專利名稱：鑒定非寄主植物抗病基因的新方法
技術領域：
本發明涉及快速鑒定在非寄主起抗性作用的基因的新方法。也涉及用該方法鑒定的、在感病植物中表達時提高抗病性水平的基因。
背景技術：
在植物及其病原體之間的平衡進化中，遺傳多樣性是一個重要的因素。在天然系統中，雜交繁殖的植物群體與混合的病原體群體相互作用。這種相互作用通常依賴于植物中抗病(R)基因和病原體中無毒(avr)基因的存在。雜交繁殖的植物共享R基因庫，而植物病原體則產生種類繁多的直接或間接由avR基因產生的激衛素(elicitor)。含有多少識別其中一種由侵染病原體產生的激衛素的R基因的單株抗所述病原體。
R基因介導的抗性通常導致過敏反應(HR)，即在侵染位點觀察到的快速壞死。顯然，活化的R基因觸發導致程序性細胞死亡的信號轉導事件，這可以防止侵入的病原體傳播到侵染位點以外，并觸發未受侵染的相鄰細胞產生抗性。
在過去五年中，已經克隆了許多R基因。最普遍存在的一類R基因編碼具有一個C末端富含亮氨酸的重復序列、一種N末端核苷酸結合位點和一段保守的具有共有序列GLPLAL的氨基酸序列的蛋白。該類R基因的實例是Rps2(Bent等，1994)、N(Whitham等，1994)、L6(Lawrence等，1995)、M(Anderson等，1997)和Rpm1(Grant等，1995)。在鑒定參與R基因介導的信號轉導的蛋白方面也已經取得進展。最近的多篇論文報道了在R基因信號中涉及蛋白激酶、推定的轉錄因子和脂酶樣蛋白(Innes綜述，1998)。最近，已經表明對這些信號組分的工程改造也可以提高植物病害防治水平(Cao等，1998)。
人們認為，R基因不提供抗所有基因型病原體的保護，即一種物種內的病原體并不都產生相同的激衛素。因此，雜交繁殖群體的侵染可能將導致僅部分所述群體存活。現代農業可能破壞植物和病原體之間的平衡。現在暴發數十年前只影響相對有限數量植物的疾病可能引起毀滅性大流性。
為了防止病害引起的大的損失，植物育種者嘗試將抗最重要的病原體小種(race)的抗性漸滲到優良栽培品種中。在大多數情況下，這是一場無止境的戰斗，因為抗一種病原體的一種或多種基因型的抗性選擇導致出現其它基因型。例如，相繼將抗病型野生型馬鈴薯Solanumdemissum的11個R基因漸滲到栽培的感病馬鈴薯栽培品種中，在所有情況下均導致出現毒性基因型的致病疫霉(Phytophthora infestans)病原體。經典的育種根據雜交程序定義，因此，僅可以在同一植物物種的不同accession或栽培品種之間、或在性親和的植物物種之間轉移抗性性狀。這種抗性通常被稱為“寄主”抗性。通過R基因的漸滲已經獲得了對許多病原體的暫時防治，所述病原體包括以下病原體致病疫霉、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、禾柄銹菌(Puccinia graminis)、隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)、高粱柄銹菌(Puccinia sorghi)、禾冠柄銹菌(Puccinia coronata)、向日葵柄銹菌(Puccinia helianthi)、鴨茅條形柄銹菌(Puccinia striiformis)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)、大麥黑粉菌(Ustilago hordei)、燕麥散黑粉菌(Ustilago avenae)、豇豆單胞銹菌(Uromyces phaseoli)、Peronospora farinosa、丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)、黃枝孢(Cladosporiumfulvum)、稻褐飛虱、蚜蟲、小麥癭蚊和煙草花葉病毒。
已經鑒定了抗特定病原體大多數小種抗性的少數R基因。特別引起關注的是水稻Xa21基因，它防治水稻黃單胞菌的大多數小種(Mazzola等，1994；Song等，1995)；小麥Lr34基因，參與對大多數葉銹病的抗性；和大麥Rpg1基因，保護植物抵抗幾乎所有稈銹病。然而，這些R基因是罕見的，并且可以被新的有侵襲力的小種打破。
一種提供廣譜且持久的病害防治、但經典育種達不到的優越的抗性來源是所謂的“非寄主”抗性。如果一個植物種所有性親和accession和栽培品種或非常近緣的物種抗特定的病原體的所有基因型，則該植物具有非宿主抗性。由于在那些植物種內缺乏感病材料，因此不能確定非寄主抗性的遺傳基礎。
迄今為止，尚未克隆到已知參與主動非寄主抗性的基因。然而，這種基因可能類似從顯示寄主抗性的來源分離的R基因。該假說的支持來自對致病疫霉和非寄主植物種煙草(Nicotiana tabacum)之間相互作用的研究。煙草的抗性與其以HR響應侵染的能力相關，提示煙草對致病疫霉的抗性基于由R基因控制的主動防衛機制(kamoun等，1997)。因此，煙草的非寄主抗性看來是“主動的”，并且不同于基于諸如存在預先形成的病原體抑制劑或缺乏病原體生長必需的因子之類的因素的“被動”抗性(Ride，1985)。
可以設想，某些克隆的非寄主抗性基因在感病作物中的表達可能提供現代農業需要的廣譜而持久的抗病性水平。然而，還不能通過遺傳學方法分離非宿主抗性基因。在此，本發明人已經開發出一種新的技術，該技術基于分離和篩選大量的與主動非寄主抗性相關的基因。篩選在既對某些目標病原體感病又非常容易轉化的植物中進行。通過施行該技術，已經鑒定出許多在感病植物中表達時提高、或預期提高抗病性水平的基因。
發明概述本發明涉及在與非寄主抗性相關的基因中篩選在感病植物中表達時提高抗病性水平的基因的方法，即通過用這些基因轉化病原體感病植物的組織，用病原體或其激衛素攻擊轉化的組織，并觀察增強的防衛反應和/或HR反應。在本發明的一個具體實施方案中，通過基因擴增、與致病疫霉的INF1激衛素共轉化到Nicotiana benthamiana的葉片中，并根據指示功能性的過敏反應的存在進行篩選，鑒定出得自煙草的R基因的同系物。在另一實施方案中，通過首先選擇由目標病原體在非寄主中誘導、而在感病寄主中不誘導(或不是同樣程度誘導)的基因，其次根據它們在N.benthamiana植株的葉中瞬時過量表達時增強抗典型病原體(例如細菌病原體煙草假單胞菌(Pseudomonas tabaci))的抗性能力進行篩選，鑒定出與非寄主抗性相關的基因。
一方面，本發明提供可以賦予植物對致病疫霉的抗病性的新的核酸序列(SEQ ID NO57和SEQ ID NO1-10和SEQ ID NO58、60、62)。本發明的再一實施方案提供參與植物對致病疫霉的抗病性的新蛋白序列(SEQ ID NO11-20和SEQ ID NO59)。
在本發明的再一實施方案中，提供包含賦予對致病疫霉的增強抗性的核酸序列的植物細胞或轉基因植物、以及得自這種植物的種子或后代。與缺乏SEQ ID NO57核酸序列、在其它方面相似的植物相比，包含所述核酸序列的轉基因植物、其種子或后代表現出抗致病疫霉或其它真菌病原體引起的病害，或響應致病疫霉或其它真菌病原體表現出過敏反應。與缺乏SEQ ID NO60的核酸序列、在其它方面相似的植物相比，包含所述核酸序列的轉基因植物、其種子或后代表現出抗致病疫霉或其它真菌病原體引起的病害的抗性，或應答致病疫霉或其它真菌病原體的過敏反應。也提供了產生表現出對真菌病原體抗性增強的轉基因植物的方法，包括將編碼R蛋白的核酸序列引入植物細胞中，由此產生轉化的細胞，并由所述轉化細胞再生與缺乏所述核酸序列、在其它方面相似的植物相比表現出對一種或多種選定病原體抗性的轉基因植物。
本發明也包括本文公開的DNA序列或其生物功能等同物的應用，即用于產生可用于鑒定賦予植物細胞對真菌病原體抗性的相關核酸序列的重組質粒、轉化的微生物、探針、分子標記和引物以及用于產生抗所述真菌病原體的轉基因植物。
根據以下詳述和附圖，本發明的上述方面和其它方面將更顯而易見。
附圖簡述

