產量增加的疫霉抗性馬鈴薯的開發的制作方法
【專利摘要】本發明涉及具有增加的致病疫霉(Phytophthora?infestans)抗性并且與野生型馬鈴薯植物相比馬鈴薯塊莖產量相當的轉基因馬鈴薯植物，其中blb1基因和blb2基因被整合到馬鈴薯植物中的特定遺傳背景之中。
【專利說明】產量增加的疫霉抗性馬鈴薯的開發
[0001]本發明涉及具有增加的致病疫霉(Phytophthora infestans)抗性并且與野生型馬鈴薯植物相比馬鈴薯塊莖產量相當的轉基因馬鈴薯植物，其中blbl基因和blb2基因在特定的遺傳背景下被整合到馬鈴薯植物中。
[0002]由卵菌致病疫霉引起的晚疫病是全世界馬鈴薯生產最嚴重的威脅之一。盡管多年來一直在進行抗性育種，但是防止作物欠收或產量降低的唯一有效的方法是應用預防或治愈致病疫霉感染的殺菌劑。由于晚疫病的疾病發展極快，因此執行嚴密的殺菌劑方案是必需的，其必須在第一次癥狀出現之前即開始。此外，致病疫霉似乎對于適應特定的殺菌劑并且發展出抗性具有很高的潛能，如在甲霜靈-殺菌劑的案例中所見(Gisi U7Cohen Y(1996)Resistance to phenylamide fungicides:A case study with Phytophthora infestansinvolving mating type and race structure Annual Rev Phytopathol.34:549-572)。
[0003]在一些西歐國家，就特定殺菌劑的應用而言，關于植物保護產品使用的立法變得更具有約束性，這使得疾病的化學控制以及抗性發展的預防更加困難。
[0004]殺菌劑使用的備選的和/或補充性方法是開發對致病疫霉具有改良抗性的馬鈴薯栽培品種。
[0005]近年來，通過常規育種開發出含有球栗薯(S.bulbocastanum)衍生抗性的兩個馬鈴薯品種。這兩個品種,Toluca和Bionica,都含有賦予針對致病疫霉的全部抗性的單個球栗薯抗性基因。但是從農藝學的角度來看，就產量潛能而言這兩個馬鈴薯品種不符合現代馬鈴薯品種的標準。
[0006]由于將球栗薯衍生抗性漸滲入至現代馬鈴薯品種中被證實是困難且耗時的，更為有效的方法是分離球 栗薯中編碼疫霉抗性的基因，并且通過生物技術方法將它們轉移至現有的馬鈴薯栽培品種中。
[0007]為了產生持久抗性的馬鈴薯植物，使Rp1-blbl基因和Rpi_blb2基因在其天然調控元件的控制下組合。所得到的載體構建體包含處于天然Rp1-blbl啟動子和Rp1-blbl終止子控制之下的Rp1-blbl基因的基因組序列(這些序列全部衍生自球栗薯)以及處于天然Rp1-blb2啟動子和Rp1-blb2終止子控制之下的Rpi_blb2基因的基因組序列(這些序列全部來自球栗薯)(W02008/034876)。所獲得的表達blbl蛋白和blb2蛋白的轉基因馬鈴薯針對致病疫霉顯示出增加的抗性。然而，發現所開發的馬鈴薯植物的產量降低。
[0008]本發明的一個目的是提供具有改良的致病疫霉抗性并且與野生型馬鈴薯產量相當的馬鈴薯植物。
[0009]通過參考本發明優選實施方式的以下詳細描述和本文所包括的實施例，可以更容易地理解本發明。除非另有說明，本文所使用的術語將根據相關領域普通技術人員的常規用法進行理解。除了本文所提供的術語定義之外，分子生物學中常見術語的定義也可以在 Rieger 等人，1991Glossary of genetics !classical and molecular,第 5 版，Berlin:Springer-Verlag 和 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 等人編著，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.andJohn Wiley & Sons, Inc., (1998Supplement)中找到。將要理解的是，如在說明書和權利要求中所使用，“一個”可以指一個或多個，取決于其被使用的上下文。因此，例如，“一個細胞”可以是指可以利用至少一個細胞。將要理解的是，本文中所使用的術語僅僅出于描述【具體實施方式】的目的，其并非意在進行限制。
[0010]整個申請中引用了多篇出版物。所有這些出版物以及在那些出版物中所引用的那些參考文獻的公開內容在這里作為整體通過引用并入到本申請中，以更完整地描述本發明所屬領域的狀況。克隆、DNA分離、擴增和純化的標準技術，涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切酶等酶促反應的標準技術以及多種分離技術是已知的并且本領域技術人員常用的那些 。一些標準技術描述于Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, Plainview, Ν.Y.；Maniatis 等人，1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Ν.Y.;Wu(編著)1993Meth.Enzymol.218，Part I ；ffu(Ed.) 1979Meth Enzymo1.68 ；ffu 等人，(編著)1983Meth.Enzymo1.100 和 101 ；Grossman 和 Moldave (編著)1980Meth.Enzymo1.65 ；Miller (編著)1972Experiments inMolecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.；Old 和 Primrose,1981Principles of Gene Manipulation, University of CaliforniaPress, Berkeley ；Schleif和 Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology ；Glover (編著)1985DNA Cloning Vol.1 和 II, IRL Press, Oxford, UK ；Hames 和Higgins (編著)1985Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK 以及 Setlow和 Hollaenderl979Genetic Engineering !Principles and Methods, Vols.1-4, PlenumPress, New York.中。當采用縮寫和命名時,則被視為是本領域標準的和專業期刊(例如本文所引用的那些)中常用的。
[0011]本發明的目的通過提供具有blbl基因和blb2基因特異性整合位點的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物或其種子、塊莖、植物細胞或組織而解決。
[0012]根據本發明的一個實施方式提供了疫霉抗性的轉基因馬鈴薯植物、種子、塊莖、植物細胞或組織，優選其包含與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的核苷酸序列(參見圖2a)。
[0013]根據本發明的一個實施方式提供了疫霉抗性的轉基因馬鈴薯植物、種子、塊莖、植物細胞或組織，其包含與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列的側翼為與SEQ ID NO:20和/或SEQ ID NO:21具有至少80%同一性的側翼區域(參見圖2b、c、e)。
[0014]SEQ ID NO:1是指插入到植物基因組中的重組構建體的一部分，其包含blbl基因、blb2基因和ahas基因，其中SEQ ID NO:1進一步包含植物的側翼基因組序列(參見圖2a)。
[0015]SEQ ID NO:2是指插入到植物基因組中的重組構建體的一部分，其包含blbl基因，blb2基因和ahas基因。優選地，如果將與SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的序列插入到植物基因組中，則blbl基因、blb2基因以及任選地ahas基因表達。優選地，如果將與SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的序列插入到植物基因組中，則其表達blbl基因、blb2基因和/或ahas基因會表達(參見圖2b)。
[0016]SEQ ID NO:3是指插入到植物基因組中的重組構建體的一部分，其包含blbl基因、blb2基因，但無ahas標志基因。優選地，如果將與SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的序列插入到植物基因組中，則blbl基因、blb2基因表達(參見圖2c)。
