標基因帶與內標基因帶的光密度值進行比較，比值接近l:l的為 單拷貝外源基因插入，大于等于2:1的為多拷貝外源基因插入。
這種檢測方法具有6個顯著的優點(1)操作簡單，任何一個做轉基因植 物PCR分子檢測的實驗室均可實現批量檢測而不增加試驗難度；(2)耗時短， 一批轉基因植物樣品在幾天內即可完成檢測；(3)費用低廉，所需儀器、試劑 均為普通PCR實驗所需；(4)結合了轉基因植物的PCR分子檢測，在確定一批 樣品的最佳PCR循環數的條件下，在此基礎上再做一步PCR反應即可確定待測 樣品的拷貝數；(5)安全，不涉及放射性試劑；(6)準確，檢測結果與Southern 分子雜交檢測相似。
具體實施例方式
1. 儀器與試劑
Bio-Rad梯度PCR儀(美國)，E卯endorf生物分光光度計(德國)，Bio-Rad 凝膠成像儀(美國)，Bio-Rad電泳儀(美國)，水平電泳槽(北京六一廠)， Eppe油rf移液器一套。
常規DNA提取試劑；常規PCR試劑(lOXTaq PCR緩沖液，2. 5mM dNTP， Taq酶，超純水)。
目標基因的引物和內標基因特異區引物由華大基因公司(北京)合成。
2. 相關軟件 Photoshop, MATLAB。
3. DNA樣品的準備在轉基因植物生育期內采集約0. lg幼嫩葉片，用常規提取植物總DNA的方
法提取轉基因植物的總DNA樣品，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質量，用2pl DNA樣品稀釋在生物分光光度計上檢測濃度，使所有待測樣品的總DNA的濃度 調整到100ng/|il。
4. 引物的設計
利用基因引物設計軟件(例如Primer5等)，根據轉基因植物檢測的原則 設計目標基因的引物，根據內標基因的特異區設計內標基因引物。兩對引物的 退火溫度保持一致較好，也可不同。
5. 轉基因植物常規PCR分子檢測
根據待測樣品數準備PCR反應混合液，分裝在PCR反應管中，在每管中分 別加入等量的待測樣品的DNA模板，做30個循環的PCR反應。PCR產物做瓊脂 糖凝膠電泳，選擇陽性反應中最亮條帶的待測樣品來確定循環數。
6. 最佳循環數的確定
為了使凝膠電泳目標基因帶的光密度值計算更加客觀，需確定PCR最佳循 環次數。在轉基因植物PCR分子檢測的基礎上，選陽性反應中最亮條帶的樣品 做DNA模板，準備22個PCR反應混合液，分裝成2管，l管加目標基因引物，1 管加內標基因引物，分別分裝到10個PCR反應管中，在梯度PCR循環儀中進行 擴增。最初在PCR儀中各放入1管PCR反應液，每隔2個循環各放入1管PCR 反應液。PCR反應設定為38個循環，最后72。C延伸10min，形成2組20， 22， 24， 26…，38系列循環數的PCR產物，在瓊脂糖凝膠上電泳。在數字化的電泳圖 像中，選擇目標基因PCR產物帶的光密度值出現拐點，并且內標基因的PCR產 物帶也清晰可見的循環數確定為最佳循環數。
7. 拷貝數的確定
將待測樣品的PCR反應混合液，均分成2等份， 一份加入目標基因引物， 一份加入內標基因引物，在梯度PCR循環儀中進行最佳循環數下的PCR擴增。 在瓊脂糖凝膠上電泳，將目標基因與內標基因帶的光密度值進行比較，比值接 沂l:l的為單拷貝外源某閔插入，大于等于2:1的為多拷:& 某因插入。根
7據實踐經驗，目測也可做出相對正確的判斷。 8.光密度值計算
在Photoshop軟件下讀取電泳圖，將要計算光密度的基因產物帶連同背景
做固定大小選擇、拷貝、粘貼、存儲為tif格式文件(見圖l)，在MATLAB軟
件下讀取，并計算光密度值。光密度值計算的基本簡單程序
1. Aim二imread ('wenjia函ing. tif');
2. ii:find(Aim〉150);
3. j j二Aim(i:O ;
4. kk=double(jj);
5. mm=kk_150;
6. Qiuhe二sum(腿) 程序說明
語句1:用MATLAB軟件讀取數字化圖像
語句2:根據讀取的圖像選取適合的灰度背景值(例如150)，背景值因