圖1代表雙元粘粒載體04541和04541M。LB的T-DNA結構。LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；P-35S＝花椰菜花葉病毒的35S啟動子；NPT＝新霉素磷酸轉移酶基因；ocs3’＝章魚堿合酶基因的終止序列；P-FMV＝玄參花葉病毒的35S啟動子；sp＝編碼PR1a的信號肽的序列；nos3’＝胭脂堿合酶基因的終止序列。該圖未按比例畫出。含INF1的HindIII-XhoI DNA片段的方向可以相反。
圖2圖示pMON11770的質粒圖譜。
圖3顯示涉及增強INF-1誘導的HR的10種R基因同系物的推定的部分氨基酸序列(SEQ ID NO11-20)的序列對比。
圖4圖示pMON17227的質粒圖譜。
圖5圖示pMON30656的質粒圖譜。
圖6圖示pMON30620的質粒圖譜。
圖7圖示pMON30621的質粒圖譜。
序列表序列簡述SEQ ID NO1-10顯示了在N.benthamiana中增強INF-1依賴性HR的煙草R基因同系物的部分序列。
SEQ ID NO11-20是涉及增強INF-1依賴性HR的R基因同系物(SEQ ID NO1-10)的推定的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO21-30是代表I類R基因同系物的10個不同亞類的序列。
SEQ ID NO31-36是代表II類R基因同系物的6個不同亞類的序列。
SEQ ID NO37-39是用于分離抗微生物肽同系物的引物。
SEQ ID NO40-45是用于分離I類R基因同系物的引物。
SEQ ID NO46-48是用于分離II類R基因同系物的引物。
SEQ ID NO49-50是用于分離PR1a基因信號肽的引物。
SEQ ID NO51-52是用來將INF1基因克隆入雙元粘粒載體中的引物。
SEQ ID NO53-54是用來將INF1基因克隆到pGEX載體中的引物。
SEQ ID NO55-56是用來分離大豆葉斑疫霉(P.sojae)激衛素的引物。
SEQ ID NO57是代表Enh3基因的基因組序列。
SEQ ID NO58是TOB-F12的DNA序列。
SEQ ID NO59是TOB-F12的蛋白序列。
SEQ ID NO60是Nhr1基因的DNA序列。
SEQ ID NO61-66是用來分離Nhr1基因的引物。
發明詳述定義為了清楚且一致地理解本說明書和權利要求書，包括這些術語的給定范圍，提供以下定義。
植物抗病(R)基因是這樣一種核酸分離物它編碼的蛋白在植物與特定病原體或昆蟲接觸時，直接或間接參與誘導最終導致抗任何病原體或昆蟲的植物防衛反應的信號轉導途徑。抗病基因產物應答稱為激衛素的病原體信號分子時被活化。
非寄主誘導型基因(NHI)是由病原體在非寄主植物中被快速誘導的基因。
R蛋白是由R基因編碼的產物。
植物抗病(R)基因座是遺傳上確定的、參與昆蟲抗性或抗病性的基因座，所述基因座已知或據信含有至少一種功能性R基因。
R基因同系物是其具有的推定氨基酸序列與一種或多種先前分離的R基因具有顯著同源性的DNA序列。它應該既含有一個核苷酸結合位點，又含有一個GLPLAL區。
顯著同源性定義為在常規雜交條件下與參比序列雜交的DNA序列。所述雜交條件最好是指在6X SSC、5X Denhardt溶液、100mg/ml魚精DNA、0.1％ SDS中于55℃雜交足夠時間，以允許雜交(例如數小時至過夜)，然后在2X SSC、0.1％SDS中于室溫下洗滌2次，每次15分鐘和在0.5-1X SSC、0.1％ SDS中于55℃下洗滌2次，每次15分鐘，然后進行放射自顯影。通常，當雜交混合物在0.1X SSC中于55℃、優選60℃、更優選65℃下洗滌至少1次時，所述核酸分子能夠雜交。
一個R基因亞類包括一組R基因同系物，它們在氨基酸水平上享有70％以上的同一性，或在植物基因組DNA印跡上交叉雜交。
功能性R基因是其編碼的蛋白參與抗病原體或昆蟲的植物抗病反應的基因。
R基因源是對一種或幾種目的病原體表現出抗病性、并且可能含有介導該抗性的R基因的植物。存在主動R基因的指標是(1)抗病性與過敏反應相關，和(2)抗病性依賴于單一基因座的存在。
R基因信號轉導途徑是可以由特定的病原體激衛素通過直接或間接地與R基因產物相互作用而被活化、并且在活化時通常觸發過敏反應、誘導致病相關基因表達和抗病性的途徑。
過敏反應(HR)是一種針對病原體的植物防衛作用。它包括與各種活性氧產生有關的侵染位點附近的快速細胞壞死、產生抗微生物化合物和加強寄主細胞壁。在特定寄主激發HR的病原體對該寄主是無毒的，該寄主是抗性的，而所述植物-病原體相互作用是不親和的。
寄主抗性是指為植物種一員的栽培品種、生態型或accession的任何抗病性或昆蟲抗性，所述植物種包括至少一種沒有這種抗性的其它栽培品種、生態型或accession表現出。
非寄主抗性是指在特定植物種和性親和的相關植物種的所有栽培品種、生態型或accession共有的任何抗病性或昆蟲抗性。
主動非寄主抗性是已知或據信基于在侵染時激活防衛反應的非寄主抗性。主動非寄主抗性不是基于(1)缺乏病原體分化或生長必需的因子，(2)存在預先形成的病原體生長抑制劑，(3)任何其它的“被動”原因。
非寄主抗性基因是R基因、NHI或從非寄主分離出的、編碼激衛素結合蛋白并在感病寄主中增強植物HR和/或防衛反應的基因。
激衛素是由病原體產生的、在植物中激發反應的分子或肽。激衛素的產生由病原體無毒基因控制。
植物系統是指可以用來通過瞬時轉化篩選多基因家族成員的植物種。
表達是指編碼DNA分子(例如產生多肽的結構基因)經歷的細胞內總過程，所述細胞內過程包括轉錄和翻譯。
啟動子是DNA序列或一組DNA序列上的識別位點，所述位點為結構基因提供表達控制元件，并且RNA聚合酶特異性地結合于所述位點并起動該基因的RNA合成(轉錄)。
再生是由植物細胞(例如植物原生質體或外植體)生長出植物的過程。
結構編碼序列是指編碼肽、多肽或蛋白質的DNA序列，所述肽、多肽或蛋白質是在細胞將所述結構編碼序列轉錄出信使RNA(mRNA)后，將所述mRNA翻譯為所需肽、多肽或蛋白產物而制備的。
穩定轉化是將外源DNA序列(例如載體、重組DNA分子)引入細胞或原生質體中，然后所述外源DNA在所述細胞或原生質體中整合到染色體中或能夠自主復制的過程。
瞬時轉化是將攜帶由啟動子驅動的一個或多個基因、后接終止信號的外源DNA序列引入細胞或原生質體中、以在有限的時間內表達所引入的基因的過程。
轉化細胞是其DNA通過將外源DNA分子引入該細胞中而改變的細胞。
轉基因細胞是指得自轉化細胞或由轉化細胞再生、或得自轉基因生物的任何細胞。典型的轉基因細胞包括得自轉化植物細胞的植物愈傷組織和得自轉基因植物的特定細胞諸如體細胞(例如葉片、根、莖)或生殖細胞。
轉基因植物是得自轉化植物細胞或原生質體的植物或其后代，其中所述植物的DNA含有不是原始存在于同一品系的天然、非轉基因植物中的所引入的外源DNA分子。術語“轉基因植物”和“轉化植物”本領域有時用作限定其DNA含有外源DNA分子的植物的同義詞。然而，人們認為更科學正確的是，轉基因植物是指由轉化植物細胞或原生質體獲得的再生植物或愈傷組織，在本文中采用該用法。
載體是能夠在寄主細胞中復制的DNA分子，另一DNA區段可以與其有效連接，以便所連接區段復制。質粒是一種典型的載體。
植物在本文中在廣義上使用，是指分化的植物以及在合適的條件下可以發育為成熟的植物的未分化植物材料(例如原生質體、植物細胞、種子、小植株等)以及這種植物的后代和其部分，例如插條(cuttings)和果實。
生物功能等同物是指在本發明的核酸和蛋白方面的等同物，它們含有的一段序列或部分與本發明的新序列具有序列相似性，并且其功能特性與本文所公開序列相同或相似。