[0017]SEQ ID NO:2和/或3在后文中可稱作插入片段。
[0018]SEQ ID NO:20是指具有序列SEQ ID NOs:2或3的插入片段的左側翼區域。
[0019]SEQ ID NO:21是指具有序列SEQ ID NOs:2或3的插入片段的右側翼區域。
[0020]術語“側翼區域”是指位于整合到植物基因組中的插入片段右側或左側位點的側翼的植物基因組區域。
[0021]根據本發明的一個實施方式提供了疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物或其種子、塊莖、植物細胞或組織，其包含:[0022]a)與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體，以及進一步包含選自由以下組成的組中的連接序列:
[0023]b)
[0024]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于126和136個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0025]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于505和515個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0026]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于625和635個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0027]iv)能用于利用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于4752和4762個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0028]和/或進一步包含選自由以下組成的組中的連接序列:
[0029]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于282和292個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0030]vi)能用于利用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于877和887個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0031]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于827和837個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0032]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于9905和9915個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列。
[0033]本發明的優選實施方式提供了疫霉抗性的轉基因馬鈴薯或其種子、塊莖、植物細胞或組織
[0034]a)與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體，以及進一步包含選自由以下組成的組中的連接序列:
[0035]b)
[0036]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增131個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0037]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增510個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0038]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增630個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或[0039]iv)能用于利用具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO: 11核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增4757個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0040]和/或進一步包含選自由以下組成的組中的連接序列:
[0041]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增287個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0042]vi)能用于利用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增882個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0043]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增832個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0044]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增9910個堿基對的核苷酸片段的核酸序列。
[0045]可用于利用兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增特定長度的核苷酸片段的核酸序列是指利用兩條引物進行所述聚合酶鏈反應的產物。特別地，其是指利用兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增至特定長度的核苷酸片段的核酸序列。
[0046]連接序列包括插入到植物基因組中的重組構建體的右側或左側部分，并且部分地包括重組構建體的所述右 側或左側部分的側翼區域的植物基因組序列。特別地，連接序列包含與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體的左側部分以及與SEQ ID NO:20具有至少80%同一性的側翼區域部分，或者與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體的右側部分以及與SEQ ID NO:21具有至少80%同一性的側翼區域部分。在這種情況下，關于重組構建體部分序列的同一性是指對于所述重組構建體左側或右側部分的全長而言的同一性(圖2e)。
[0047]特別地，與SEQ ID NO:2或3具有至少80%同一性的重組構建體左側部分的一部分和與SEQ ID NO:22具有至少80%同一性的連接序列之間，或者與SEQ ID NO:2或3具有至少80%同一性的重組構建體右側部分的一部分和與SEQ ID NO:23具有至少80%同一性的連接序列之間，至少有部分重疊。在這種情況下，關于重組構建體部分序列的同一性是指對于重組構建體左側或右側部分的全長而言的同一性(圖2e)。
[0048]PCR是指聚合酶鏈反應，即利用所述核酸的特異性引物通過采用Taq聚合酶等從核酸的混合物中選擇性富集指定長度的核酸(US5, 656，493 ;Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Ν.Υ.)。
[0049]備選的實施方式提供了疫霉抗性的轉基因馬鈴薯、種子、塊莖、植物細胞或組織，其包含
[0050]a)與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體，以及進一步包含選自由與SEQ ID N0:22和/或SEQ ID NO:23具有至少80%同一性的序列組成的組中的連接序列。