圖像不同而不同，可根據圖像中1-5行像素灰度值的平均值求出。找出所有大 于背景值像素點的坐標，即目標帶所形成的區域(見圖l)。
語句3:將所有大于背景值的像素點的灰度值賦給"jj"，形成新的單列矩陣。
語句4:將"jj"單列矩陣轉變為可運算的數據格式賦給"kk"。
語句5:將所有大于背景值的像素點的灰度值減去背景值并賦給"mm"。 語句6:求mm數列之和。其和代表目標帶所形成區域的大小和高于背景灰 度值高低兩個因子，用光密度表示。
這是程序的基礎語句，如果要處理的樣品很多，可根據需要編輯循環語句程序。
實例l.轉Bt基因抗蟲棉后代拷貝數的確定
1常規PCR分子檢測。提取轉Bt基因抗蟲棉樣品的總DNA，將樣品的DNA濃度調整到100 ng/ pl， 做PCR分子檢測。圖1為IO個轉基因材料PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，在陽 性反應中，2號單株PCR產物條帶最亮，2號單株的DNA用來確定循環數。
2檢測轉份-基因棉花的目標基因引物和內標單拷貝基因的引物 價基因的引物序列
crylA-F: 5， GAAGGA竹GAGCAATCTCTAC 3，
crylA-R: 5， CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3， 預期擴增片段大小為340 bp。 內標單拷貝基因SAD1引物序列
SAD-F: 5' GCAAGTAAGAGCGGTGAGC 3'
SAD-R: 5， TCAATTAACCTCCATGGGAC 3預期擴增片段大小為290 bp。
3最佳循環數的確定。
用所選轉5t基因抗蟲棉株系H3 (即2號單株)的DNA做模板，按照實施方 式第3步準備2組PCR反應混合液，l組加目標基因ciT"引物，l組加內標基 因aiV引物，形成2組20， 22， 24， 26 , 38系列循環數的PCR產物，在1%
的瓊脂糖凝膠上電泳。圖3為同一 DNA樣品目標基因和內標基因系列PCR產物 的電泳圖，沒有明顯產物帶的部分在圖像中略去。圖4為系列PCR產物在電泳 圖中的光密度值。其光密度值在32個循環處出現了拐點。在32個循環時，單 拷貝基因的PCR產物帶也清晰可見，因此，32個循環數為最佳PCR循 環數。 '
4拷貝數的確定 (1)抗蟲棉株系H3拷貝數的確定
將轉萬f基因抗蟲棉株系H3的PCR反應混合液(20 [il PCR體系中依次加入 10XTaq Buffer 2. O]il， dNTP (2. 5raM) l,6fil， Taq酶0. 2^i]，加水14. 6， DNA
9模板1.0pl)，均分成2等份， 一份加入目標基因引物， 一份加入內標基因引物。
目標cir^基因循環條件為94。C預熱2min， 94°C 30s， 55°C 30s' 72°C lmin， 32個循環72。C延伸10min。內標SAD1基因循環條件為94'C預熱2min， 94°C 30s, 55°C 30s， 72°C lmin， 32個循環72。C延伸10min，在梯度PCR循環儀中 進行PCR擴增。在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，圖5為目標基因和內標基因在同樣 循環數下的平行PCR產物電泳圖。此實驗重復三次。利用MATLAB軟件計算目標 基因與內標基因的光密度值的比值，其比值大于等于2，三個重復表現較一致， 鑒定為兩拷貝外源基因插入。目測也可得出上述結果，即H3株系為多拷貝轉基 因插入株系。 '
(2)抗蟲棉株系H5拷貝數的確定
H5與H3同為價基因抗蟲棉轉基因后代，因此，目標基因和內標基因的循 環體系和循環條件等均同H3株系，依此類推。圖6為目標基因和內標基因在同 樣循環數下的平行PCR產物電泳圖。此實驗重復三次。利用MATLAB軟件計算目 標基因與內標基因的光密度值的比值，其比值近似等于1，三個重復表現較一致， 鑒定H5為單拷貝外源基因插入。目測也可得出相同的結果。
6.分子雜交驗證