本發明使得人們能夠分離用于防治病毒、細菌、真菌或線蟲病原體的非寄主抗性基因，所述病原體包括但不限于疫霉屬(Phytophthora)、白粉菌屬(Erysiphe)、柄銹菌屬(Puccinia)、殼針孢屬(Septoria)、黑粉菌屬(Ustilago)、柵銹菌屬(Melampsora)、盤梗霉屬(Bremia)、黑星菌屬(Venturia)、單胞銹菌屬(Uromyces)、腥黑粉菌屬(Tilletia)、喙孢屬(Rhynchosporium)、核腔菌屬、Fulvia、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、霜霉屬(Peronospora)、丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、枝胞屬(Cladosporium)、(Colletotrichum)、煙草花葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、瓶霉屬(Phialophora)、異皮線蟲屬(Heterodera)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、Magnaporthe、稻褐飛虱、green rice leafhopper、蚜蟲、Pseudocercosporella和小麥癭蚊。也提供功能性R基因、NHI和編碼激衛素結合蛋白的基因的DNA序列，并且提供將這種DNA序列插入寄主細胞的基因構成物和方法，用于產生由此編碼的用于防治致病疫霉和可能的疫霉屬其它菌種的多肽。
本發明敘述了在感病植物中表達R基因、NHI和編碼激衛素結合蛋白的基因，以鑒定增強HR和/或防衛反應的基因。能夠快速分離這種“功能性”基因以及隨后將這些非寄主抗性基因轉移到感病作物中，將大大促進抗病栽培品種的開發。這里，本發明人描述了一種采用不是基于傳統遺傳學的方法分離非寄主抗性基因的一種全新的方法。相反，它依賴于在植物試驗系統中根據功能活性篩選R基因、NHI和激衛素結合蛋白。這種新方法的最重要的結果之一是抗性源是預期使得可以分離參與廣譜而持久防治病害的基因的主動非寄主的抗性源。與主動非寄主抗性相關的基因的篩選本領域技術人員可以分析非寄主中功能性R基因的存在，并因此允許通過各種各樣的方法選擇有用的抗性源(R基因供體)，所述方法包括但不限于感染非寄主和檢查過敏反應(HR)枯斑(lesion)的存在。有時可能用肉眼觀察到作為局部枯斑的這種HR。通常仍需要顯微鏡分析侵染的葉片組織。目測HR細胞的一種方法是用乳酸酚藍染色。本領域熟知的其它方法也可以用來檢測植物枯斑，所述方法包括但不限于通過自身熒光檢查HR細胞的存在。雖然缺乏時不是無資格作為R基因供體、但增加作為R基因供體的非寄主有用性的其它因子包括來自目的病原體的已知激衛素。
在本發明的一個實施方案中，煙草顯示對馬鈴薯晚疫病病原體致病疫霉的持久且廣譜的非寄主抗性。這種抗性與侵染時過敏反應的誘導有關(Kamoun等，1997)，提示煙草對致病疫霉的抗性基于由R基因控制的主動防衛機制。已經克隆了誘導煙草HR的致病疫霉的激衛素IFN1的事實，促進了具有抗致病疫霉功能活性的煙草R基因的克隆。將少量INF1肽注射到煙草葉片的胞間隙中，導致誘導HR(Kamoum等，1997)。
在一個實施方案中，鑒定了DNA片段，并用來檢查提供與HR相關的或據信與HR相關的抗病性的許多或所有亞類的潛在R基因。本領域技術人員可以利用本領域眾所周知的方法，分離可以用作“亞類特異性探針”的這些片段，所述方法包括但不限于例如(1)設計對R基因中保守的結構域特異性的簡并或非簡并R基因引物，以擴增種類繁多的R基因的同系物片段(保守結構域的實例是核苷酸結合位點和GLPLAL基序)；(2)對得自抗性源基因組的R基因片段測序，并將其分為亞類，在同一亞類成員中優選的推導氨基酸序列的同一性大于約70％；和(3)使每個亞類的代表性DNA片段與植物總基因組DNA消化物雜交，以估計每個亞類成員的總數。隨后，用亞類特異性探針篩選所述抗性源的雙元粘粒文庫。通過部分消化總基因組DNA，并優選亞克隆雙元粘粒載體T-DNA邊界之間能夠在大腸桿菌和根癌農桿菌(A.tumefaciens)兩者中復制的約15-20kb的片段，更優選約21-25kb的片段(Jones等，1992)，構建這些文庫。
最好是構建并篩選非cDNA文庫的雙元粘粒文庫，因為(1)雙元粘粒允許不用進一步的克隆步驟而篩選R基因，并且(2)在某些情況下(例如Rps2和N)R基因的cDNA克隆表達已經表明不提供對具有相應無毒基因的病原體的抗病性。
設計了由本發明提供的DNA序列信息可供用于制備有能力特異性地與選定多核苷酸的基因序列雜交的DNA(或RNA)序列。基于對R基因同系物的選定序列的研究，所述選定序列例如最優選為與SEQ IDNO1-10相同的序列，或優選所提及的任何亞類特異性探針，可以制備合適長度的核酸探針。這種DNA和核酸探針特異性地顯示煙草屬(Nicotiana)、茄科(Solanaceous)和其它植物種的亞類R基因的能力，使得它們在各種實施方案中特別有用。最重要的是，所述探針可以用于各種各樣的用于分離功能性R基因的分析中。R基因同系物也可以用來在植物分離群體中研究抗性分離。這樣，有可能在DNA印跡上鑒定與抗性共分離的條帶。這些條帶可以用作抗性的緊密分子標記，并且本身可以用于育種程序中。另外，這些條帶可以顯示分離R基因本身。因此，與實施例中提出的R基因同源的序列既可用于R基因的作圖，又可用于R基因的分離。例如，我們已經在含有抗US-8基因型致病疫霉抗性分離的馬鈴薯植株DNA的DNA印跡上，測試了作為探針的與R基因同源的DNA片段(SEQ ID NO21-36)。具有SEQ ID NO29的放射性標記的DNA片段可以用來在許多抗性植物中鑒定在感病植株中總是缺乏的一個條帶。
在某些實施方案中，最好使用寡核苷酸引物。采用在用PCR技術檢測、擴增R基因限定區段或使所述區段突變中使用的多核苷酸，設計這種引物的序列。長度至少14個核苷酸的大小有助于確保該片段具有足夠的長度，以形成既穩定又具有選擇性的雙鏈體分子。但是一般優選在大于14個堿基的序列段內具有互補序列的分子，以提高雜交體的穩定性和選擇性，并由此改進所獲得的特異性雜交分子的質量和程度。人們一般優選設計具有約14-20個核苷酸或需要時甚至更長的基因互補序列段的核酸分子。例如通過用化學方法直接合成該片段；通過應用和核酸復制技術，例如美國專利4,683,195和4,683,202(所述專利通過引用結合到本文中)的PCR技術；通過從含有合適插入片段和合適的限制位點的重組質粒上切下選定的DNA片段，可以容易地制備這種片段。
雙元粘粒文庫的篩選產生帶有至少部分R基因的粘粒。采用本領域眾所周知的方法，包括但不限于用簡并R基因引物進行PCR擴增，可以證實R基因同源序列的存在。本領域技術人員可以使用一種簡單的方法，來獲得關于在T-DNA邊界之間存在由其自身啟動子驅動的、后接其自身終止信號全長的R基因同系物的指示。該方法基于我們的發現，即將高濃度的帶有R基因同系物的農桿菌屬菌株(約109菌落形成單位/ml)注射到例如Nicotiana benthamiana的植物的胞間隙中，通常在注射后3-6天導致不是與病原體攻擊無關就是與激衛素處理無關的HR的誘導。因此，在植物中誘導“自發”HR的R基因同系物的結構序列和功能序列最可能是全長的。
在另一實施方案中，可以鑒定不是R基因但是在或者R基因激活途徑或者導致病原體抗性的任何其它誘導途徑中起作用的基因。采用例如PCR選擇扣除(PCR select subtraction)的技術，可以分離出這些“非寄主誘導型基因”(NHI)，PCR選擇扣除允許鑒定出在病原體攻擊時在非寄主植物中表達的、但在感病植物中表達程度較低的基因。為了快速選擇最感興趣的線索(lead)，可以將這些候選基因在例如N.benthamiana的植物中瞬時表達，并測試它們限制由典型病原體(例如煙草假單胞菌)引起的病癥的能力。可以用于此目的的替代的病原體包括侵染N.benthamiana的的所有其它病原體，包括煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒和致病疫霉。
在另一實施方案中，可以采用酵母雙雜交法鑒定在抗性信號活動中起作用的激衛素結合蛋白。酵母雙雜交系統已經廣泛用來研究蛋白-蛋白相互作用(Fields和Sternglanz，1994)。可以將病原體激衛素亞克隆到“餌”載體中，用來分離與激衛素相互作用的植物蛋白。然后可以使陽性候選物在植物中瞬時表達，并測試其誘導HR和/或防衛反應的能力。原則上，可以在植物中誘導防衛反應的所有病原體激衛素和/或無毒因子均可以通過該方法使用，以分離其植物結合因子/互作因子。