[0051]可以通過繁殖或使馬鈴薯植物與由原種事件D的上述植物種子所獲得的馬鈴薯植物雜交并隨后使用上面所定義的引物對進行PCR檢測來選擇攜帶重組構建體的植物，來獲得根據本發明的、包含可進行如上所定義擴增的重組構建體的轉基因馬鈴薯植物、種子、塊莖、植物細胞或組織。含有的漿果可以就近手工收獲、提取和干燥。種子可以儲藏于室溫。可用0.04% GA(赤霉素)處理種子，以打破休眠并且促進發芽。[0052]在雜交的一個實施方式中，父本植物的花粉從其雄蕊中轉移到母本植物分離的雌蕊中。收獲真正含有種子的漿果，并將種子從漿果的外殼和果肉中分離出來。重新種植種子，生長成植株，隨后通過使用上面所定義的引物對進行PCR檢測從而選擇攜帶重組構建體的植物。
[0053]母本植物和/或父本植物可以是根據本發明的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物。在一個實施方式中，母本植物是根據本發明的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物，父本植物可以是例如選自 Agria、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diamant 和 Bintje 的非轉基因植物。在備選的實施方式中，父本植物是根據本發明的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物，母本植物可以是例如選自 Agria、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diamant 和 Bintje 的非轉基因植物。
[0054]本發明的一個實施方式提供了一種提供疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物或其部分的方法，其包括以下步驟:
[0055]a)將與SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的重組核酸序列導入到馬鈴薯植物細胞的基因組中，
[0056]b)將所述重組核酸整合到基因組中，
[0057]c)由所述植物細胞再生植物，
[0058]d)選擇包含與SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的核酸序列和如下連接序列的植物，所述連接序列選自與SEQID N0.22和/或SEQ ID N0.23具有至少80%同一性的序列組成的組。
[0059]本發明的一個實施方式提供了一種提供疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物或其部分的方法，其包括以下步驟: [0060]a)將與SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的重組核酸序列導入到馬鈴薯植物細胞的基因組中，
[0061]b)將所述重組核酸整合到基因組中，
[0062]c)由所述植物細胞再生植物，
[0063]d)選擇包含與SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的核酸序列和選自由以下組成的組中的連接序列的植物:
[0064]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于126和136個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0065]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于505和515個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0066]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于625和635個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0067]iv)能用于利用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于4752和4762個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0068]和/或進一步包含選自由以下組成的組中的連接序列:
[0069]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于282和292個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0070]vi)能用于利用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于877和887個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，
[0071]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于827和837個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0072]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增介于9905和9915個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列。
[0073]本發明的一種方法提供了一種提供疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物或其部分的方法，
[0074]其中，在步驟d)中，選擇包含與SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的核酸序列和選自由以下組成的組中的連接序列的植物:
[0075]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增131個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0076]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增510個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0077]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增630個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0078]iv)能用于利用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增4757個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0079]和/ 或:
[0080]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增287個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0081]vi)能用于利用具有SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增882個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，
[0082]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增832個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0083]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應從而擴增9910個堿基對的核苷酸片段的核酸序列。
[0084]本發明的一個實施方式提供了用于檢測特定整合位點，特別是用于檢測原種事件D的試劑盒，其包含引物對:
[0085]SEQ IDNO:4 和 5，
[0086]SEQ ID NO:6 和 7，
[0087]SEQ ID NO:8 和 9，
[0088]SEQ ID NO: 10 和 11，
[0089]SEQ ID NO: 12 和 13，
[0090]SEQ ID NO: 14 和 15，