為了驗證這種鑒定轉基因植物拷貝數簡單新方法的正確性，對上述兩個轉Bt 基因抗蟲棉株系進行了 Southern分子雜交實驗檢測。其目標基因的探針制備和 Southern雜交實驗方法參照分子克隆實驗指南，稍做改良(李建平，2007)。從 圖7可以看出H5為目標基因的單拷1M插入，H3為目標基因的兩拷貝插入。 Southern結果驗證了本發明的實驗結果的TH確性。
實例2.轉5"^7基因棉花后代拷貝數的確定
1. 依據實例1的實驗過程，確定轉5"i/^7基因棉的PCR最佳循環次數為32 個循環。
2. 目標基因引物
Susy-F: 5' CATCATTGCGATAAAGGAAAGG 3'Susy-R: 5' GGCTCAAAATCCAATTCCAAAA 3，
預期擴增片段大小為720bp的片段。 3.拷貝數的確定 '
將待測樣品的PCR反應混合液(20plPCR體系，依次加入10 XTaq Buffer 2. 0 pi, dNTP (2. 5mM) 1. 6 fil， Taq酶0. 2 pl，加水14. 6 (il， DNA模板1. 0 ^d)，
均分成2等份， 一份加入目標基因5'z^y引物， 一份加入內標基因引物。 目標5ksy基因循環條件為94。C預熱2min， 94°C 30s， 58°C 30s， 72°C lmin， 32 個循環72。C延伸10min。內標^歷基因循環條件為94。C預熱2min, 94°C 30s, 55°C 30s， 72°C lmin， 32個循環72。C延伸10min，在梯度PCR循環儀中進行 擴增。在1%的瓊脂糖凝膠上電泳。圖8為目標基因和內標基因在同樣循環數下 的平行PCR產物電泳圖。此實驗重復三次。利用MATLAB軟件計算目標基因與內 標基因的光密度值的比值，其比值近似等于l，三個重復表現較一致，鑒定為單 拷貝外源基因插入。目測也可得出相同的結果。 6.分子雜交驗證
為了驗證這種鑒定新方法的正確性，對轉5k^基因棉花進行Southern雜交 實驗檢測。從圖9可以看出轉5"s/基因棉花株系為目標基因的單拷貝插入。 Southern結果驗證了本發明的實驗結果的正確性。


圖1.圖像處理及編程原理圖解。
圖2.轉Bt基因抗蟲棉的PCR檢測結果
圖3.轉價基因抗蟲棉株系H3的目的基因和內標基因的循環次數電泳圖。 M泳道代表DNA標記，M左c/T^基因，為340bp， M右WZV基因，為290 bp;
數字代表循環數。
圖4.系列PCR產物在數字化電泳圖中的光密度值
圖5.轉價基因抗蟲棉株系H3的目的基因和內標基因的PCR結果。M代表 DNA標記，T為目標基因，C,為aZ^基因，重復三次。圖6.轉價基因抗蟲棉株系H5的目的基因和內標基因的PCR結果。M代表 DNA標記，T為目標基因，C為MZ^基因，重復三次。
圖7.轉Bt基因抗蟲棉H5和H3的Southern雜交結果
圖8.轉5'^y基因棉花株系目標基因和內標基因的PCK結果。M代表DNA 標記，T為目標基因5^s乂為720bp， C為5^ /基因，重復三次。
圖9轉A/s/基因棉花株系的Southern雜交結果
參考文獻
Ding J, Jia J， Yang L， Wen H， Zhang C， Liu W, Zhang D (2004) Validation of a rice-specific gene, sucrose -phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real—time quantitative PCR detection of transgenes. J" Agric Food Chem 52:3372 - 3377
Xu W-T， Huang K-L， Wang Y， Zhang H-X， Luo Y-B (2006) A cotton-specific gene， stearoyi-ACP desaturase, used as a reference for qualitative and real-time quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified organisms. J" Sci Food Agric 86:1103 - 1109.