為了在模型系統中鑒定非寄主抗性基因，這種模型必須具有(1)瞬時轉化的可及性，(2)對目標病原體和/或典型病原體的感病性，和(3)對該病原體的某些激衛素的不敏感性。一種非常令人關注的候選植物系統是N.benthamiana，因為該植物系統是穩定的農桿菌介導的轉化高度可及的(Rubino等，1993)、是普查農桿菌介導的瞬時轉化可及的并且對在煙草中完全受控制的許多病原體感病，所述病原體包括大豆花葉病毒、甘薯羽斑紋病毒、李壞死等軸不穩環斑病毒(ilarvims)、菜豆普通花葉馬鈴薯Y病毒(poyvirus)和攜帶無毒基因avrPto(Rommens等，1995)的細菌丁香假單胞菌病原體。預期N.benthamiana也將對農學上其它重要的病毒、真菌、細菌和線蟲病原體具有感病性，所述病原體包括但不限于致病疫霉、大豆葉斑疫霉(Phytophthora soja)、Phialophoragregata、茄假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)和尖鐮孢。該說明(list)還包括侵染馬鈴薯、番茄或大豆的線蟲以及某些昆蟲。N.benthamiana對許多病原體的感病性使得N.benthamiana成為根據功能活性篩選R基因同系物的良好植物系統。其它植物系統包括N.clevelandii、煙草、Lotus japonicus、大豆(Glycine max)和稻(Oryza sativa)。
本領域技術人員可以通過各種各樣的方法，包括但不限于用攜帶這些基因的農桿菌菌株轉化植物，根據功能活性篩選所述分離的非寄主基因。所述植物既為瞬時轉化(最好是農桿菌介導的瞬時轉化)高度可及的，又對目標病原體感病。
用大量基因有效地穩定轉化植物的一種方法是將各攜帶一種特有基因的農桿菌菌株按組合并，每組10種菌株。這樣，僅需要約50個轉化體。然后每種轉化可以合并40株植株的種子。為了篩選抗病性，可以用一種病原體侵染每批種子約160株植株，即總共8,000株植株。
如果目標病原體產生已知的激衛素，則通過使所述轉基因植株經所述激衛素處理可以有助于篩選工作。表達功能性非寄主抗性基因的轉基因植物將對該激衛素應答，建立可清楚觀察到的HR。已知激衛素的實例是從大雄疫霉細胞壁釋放的β-葡聚糖激衛素(Sharp等，1984)、致病疫霉產生的花生四烯酸(Bostock等，1981)、大豆葉斑疫霉(P.sojae)的胞外42 kDa糖蛋白(Parker等，1991)和疫霉(Phytophthora spp.)產生的10 kDa elicitins(Yu，1995)。
或者顯示對病原體侵染的抗病性或者經所述激衛素處理時以HR應答的轉基因植物可以用來以各種各樣的方式鑒定功能性非寄主抗性基因。例如，T-DNA特異性引物可以用來擴增所引入的DNA的部分。該擴增片段隨后可以用作探針，以篩選大腸桿菌原始文庫基因。許多所述陽性克隆將含有所述功能基因，然而可以對所述基因進行進一步分析，并按照標準方案進行亞克隆。
如Kapila等(1997)所述，農桿菌介導的瞬時基因表達是穩定轉化以根據抗目標病原體的功能活性篩選非寄主基因(R基因、NHI或推定的激衛素結合蛋白)的一種替代方法。如果克隆了編碼目標病原體激衛素的基因，則優選該系統。已經提出該測定為一種快速可靠的方法，用以測試R基因Cf4和Cf9在其它植物種中的功能(PCT申請WO 96/35790)以及測試特定突變的影響，而無需產生穩定的轉基因植物，但從未建議將其作為根據功能活性篩選大量基因(最優選R基因)的方法。
本文描述的方法并限于篩選功能性R基因的同系物。在最廣義上，可以根據功能活性篩選任何基因大家族的成員。可以根據抗微生物功能活性篩選的非R基因的基因的一個實例是編碼致病相關(PR)蛋白的一大類基因。僅測試了小部分這些基因防治微生物的能力，本文所述的方法可以使得能夠快速測試更多的PR基因和PR基因同系物。另一實例是篩選編碼抗微生物小肽的基因，所述基因存在于大多數或所有植物種中的大基因家族中。大多數所述抗微生物肽(AMP)含有偶數半胱氨酸，所述半胱氨酸均通過二硫橋成對地連接。根據一級結構水平上的同源性，可以將植物AMP分類不同的家族，包括硫堇、植物防衛素、脂質轉移蛋白以及橡膠蛋白型和knottin型AMP(Broekaert等，1997)。AMP之間的同源性可以允許通過基因擴增或DNA印跡分析來分離AMP同系物。例如，示于SEQ ID NO37-39的引物可以用來從分離自一種或幾種植物的基因組DNA中擴增大量的AMP同系物。采用約100ng模板DNA，并加入建議量的核苷酸、緩沖液和Taq聚合酶以及1μM引物SEQ ID NO37以及或者0.5μM引物SEQ ID NO38或者0.5μM引物SEQ ID NO39，可以進行基因擴增反應。可以將擴增的同系物克隆到雙元載體中，所述雙元載體在植物中可表達AMP，并且可以被接合到農桿菌中。隨后可以將所述農桿菌菌株獨立地或與2種或3種不同菌株結合，注射到植物系統例如N.benthamiana的胞間隙中，并可以同時測試多次注射的葉片組織的抗病性。
所述基因表達系統可以用來測試任何其它基因對線蟲或病原體的功能活性。這包括涉及抗性信號活動和/或防衛反應的基因和編碼以下蛋白的基因蛋白激酶，例如Pto和Pti1；參與防衛作用的轉錄因子；脂質轉運蛋白；參與細胞壁加強或木質素生物合成的蛋白質；參與早期信號活動的蛋白質；ω-6-脂肪酸去飽和酶；參與抗性的GTP結合蛋白；SAR/HR會聚蛋白(converging protein)，例如Cpr5、Acd2和Lsd1；HR/SAR分支點下游的R基因級聯匯集途徑(concvergence pathway)中蛋白，例如Cpr1、Cpr6，Cim2、Cim3；參與水楊酸和茉莉酮酸生物合成的蛋白；參與植物抗毒素產生的蛋白；參與抗細胞凋亡的保護的蛋白；參與廣譜抗性的膜結合蛋白，例如ml-O；參與植物脅迫的蛋白，例如陪伴分子；參與微生物毒素解毒的蛋白；抗真菌蛋白基因；推定的脂酶，例如Pad4；和由非上述激衛素誘導的蛋白，例如細胞色素P450、ACC合酶和DGP解離抑制劑。賦予感病寄主抗病性的功能性非寄主基因的克隆本領域技術人員可以通過各種各樣的方法，將鑒定的功能基因引入所需的但為感病的植物栽培品種中，所述方法包括但不限于農桿菌介導的轉化。功能基因可以用來賦予種類繁多的植物細胞抗病性，所述植物例如裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。雖然可以將這些基因插入屬于以下各種類別的任何植物細胞中，但它們尤其可用于目的農作物，包括但不限于金合歡屬(Acacia)、苜蓿、aneth、蘋果、杏、菊芋、arugula、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆科植物、甜菜、黑刺莓、越桔、青花椰菜、抱子甘藍、甘藍、canola、網紋甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、蕪荽葉、柑桔、clementines、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、北美黃杉、茄子、苣荬菜、寬葉苦苣、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、葡萄柚、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、油棕、油料種子油菜、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物、番木瓜、歐芹、豌豆、桃子、花生、梨、胡椒、柿子、松、鳳梨、車前草、李子、石榴、楊樹、馬鈴薯、西葫蘆、quince、radiata pine、radicchio、蘿卜、懸鉤子、水稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香、柑桔、茶樹、煙草、番茄、小黑麥、草坪、藤本植物、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。