[0091]SEQ ID NO: 16 和 17，和 / 或
[0092]SEQ ID NO: 18 和 19。
[0093]所公開的試劑盒可以用于質量控制(例如種子批次的純度)、檢測植物材料中或者包含或衍生自植物材料的材料(例如炸薯條、馬鈴薯粉、馬鈴薯泥等，但不限于食物或飼料產品)中特定整合位置的目的。[0094]簡而言之，通過PCR對基因組DNA進行擴增，其中利用特異性識別原種事件D中插入位點5’或3’側翼序列的引物，特別是上述引物對，例如分別為引物對SEQ ID NO:4和5、SEQ ID NO:6 和 7、SEQ ID NO:8 和 9、SEQ ID NO:10 和 11、SEQ ID NO:12 和 13、SEQ IDNO:14和15、SEQ ID NO:16和17、SEQ ID NO:18和19。如果使用上述引物組合對植物材料進行的PCR分別產生如下片段:
[0095]126 至 136bp (131bp)，
[0096]505 至 515bp (510bp)，
[0097]625 至 536bp (630bp)，
[0098]282 至 292bp (287bp)，
[0099]877 至 887bp (882bp)，
[0100]827 至 837bp(832bp)，
[0101]4752 至 4762bp(4757bp)，
[0102]9905 至 9915bp(9910bp)，
[0103]則確定轉基因植物具有本文所定義的特定整合位置，例如所選擇的原種事件D。可以通過凝膠電泳使用標記物從而確定片段長度(Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, plainview, N.Y.)。
[0104]本發明的一個實施方式提供了一種檢測特定整合位置，優選鑒定原種事件D的方法，其包括如下步驟:
[0105]a)從馬鈴薯植物中分離DNA作為測試樣品，
[0106]b)將測試樣品、陽性和陰性樣品、如上所定義的引物對暴露于PCR條件之下，以及
[0107]c)評估與所述陽性和陰性對照相比時如下DNA片段的擴增:
[0108]i)當使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于126和136個堿基對的片段，
[0109]ii)當使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于505和515個堿基對的片段，
[0110]iii)當使用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于625和635個堿基對的片段，和/或
[0111]iv)當使用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于4752和4762個堿基對的片段，
[0112]和/或
[0113]ν)當使用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于282和292個堿基對的片段，
[0114]vi)當使用具有SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于877和292個堿基對的片段，
[0115]vii)當使用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于827和837個堿基對的片段，和/或
[0116]viii)當使用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于9905和9915個堿基對的片段。
[0117]在一個優選實施方式中，在步驟e)中評估是指與所述陽性和陰性對照相比時選自由以下核苷酸片段組成的組中的核苷酸片段的擴增:
[0118]i)當使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有131個堿基對的片段，
[0119]ii)當使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有510個堿基對的片段，
[0120]iii)當使用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有630個堿基對的片段，和/或
[0121]iv)當使用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有4757個堿基對的片段，
[0122]和/或選自如下的核苷酸片段的擴增:
[0123]ν)當使用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有287個堿基對的片段，
[0124]vi)當使用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有882個堿基對的片段，
[0125]vii)當使用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有832個堿基對的片段，
[0126]viii)當使用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有9910個堿基對的片段。
[0127]測試樣品包含從轉化的植物材料中，例如從植物、其種子、塊莖、植物細胞或組織中分離的基因組DNA。陽性樣品是包括從包含SEQ ID NO:1的植物中分離出的基因組DNA的樣品。陰性樣品是包括從用于轉化的非轉基因原始品種(例如，Fontane品種)中分離出的基因組DNA的樣品。
[0128]可以用多種DNA聚合酶運行PCR反應,例如Pfu Ultra、Pfu Turbo或HerculaseDNA 聚合酶(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US)。用于 Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶操作方案的組合物可以如下:1 XPCR緩沖液，每種dNTP各0.2mM，I μ g樣品基因組DNA, 50pmol正向引物，50pmol反向引物，Iu Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA 聚合酶。
[0129]擴增循環可以如下:
[0130]98°C 60秒I個循環，隨后以98°C 10秒，下面表格所示退火溫度30秒，以及72°C每1000bp產物長度(見下面的表格)60秒進行35個循環，隨后72°C 10分鐘I個循環，然后 4。。。
[0131]表1
[0132]
【權利要求】
1.包含與SEQID NO:1具有至少80%同一性的核苷酸序列的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物、其種子、塊莖、植物細胞或組織。
2.疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物、或其種子、塊莖、植物細胞或組織，包含: a)與SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體， b)以及還包含選自以下組中的連接序列: i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于126和136個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于505和515個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于625和635個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列,和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO:11的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于4752和4762個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， 和/或還包含選自以下組中的連接序列: ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于282和292個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:14和SEQ ID NO: 15的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于877和887個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， vii)能用于利用具有核苷酸序列`SEQID NO:16和SEQ ID NO:17的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于827和837個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:18和SEQ ID NO: 19的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于9905和9915個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列。