杜春芳，李朋波，李潤植(2004)—種快速鑒定轉基因植物純合體的新方法。生 物技術通訊15: 585-587
李建平，張燕紅，王冬梅等(2007〉 一種改良的Sonthern印跡雜交方法。新疆 農業科學，44 (S3): 116-118
1權利要求
1. 本發明涉及了一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法。實驗過程首先采集待檢測樣品的幼嫩葉片，提取總DNA。將所有樣品的DNA濃度調整一致。設計待測目標基因和內標基因的特異引物，在PCR分子檢測的基礎上進一步確定最佳PCR循環數。然后做目標基因和內標基因在相同循環數下的平行PCR及瓊脂糖電泳，最后根據二者在電泳圖像中的光密度值的比值來確定目標基因的拷貝數。數字化電泳圖像的光密度值計算借助于MATLAB軟件完成。
2. 根據權利要求l所述的一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法。其特征在于將所有待檢測樣品的DNA濃度調整一致，使所有樣品之間在同一循環數 下具有可比性。
3. 根據權利要求1所述的一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡宇.新方法。其特 征在于在轉基因植物PCR檢測的基礎上，選取PCR產物在電泳圖像中最亮帶的 樣品為確定PCR最佳循環數的樣品。
4. 根據權利要求1所述的一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法。其 特征在于將目標基因和內標基因做系列循環數的PCR產物電泳，在數字化電泳 圖像中，隨著PCR循環數增加，目標帶的光密度值增加，選擇目標基因帶光密 度值出現拐點，內標基因的帶也清晰可見的循環數確定為最佳循環數。
5. 根據權利要求1所述的-一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法。其 特征在于做M標基因和內標基I天1在同樣循環數下的平行PCR，即做同樣品校板 的PCR反應混合液，均分成等份后再加入不同的引物，在相同循環數下做相同循 環條件的PCR反應及產物電泳，保證除引物不同之外，PCR反應液的含量和體積、 循環數、循環條件(兩對引物的退火溫度不同時，可使用梯度PCR循環儀)、產 物電泳條件均相同。
6. 根據權利要求1所述的一種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法。其 特征在于將目標基因與內標基因PCR產物帶的光密度值進行比較，比值接近l: 1 的為單拷貝外源基因插入，大于等于2:1的為多拷貝外源基因插入。根據實踐 經驗，目測也可做出相對正確的判斷。
7. 根據權利要求l所述的 -種鑒定轉基因植物拷貝數的簡單新方法。其特征在于借助MATLAB軟件的自編程序完成數字化電泳圖像的光密度值計算。
全文摘要
本發明提供了一種利用普通PCR循環儀和植物種內特異單拷貝基因為內標實現轉基因植物拷貝數鑒定的簡單新方法。其特征在于首先提取待測樣品幼嫩葉片的總DNA，將所有樣品的DNA濃度調整一致。設計目標基因和內標基因的特異引物，在PCR分子檢測的基礎上進一步確定最佳PCR循環數。然后做目標基因和內標基因在相同循環數下的平行PCR及瓊脂糖電泳，最后根據二者在電泳圖像中的光密度值的比值來確定目標基因的拷貝數。本發明的積極效果在于①有益于轉基因植物育種中篩選穩定表達的轉基因植株；②操作簡單、耗時短、費用低廉、安全、準確；③結合了轉基因植物的PCR分子檢測，任何一個做轉基因植物PCR分子檢測的實驗室均可實現批量檢測而不增加實驗設備和難度。
文檔編號C12Q1/68GK101445826SQ20081007290
公開日2009年6月3日 申請日期2008年6月19日 優先權日2008年6月19日
發明者李建平, 王冬梅, 胡文冉, 玲 范, 陳勛基 申請人:新疆農業科學院核技術生物技術研究所