制備表達載體的方法是本領域眾所周知的。在美國專利第4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中描述了用來轉化植物的表達(轉化)載體和制備那些載體的方法，所述專利公開內容通過引用結合到本文中。可以修飾那些載體，以包括按照本發明的編碼序列。
可以開發各種各樣的方法來通過互補粘性末端或平端將DNA與載體有效連接。例如，可以將互補同聚物序列加入待插入的DNA區段中以及插入載體DNA中。然后所述載體和所述DNA區段則在互補同聚尾序之間通過氫鍵連接，形成重組DNA分子。
編碼有能力賦予細胞抗病性的多肽的編碼區最好含有與SEQ IDNO1-10或SEQ ID NO57或SEQ ID NO58、60、62、64、66、68、70所示序列相同的序列或生物功能等同的序列。
可用于在高等植物中表達基因的典型載體是本領域眾所周知的，包括衍生自根癌農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒(Rogers等，1987)的載體。然而，已知幾種其它植物整合型載體系統在植物中起作用，包括pCaMVCN轉移控制載體(Fromm等，1985)。質粒pCaMVCN(可得自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子。
在某些實施方案中，用來表達所述多肽的載體包括在植物細胞中有效的選擇標記。用作選擇標記的核酸序列用來在細胞中產生有助于相對于不含所述標記的細胞鑒別所述細胞的表型。有用的選擇標記包括GUS、綠熒光蛋白(GFP)、新霉素磷酸轉移酶II(nptII)、熒光素酶(LUX)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、抗生素抗性序列和耐除草劑(例如草甘膦)序列。選擇標記最好是卡那霉素、潮霉素或除草劑抗性標記。一種抗藥性標記是其表達導致卡那霉素抗性的基因，即含有胭脂堿合酶啟動子、Tn5新霉素磷酸轉移酶II(NptII)和胭脂堿合酶3’非翻譯區的嵌合基因(Togers等，1987)。
本發明構成物的3’非翻譯區應該含有一種轉錄終止子或具有同等功能的元件和一個在植物中起作用的聚腺苷酸化信號，以使得腺苷酸核苷酸添加到所述mRNA的3’端。這種3’區的實例包括含有農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒基因和植物基因的聚腺苷酸化信號的3’轉錄、非翻譯區，所述Ti質粒基因例如胭脂堿合酶(nos)基因，所述植物基因例如大豆7s儲存蛋白基因和豌豆ssRUBISCO E9基因(歐洲專利申請0 385 962)。可以將這些元件組合，例如以提供重組雙鏈DNA分子，包含以5’至3’方向有效連接的一個在植物細胞中起作用的啟動子，以使得產生RNA序列；一個編碼R基因的DNA編碼序列；和一個在植物細胞中起作用的3’非翻譯區，以引起轉錄終止并將聚腺苷酸核苷酸添加到所述RNA序列的3’端。
與抗性有關的基因序列可以包含完整的核苷酸序列或其可能具有等同功能的任何部分，例如截短形式。或者，可能最好表達植物抗病性多肽的表位區，以便利用這些肽產生抗所述多肽的抗體。
翻譯增強子也可以作為載體DNA的部分加入。因此，本發明的DNA構成物也應該含有一個或多個可以用來增強由所產生的mRNA轉錄物表達基因產物的5’非翻譯前導序列。這種序列可以衍生自選擇以表達所述基因的啟動子，或可以對其特異性地修飾，以增加mRNA的翻譯。這種區域也可以得自病毒RNA、合適的真核基因或合成基因序列。
最好這種增強子序列增加或改變所產生的mRNA的翻譯效率。本發明不限于所述增強子衍生自天然5’非翻譯啟動子序列的構成物，而且它還可包括衍生自其它非相關啟動子的非翻譯前導序列，例如其它增強子轉錄激活蛋白或基因。例如，矮牽牛熱激蛋白70(Hsp70)含有這種前導序列(Winter等，1988)。
本發明設計了產生包含本文所述核酸序列的表達載體。因此，在一個實施方案中，表達載體包含分離并純化的DNA分子，所述DNA分子包含有效連接編碼本發明多肽的編碼區的啟動子，因此所述啟動子驅動所述編碼區的轉錄。所述編碼區有效連接于轉錄終止區。本文所用的術語“有效連接”是指啟動子與編碼區連接的方式，使得由該啟動予控制并調節所述編碼區的轉錄。將啟動子與編碼區有效連接的方法是本領域眾所周知的。因為本發明的表達載體將用來轉化植物，所以選擇有能力在植物中驅動表達的啟動子。在植物中起作用的啟動子也是本領域熟知的。可用于在植物中表達所述多肽的啟動子有誘導型啟動子、病毒啟動子、合成啟動子或組成型啟動子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)以及時間調節型、空間調節型或時空調節型啟動子(Chau等，1989)。根據在轉化植物細胞或轉基因植物中對所述編碼區轉錄活性的控制能力選擇啟動子。在植物組織中可以由種類繁多的啟動子驅動結構基因。啟動子可以是影響雙子葉植物或單子葉植物的近組成型啟動子，例如CaMV 35S啟動子，或是組織特異性或發育特異性的啟動子。
如上所述，可以將與抗性相關的非寄主基因置于或者天然存在的同源啟動子或者種類繁多的異源啟動子的控制之下。文獻中已經描述了在植物細胞中有活性的許多啟動子。這些啟動子包括例如胭脂堿合酶(nos)、甘露堿合酶(mas)和章魚堿合酶(ocs)啟動子，它們攜帶于根癌農桿菌腫瘤誘導質粒上；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子；增強的CaMV 35S啟動子；玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導型啟動子；煙草的EIF-4A啟動子(Mandel等，1995)；擬南芥屬(Arabidopsis)的殼多糖酶啟動子(Samac等，1991)；嫩莖花椰菜的LTP(脂質轉移蛋白)啟動子(Pyee等，1995)；玉米的遍在蛋白啟動子(Christensen等，1992)；甘蔗badnavirus啟動子；和水稻的肌動蛋白啟動子(McElroy等，1990)。所有這些啟動子已經用來產生在植物中表達的各種類型的DNA構成物。在這方面請參見例如PCT國際說明書WO 84/02915。與由其天然啟動子驅動的基因表達水平相比，這些啟動子中的許多啟動子可以提高基因表達水平。在某些情況下，基因表達的增加使得抗性水平提高。
在適用于本發明方法的DNA構成物中有用的啟動子可以根據其賦予對病原體侵染應答特異性表達編碼序列的能力來選擇。病原體對植物的侵染觸發了稱為防衛相關基因或致病相關(PR)蛋白的多種蛋白的誘導(Bowles，1990；Bol等，1990；Linthorst，1991)。這種防衛相關或PR基因可以編碼參與苯丙類(phenylpropanoid)代謝的酶(例如苯丙氨酸脫氨酶、查爾酮合酶)、修飾植物細胞壁的酶(例如富羥脯氨酸糖蛋白、富甘氨酸蛋白、過氧化物酶)、降解真菌細胞壁的酶(例如殼多糖酶、葡聚糖酶)、奇異果甜蛋白樣蛋白或尚未知功能的蛋白。已經從許多植物種中分離并鑒定了防衛相關或PR基因。這些基因的啟動子可以用來在用相應病原體攻擊轉基因植物時驅動非寄主抗性基因及其生物功能等同物的表達。例如，這種啟動子已經得自從馬鈴薯植株(Eritzemeier等，1987；Cuypers等，1988；Logemann等，1989；Matton等，1989；Schroder等，1992)或從蘆筍(Warner等，1993)中分離的防衛相關或PR基因。或者，可以使用病原體誘導型啟動子，例如可得自煙草的PRP1啟動子(Martini等，1993)。
也可以根據在所述植物抗病蛋白最有效的組織中賦予特異性表達的能力來選擇啟動子，所述組織例如對于根專性病原體(例如大豆cyst nematode)為根組織，對葉專一性病原體(例如銹病和霉病)為葉組織或對于主要在頭狀花序致病的病原體(例如禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum))為花組織。