3.根據權利要求1的疫霉抗性轉基因馬鈴薯、其種子、塊莖、植物細胞或組織，包含 a)與SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組構建體，以及還包含選自以下組中的連接序列:
b) i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增131個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增510個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增630個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO:11的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增4757個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， 和/或還包含選自以下組中的連接序列: ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增287個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 15的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增882個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，Vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO ：16和SEQ ID NO ：17的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增832個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:18和SEQ ID NO : 19的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增9910個堿基對的核苷酸片段的核酸序列。
4.提供疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物的方法，包括如下步驟： a)將與SEQID NO. 2或SEQ ID NO. 3具有至少80%同一性的重組核酸導入到馬鈴薯植物細胞的基因組中， b)將所述重組核酸整合進基因組， c)由所述植物細胞再生植物， d)選擇包含與SEQID NO. 2或SEQ ID NO. 3具有至少80%同一性的核酸和選自以下組中的連接序列的植物： i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO ：4和SEQ ID NO ：5的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于126和136個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7的兩條引物進行聚合酶`鏈反應擴增介于505和515個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO :8和SEQ ID NO :9的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于625和635個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列,和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO :11的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于4752和4762個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， 和/或還包含選自以下組中的連接序列： ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO :13的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于282和292個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:14和SEQ ID NO : 15的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于877和887個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列， vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO ：16和SEQ ID NO ：17的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于827和837個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:18和SEQ ID NO : 19的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增介于9905和9915個堿基對之間的核苷酸片段的核酸序列。
5.根據權利要求4所述的、提供疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物的方法，其中在步驟d)中，選擇包含與SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3具有至少80%同一性的核酸和選自以下組中的連接序列的植物： i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO ：4和SEQ ID NO ：5的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增131個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增510個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO :8和SEQ ID NO :9的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增630個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO :11的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增4757個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或還包含選自以下組中的連接序列: V)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增287個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:14和SEQ ID NO: 15的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增882個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:16和SEQ ID NO:17的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增832個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:18和SEQ ID NO: 19的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增9910個堿基對的核苷酸片段的核酸序列。