不論怎樣，選擇以驅動R基因在轉基因植物中表達的具體啟動子均應該能夠在植物組織中啟動生物有效量的所述蛋白的表達。能夠驅動這種表達的組成型啟動子的實例是e35S啟動子、FMV35S啟動子、水稻肌動蛋白啟動子、玉米遍在蛋白啟動子、甘蔗badnavirus啟動子和eIF-4A啟動子。
如有需要，可以對用于所述DNA構成物的啟動子進行修飾，以影響其控制特性。例如，CaMV35S啟動子可以連接于ssRUBISCO基因中在無光情況下阻抑ssRUBISCO表達的部分，由此產生在葉片中而不在根中有活性的啟動子。為了本發明的目的，術語“CaMV35S”啟動子包括CaMV35S啟動子的變體，例如通過與操作基因區連接、隨機誘變或控制誘變等衍生的啟動子。此外，可以改變可用于本發明的啟動子，以使其含有多個增強子序列，以有助于提高基因表達水平。這種增強子序列的實例已經由Kay等(1987)報道。
當所述啟動子為近組成型啟動子例如CaMV35S時，在多種轉化植物組織(例如愈傷組織、葉片、種子和根)中發現多肽表達增加。或者，通過采用含有組織特異性啟動子的植物整合型載體，可以將轉化效應導向特定的植物組織。
一個典型的組織特異性啟動子是凝集素啟動子，它是種子組織特異性的。大豆種子中的凝集素蛋白由單基因(Le1)編碼，它僅在種子成熟時表達，占種子總mRNA的約2％至約5％。已經對凝集素基因和種子特異性啟動子進行了全面的表征，并已經用來在轉基因煙草植株中控制種子特異性表達(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。
本發明不僅設計了全長的R基因序列，而且設計了生物功能等同的核苷酸序列。術語“生物功能等同的核苷酸序列”是指如果將它們以使其表達的功能有效的方式引入寄主細胞中，其編碼的肽、多肽和蛋白與SEQ ID NO11-20或SEQ ID NO59所示的部分序列具有相同或相似生物活性的DNA或RNA，包括基因組DNA、質粒DNA、cDNA、合成DNA和mRNA核苷酸序列，而且它們產生參與在植物中誘導有效抗性反應的肽、多肽或蛋白。
生物功能等同的核苷酸序列包括編碼基礎氨基酸序列中保守氨基酸改變的核苷酸序列，其中產生沉默改變。與編碼野生型基因的核苷酸序列相比，這種核苷酸序列含有相應的堿基置換。
除編碼在基礎多肽序列中的保守氨基酸改變的核苷酸序列外，生物功能等同的核苷酸序列還包括含有其它堿基置換、添加或缺失的核苷酸序列。這些核苷酸序列包括含有的遺傳信息與所述cDNA中含有的信息相同的核酸。這種核苷酸序列可以稱為所述cNDA的“遺傳等同修飾形式”，并且可以用本文所述的方法鑒定。
在所述cDNA、質粒DNA、基因組DNA、合成DNA或編碼所述非寄主抗性基因的其它核酸中制造的突變，最好保持所述編碼序列的讀框。此外，這些突變最好不產生可以雜交產生mRNA二級結構(例如回折或發夾)的互補區，因為這可能不利地影響mRNA的翻譯。
雖然可以預定突變位點，但不必預定突變本身的性質。例如，為了選擇給定位點上誘變的最佳特性，可以在靶密碼子上進行隨機誘變。
或者，通過合成含有突變序列、側翼為能夠連接天然cDNA序列片段的限制位點的寡核苷酸，可以在特定位置上引入突變。在連接后，所產生的重新構建的核苷酸序列編碼具有所需氨基酸插入、置換或缺失的衍生形式。
在任一種情況下，都可以通過例如實施例5和6中所述的方法，根據所需病原體活性來篩選所表達的突變體。
所述DNA有用的遺傳等同修飾形式的具體實例包括其核苷酸序列與所述DNA具有高水平同源性(即序列同一性)的DNA。與所述DNA或其相應部分的序列同一性可以為約70％或更高、更優選約80％或更高、最優選約90％或更高。
采用常規DNA-DNA或DNA-RNA雜交技術(Sambrook等，1989)或通過用PCR法擴增，可以容易地分離出這種遺傳等同修飾形式。這些形式當通過常規轉化技術引入通常對真菌病原體敏感的植物細胞中時，應該有能力賦予對這種真菌病原體的抗性。
所述非寄主抗性基因的片段和變體可以由cDNA、質粒DNA、基因組DNA、合成DNA或mRNA編碼。這些核酸與核苷酸序列編碼所述植物R基因的DNA的相應區域或部分、或其相應的mRNA的序列相似性應該為約70％或更高，優選約80％或更高，最優選約90％或更高。
在本發明中，與所述非寄主抗性基因或其片段生物功能等同的核酸包括(1)DNA，該DNA已經通過天然突變或人工突變例如部分核苷酸缺失、插入、添加等改變其長度，使得當以全長的所述序列為100％時，所述生物功能等同序列的長度為該序列的約60％至約120％，最好是約80％至約110％；或(2)核苷酸序列，其含有部分(通常為所述全長的約20％或更低，優選約10％或更低，更優選約5％或更低)、天然或人工突變，使得這種序列編碼不同的氨基酸，但其中所產生的多肽保留所述基因的植物抗病活性。以該方式產生的突變DNA通常編碼與所述核苷酸序列編碼的植物抗病蛋白的氨基酸序列的序列同一性約70％或更高的多肽，優選序列同一性約80％或更高，更優選約90％或更高。
在本發明中，用來產生人工突變的方法不特別受限制，并且這種突變可以用任何本領域常規方法產生。
例如，可以用合適的限制酶處理所述cDNA，以便插入或缺失合適的DNA片段，使得保留正確的氨基酸讀框。在限制性內切核酸酶處理后，可以處理消化的DNA以補平任何突出端，并再連接所述DNA。
也可以通過合成寡核苷酸，所述寡核苷酸含有鄰接能夠連接所述天然cDNA或基因組序列片段的限制位點的突變體序列，也可以在特定的位置引入突變。連接后，所產生的重新構建的序列編碼具有所需氨基酸插入、置換或缺失的衍生物。
或者，可以采用寡核苷酸指導的定點誘變或區段特異性誘變法，產生具有根據所需置換、缺失或插入而改變的特定密碼子的改變的cDNA或基因組DNA序列。
Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Osuna等(1994)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；和Walder等(1986)公開了制備上述改變的典型方法。采用這些方法中的任一種產生的本文公開的DNA序列的生物功能等同物，可以通過采用本領域熟知的技術分析由此編碼的肽、多肽或蛋白來選擇。
編碼R基因的所述DNA的生物功能等同形式包括與針對非寄主抗性基因產生的抗體反應即與其特異性結合而且與所述多肽的生物活性相同或相似的肽、多肽和蛋白的編碼核苷酸序列。這種抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
由于遺傳密碼的簡并性，即在蛋白質中天然存在的大多數氨基酸存在一個以上的密碼子，因此含有的遺傳信息與本發明DNA基本相同、且所編碼的氨基酸序列與所述非寄主抗性基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列基本相同的其它DNA(和RNA)序列，可以用于實施本發明。這種方法也適用于本文討論的其它核苷酸序列。
本發明設計的DNA的生物功能等同形式也包括用來在特定寄主細胞中增強表達的合成DNA。寄主細胞通常具有優選型式的密碼子選擇(Campbell等，1990)。用來在特定寄主中增強表達的合成DNA因此應該反映該寄主細胞中的密碼子選擇型式。
在本發明中，可以采用“BestFit”或“Gap”程序，采用序列分析軟件包(Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI 53711)的默認值，測定序列相似性或同一性。優選的計分矩陣(scoring matrix)是PAM250。
當然本發明也設計了與分離的非寄主抗性基因的序列及其互補序列雜交、且表達時編碼的肽、多肽或蛋白具有的生物活性與天然蛋白相同或相似的核苷酸序列。這種核苷酸序列最好在中等嚴格條件至高嚴格條件(參見Sambrook等，1989)下與所述非寄主抗性基因或其互補序列雜交。典型的條件包括開始在6X SSC、5X Denhardt溶液、100mg/ml魚精DNA、0.1％SDS中于55℃下雜交足夠時間，以允許雜交(例如數小時至過夜)，然后在2X SSC、0.1％SDS中于室溫下洗滌2次，每次15分鐘，然后在0.5-1X SSC、0.1％SDS中于55℃下洗滌2次，每次15分鐘，然后進行放射自顯影。通常，當雜交混合物在0.1X SSC中于55℃、優選于60℃、更優選于65℃下至少洗滌1次時，所述核酸分子能夠雜交。
如果上述核苷酸序列編碼的肽、多肽或蛋白所具有的抗病原體效應與本文鑒定的核苷酸序列編碼的肽、多肽或蛋白的效應相似，則認為上述核苷酸序列具有與所述抗性編碼基因基本等同的生物功能。
用包含非寄主抗性基因的一種或多種表達載體轉化細菌、酵母細胞、植物細胞或整株植株的方法和組合物構成本說明書的進一步方面。衍生自這種轉化方法的轉基因細菌、酵母細胞、植物細胞或植物或得自這種轉基因植物的后代和種子也構成本發明的進一步實施方案。
轉化細菌和酵母細胞的方法是本領域眾所周知的。植物細胞的DNA轉化方法包括農桿菌介導的植物轉化、原生質體轉化、基因轉移到花粉中、注射到生殖器官中、注射到未成熟胚中和粒子轟擊。這些方法中的每種方法均具有不同的優點和缺點。因此，將基因引入特定植物品系中的一種具體方法對于另一植物品種可能不一定是最有效的，但眾所周知哪種方法可用于特定的植物品種。
主要利用根癌農桿菌轉化雙子葉植物、并獲得轉基因植物的方法是本領域熟知的，并且已經推廣用于棉花(美國專利第5,004,863號；美國專利第5,159,135號；美國專利第5,518,908號)、大豆(美國專利第5,569,834號；美國專利第5,416,011號；McCabe等，1988；Christou等，1988)、蕓苔屬(Brassica)(美國專利第5,463,174)、花生(Cheng等，1996；McKentley等，1995)、番木瓜(Yang等，1996)和豌豆(Grant等，1995；Schroeder等，1993；De Kathen和Jacobsen，1990)。Gasser和Fraley(1989)對該領域進行了綜述。
也已經報道了采用電穿孔、粒子轟擊和農桿菌的單子葉植物轉化。在蘆筍(Bytebier等，1987)、大麥(Wan和Lemaux，1994)、玉米(Rhodes等，1988；Gordon-Kamm等，1990；Fromm等，1990；Koziel等，1993；Armstrong等，1995)、燕麥(Somers等，1992)、雞腳草(Horn等，1988)、水稻(Toriyama等，1988；Zhang和Wu，1988；Zhang等，1988；Batraw和Hall，1990；Christou等，1991；Park等，1996)、黑麥(De la Pena等，1987)、甘蔗(Bower和Birch，1992)、葦狀羊茅(Wang等，1992)和小麥(Vasil等，1992；Weeds等，1993)中已經達到了轉化和植株再生。Davey等(1986)和Davey等(1989)也綜述了單子葉植物轉化和植株再生的技術。
本文所述的研究可以用來分離功能性R基因、NHI和/或激衛素結合蛋白，以及用來將這些基因轉移到目的作物中，以產生昆蟲抗性或抗病性。
實施例以下實施例進一步闡明本發明。它們不能解釋為限制的范圍和含義。實施例1用于馬鈴薯晚疫病防治的煙草R基因的鑒定從煙草基因組中分離出R基因，隨后將這些基因轉移到馬鈴薯中，可以使得產生抗致病疫霉的轉基因馬鈴薯植株。已經克隆了誘導煙草HR的致病疫霉激衛素INF1的事實(Kamoun等，1997)，促進了具有抗致病疫霉的功能活性的煙草R基因的克隆。為了有助于顯現HR細胞，一個優選的方法是將受侵染葉片組織在含有1份乳酸酚藍(0.5mg/ml錐蟲藍、0.25g/ml苯酚、25％甘油、25％乳酸)和2份96％乙醇的溶液中煮沸，然后在2.5g/L水合氯醛中脫色過夜(Shipton和Brown，1962)。
為了分離R基因同系物的多個部分，設計退火至R基因中保守區的引物。I類R基因編碼具有一個核苷酸結合位點和一段保守的具有共有序列“GLPLAL”的氨基酸序列的蛋白。
用于I類基因的引物組1由示于SEQ ID NO40-41的引物組成。用于I類基因的引物組2由示于SEQ ID NO42-43的引物組成。SEQ ID NO42可以用SEQ ID NO44或SEQ ID NO45中所示引物中任一種取代。
II類R基因編碼具有一個保守的推定膜錨著點的蛋白。示于SEQ IDNO46-47的引物被成功地用來分離該類R基因同系物。SEO ID NO47中的引物可以用SEQ ID NO48中所示引物取代。
采用與上述一種引物相似或相同的引物和Gibco BRL試劑系統(產品目錄號10198-018；Lige Technologies，Gaithersburg，MD)，在廠商建議的標準條件下進行PCR反應(于94℃變性1分鐘，于48-52℃退火1分鐘，于72℃延伸2分鐘，總共進行35個循環)，獲得所述R基因同系物片段。將PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，通常顯示為一條0.5kb的主帶。然而，將凝膠純化的條帶在載體PCRscipt(Stratageng，La Jolla，CA)中亞克隆，并按照廠商的程序(ABIPRISMTM染料終止循環測序，Perkin Elmer，Foster City，CA)進行各個擴增產物的序列分析，證明出現的每個條帶均含有幾十種不同的R基因同系物片段。為了保證鑒定盡可能多的亞類，可以在相同條件下使用上述引物，以不僅從煙草中分離R基因同系物，而且從近緣植物種Solanum microdontum中分離R基因同系物。將從這些植物種中分離的200多種R基因同系物片段進行序列對比，并根據氨基酸水平的同源性將其分為不同的亞類。根據成員間同一性至少約70％或成員能夠在DNA印跡上雜交的能力來定義每個亞類。
鑒定出許多不同亞類后，下一步是使用這些亞類的代表性成員對DNA印跡進行探測，以確定R基因同系物的總數。采用標準引物T3和T7(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，從相應的質粒擴增了I類10個不同的亞類代表(SEQ ID NO21-30)和II類的6個不同的亞類代表(SEQID NO31-36)。擴增的片段隨后用Prime-It II(Stratagene，La Jolla，CA)標記，并將一等份5×107cpm加入15ml Rapid-hyb緩沖液(Amersham，Arlington Heights，IL)，以用含有植物DNA消化物的Hybond-N+濾膜(Amersham，Arlington Heights，IL)進行DNA印跡實驗。16個不同的雜交實驗顯現在煙草中總共約350種R基因同系物，其中200種I類同系物和150種II類同系物。從S. microdontum中分離的探針看來在含有煙草DNA的濾膜上顯現R基因同系物中與煙草探針同樣有效，證明R基因同系物在近緣植物種間是保守的，并且表明采用內源和異源探針的適用性。采用選擇的16種探針顯現這種大量的R基因同系物的能力暗示這些探針以及因此相應的DNA序列在分離煙草功能性R基因方面的重要性，預期煙草功能性R基因中的許多基因與這些DNA片段中任一種具有高度同源性。生物功能性R基因應該含有與選定的16種DNA片段(SEQ ID NO21-36)中任一序列的序列相似性約70％或更高的約180個氨基酸的區域，所述序列相似性優選約80％或更高，最優選約90％或更高。也將濾膜與Pam Ronald(University of California，Davis)提供的番茄Pto基因以及兩種番茄Xa21同系物雜交雜交，顯示約40多個條帶。全長文庫的構建產生衍生自SLJ44024(Jones等，1992)的改進雙元粘粒載體04541，命名為04541M，它除含有新霉素磷酸轉移酶(NptII)基因外，還在T-DNA的兩個邊界之間含有由玄參花葉病毒35S啟動子驅動的INF1基因(圖1)。通過首先用SEQ ID NO49-50中所示引物擴增編碼PR1a基因(Hammond-Kosack等，1994)的信號肽的DNA序列，也用SEQID NO51-52中所示引物擴增INF1基因(294 bp；從US-8基因型致病疫霉的基因組DNA中分離)，構建04541M載體。用XbaI-KpnI和KpnI-BglII分別消化擴增的信號肽序列，并將其亞克隆到用XbaI和BamHI消化的質粒載體pMON11770(圖2)中。所產生的質粒含有一個盒，該盒按序列包含玄參花葉病毒35S啟動子、PR1a信號肽序列、INF1基因和胭脂堿合酶(nos)基因的轉錄終止序列。將含該盒的HindIII-SmaI DNA片段亞克隆到pBluescript(Strategene，La Jolla，CA)，并用HindIII和HincII線性化。最后，用HindIII和XhoI從該載體中釋放該盒，并克隆到用相同酶消化的雙元粘粒載體04541中。