6.包含用于檢測特定整合位置的引物對的試劑盒，所述引物對選自由如下組成的組中:
SEQ ID NO:4 和 5，`
SEQ ID NO:6 和 7，
SEQ ID NO:8 和 9，
SEQ ID NO:10 和 11，
SEQ ID NO:12 和 13，
SEQ ID NO:14 和 15，
SEQ ID NO:16 和 17，和 / 或
SEQ ID NO:18 和 19。
7.檢測特定整合位置的檢測方法，包括: a)從馬鈴薯植物、其種子、塊莖、植物細胞或組織中分離核酸序列作為測試樣品， b)在PCR條件下將所述測試樣品、陽性和陰性樣品暴露于選自權利要求6所定義的引物對中至少一組的核苷酸序列，以及評估與所述陽性和陰性對照相比時選自如下組的核苷酸片段的擴增: i)當使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于126和135個堿基對的核苷酸片段， ?)當使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于505和515個堿基對的核苷酸片段， iii)當使用具有SEQID NO:8和SEQ ID NO:9核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于625和635個堿基對的核苷酸片段，和/或 iv)當使用具有SEQID N0:10和SEQ ID NO:11核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于4752和4762個堿基對的核苷酸片段， 和/或選自如下組的核苷酸片段的擴增: ν)當使用具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于282和292個堿基對的核苷酸片段， vi)當使用具有SEQID N0:14和SEQ ID NO:15核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于877和292個堿基對的核苷酸片段， vii)當使用具有SEQID NO:16和SEQ ID NO:17核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于827和837個堿基對的核苷酸片段，和/或viii)當使用具有SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有介于9905和9915個堿基對的核苷酸片段。
8.根據權利要求7的檢測方法，評估與所述陽性和陰性對照相比時選自以下組的核苷酸片段的擴增: i)當使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有131個堿基對的核苷酸片段， ?)當使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有510個堿基對的核苷酸片段， iii)當使用具有SEQID NO:8和SEQ ID NO:9核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有630個堿基對的核苷酸片段，和/或 iv)當使用具有SEQID N0:10和SEQ ID NO:11核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有4757個堿基對的核苷酸片段， 和/或評估與所述陽性和陰性對照相比時選自以下組的核苷酸片段的擴增:ν)當使用具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有287個堿基對的核苷酸片段， vi)當使用具有SEQID N0:14和SEQ ID NO:15核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有882個堿基對的核苷酸片段， vii)當使用具有SEQID NO:16和SEQ ID NO:17核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有832個堿基對的核苷酸片段，和/或 viii)當使用具有SEQID NO:18和SEQ ID NO:19核苷酸序列的兩條引物進行聚合酶鏈反應時具有9910個堿基對的核苷酸`片段。
9.可被權利要求6的試劑盒或權利要求7或8的檢測方法檢測的植物、其種子、塊莖、植物細胞或組織。
10.穩定整合進馬鈴薯植物細胞核中的多核苷酸，其包含: a)與SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重組核酸，以及 b)還包含選自以下組的連接序列: i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增131個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增510個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增630個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO:11的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增4757個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， 和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 13的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增287個堿基對的核苷酸片段的核酸序列， ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增882個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，Vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:16和SEQ ID NO : 17的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增832個堿基對的核苷酸片段的核酸序列，和/或 vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:18和SEQ ID NO : 19的兩條引物進行聚合酶鏈反應擴增13234個堿基對的核苷酸片段的核酸序列。
11.穩定整合進馬鈴薯植物細胞核中的多核苷酸，其包含與SEQID NO :1具有至少80%同一'丨生的核苷酸序列。
12.權利要求10或11的多核苷酸，其中與SEQID NO ：1具有至少80%同一性的核苷酸序列包含blbl基因和blb2基因。
13.權利要求12的多核苷酸，其中多核苷酸序列還包含SEQID NO :4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 和 / 或 19 中的一個或多個。
14.包含權利要求10、11、12或13的多核苷酸的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物、其種子、塊莖、植物細胞或組織。
15.權利要求1、2或3的疫霉抗性轉基因馬鈴薯植物、其種子、塊莖、植物細胞或組織，其中核苷酸序列或重組構建體包含blb`l基因和blb2基因。
【文檔編號】A01H5/00GK103842499SQ201280022213
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年5月24日 優先權日:2011年5月24日
【發明者】H·舒爾塞斯, T·伯梅 申請人:巴斯夫植物科學有限公司