采用GigapackIII Gold系統(Stratagene，La Jolla，CA)，將原始04541載體和新的04541M載體轉導到大腸桿菌MR細胞中，并通過三親本交配接合到農桿菌ABI中(Ditta等，1980)。ABI是一種A208根癌農桿菌菌株，攜帶解除武裝的(disarmed)的pTiC58質粒pMP90RK(Koncz等，1986)。讓農桿菌于30℃在含25μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培養基(每升10g胰胨、5g酵母和5g NaCl)中生長。讓含有輔助質粒pRK2013的大腸桿菌在含有50μg/ml卡那霉素的LB培養基中生長過夜。帶有所述雙元粘粒載體的大腸桿菌在含10μg/ml四環素的LB培養基中生長。在所有培養物生長后，將4ml LB加入含ABI、大腸桿菌(pRK2013)和大腸桿菌(雙元粘粒載體)各100ml的試管中。將該混合物用微量離心機(microfuge)離心1分鐘，并傾出上清液部分。將沉淀部分再懸浮于剩余的液體中，將一等份吸移到LB瓊脂平板的中心。于30℃生長過夜后，將一等份取自該平板的細胞在補充2μg/ml四環素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的LB平板上劃線接種。于30℃生長24-48小時后，由于“三親本”交配而在選擇平板上出現菌落。從該平板選擇4個單菌落，將每個菌落分別接種到補充2μg/ml四環素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的LB液體培養基中，并于30℃生長。通過對分離自農桿菌菌株的質粒DNA進行限制分析，證實存在完整的T-DNA。
將攜帶04541的農桿菌菌株注射到煙草和N.Benthamiana的胞間隙中，正如所預料，沒有產生任何表型，并且注射的組織看來與注射缺乏粘粒載體的農桿菌菌株的組織相同。然而，在將04541M注射到煙草葉片中后產生嚴重的壞死反應，表明INF1的瞬時表達的確在煙草中激發HR。在N.benthamiana中，在對注射組織的死細胞進行錐蟲藍染色后，僅能觀察到有限量的壞死。在N.benthamiana中INF1誘導的壞死量低于在煙草中誘導的壞死量的5％。這些結果表明(1)煙草含有合適的基因以識別疫霉激衛素INF1，并且這種識別激發快速強烈的HR，而(2)N.benthamiana不含有與煙草一樣強的識別INF1的合適基因，或在識別INF1時不能激發快速強烈的HR。因此，這些看來是識別INF1的能力和對致病疫霉抗病性之間存在明確關系。
假定R基因在識別INF1中起作用，我們計劃根據在N.benthamiana中激發依賴于INF1的HR的能力來篩選R基因同系物。為此，從煙草幼葉中分離基因組DNA，用SauIIIA部分消化，用小牛堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)處理以除去3’-OH基團，與用BamHI消化的04541M連接，并用Gigapack III Gold系統(Stratagene，LaJolla，CA)轉導到大腸桿菌MR細胞中，以產生平均插入片段大小為20千堿基對的2×106個克隆的雙元粘粒文庫。
用先前用于初始DNA印跡分析的所有亞類特異性探針，篩選所述煙草雙元粘粒文庫。我們按常規同時使用5種不同的探針篩選該文庫。與所述亞類特異性探針(DRQ ID NO21-36)雜交的所有雙元粘粒載體均用R基因引物(SEQ ID NO40-41)進行PCR分析，以確證存在至少R基因同系物的部分。隨后將這些“陽性”粘粒接合到根癌農桿菌中，以產生用于瞬時轉化植株或穩定轉化植物的菌株。實施例2非寄主誘導型基因的分離在非寄主防衛信號活動中起作用的基因的超量表達可以增強感病植物的抗病性。為了鑒定這種非寄主誘導型基因(NHI)，進行以下實驗。提取RNA用TRIzolTM試劑，按照廠商的方案(Life Technologies，Gaithersburg，MD)從以下植物葉片中提取RNA煙草葉片，用致病疫霉攻擊侵染后4小時煙草葉片，經噴水模擬處理后4小時煙草葉片，用致病疫霉攻擊侵染后18小時煙草葉片，經噴水模擬處理后18小時扣除按照廠商的方案(Clonetech，Palo Alto，CA)進行以下PCR選擇的cDNA扣除(PCR-select cDNA subtractions)，以選擇在抗性植物中由致病疫霉主要誘導的基因從“1”中的cDNA中扣除“2”中的所有cDNA，產生庫I從“3”中的cDNA中扣除“4”中的所有cDNA，產生庫II候選基因的選擇將扣除的cDNA庫克隆到pGEMT載體(Promega，Madison，WI)。采用標準T7和M13反向引物(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，經PCR從該載體擴增扣除的克隆，并一式兩份點樣到尼龍膜(Amersham，Arlington，Heights，IL)上。一式兩份的膜與用TRIzolTM試劑(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)從抗性植株或感病植株中分離的信使RNA衍生的cDNA探針雜交。選擇與抗性探針的雜交強于與感病探針雜交的斑點，用于進一步的RNA印跡分析以證實其表達。
用于RNA印跡分析的濾膜含有分離自以下的10微克RNA煙草葉片，在用致病疫霉攻擊侵染后0、4、8和18小時煙草葉片，在經噴水模擬處理后0、4、8和18小時按優先序排列先后位置(lead)根據RNA印跡資料，采用以下標準對候選物按優先序排列1.在受侵染煙草植株中的誘導強于模擬處理的煙草植株2.在侵染后4小時的誘導強于侵染后18小時3.在受侵染煙草中的誘導強于受侵染的感病馬鈴薯和/或benthamiana中的誘導4.或者明確參與上游信號活動的編碼蛋白(例如受體、激酶和轉錄因子)或具有酶功能的編碼蛋白全長cDNA的分離為了分離全長cDNA，用SMARTTM cDNA文庫構建試劑盒(Clonetech，Palo Alto，CA)按照廠商的建議制備煙草cDNA文庫。該文庫產生的總共2×106個獨立的克隆，并在40-50個平板(150×15mm)中擴增。對于每個完整的文庫，收集每個平板的裂解液，并作為亞庫單獨貯存。
對于每個候選基因，根據得自扣除克隆的序列設計特異性引物。基因特異性引物用來對所有亞庫篩選含有至少一個陽性cDNA的亞庫。用雙元質粒載體亞克隆全長序列構建雙元載體pMON30656(圖5)，以有助于克隆并隨后分析抗性相關基因。該載體允許以一個步驟亞克隆分離自SMART文庫的全長基因，因為它在玄參花葉病毒的35S啟動子和具有根癌農桿菌pTiT37胭脂堿合酶基因終止信號的非翻譯尾隨序列之間含有一個獨特的SfiI位點。該載體也含有Lox-P位點，該位點允許從植物基因組中拯救目的基因。或者，可以通過用PacI將DNA片段化來拯救目的基因。片段化的DNA需要隨后自身連接，以產生除含有目的基因外還含有賦予細菌對卡那霉素和新霉素抗性的kan基因和細菌質粒pACYC184的復制起點的質粒結構。實施例3從煙草中分離激衛素結合蛋白為了分離可以激活基于識別致病疫霉激衛素導致誘導HR的信號轉導途徑的非R基因的植物因子或受體，使用酵母MATCHMARKER雙雜種(Clonetech，Palo Alto，CA)。按照廠商的方案構建煙草MATCHMARKER cDNA文庫，并用來根據與致病疫霉激衛素INF1相互作用的能力來進行篩選。篩選了總共3×106個克隆，已經鑒定出6個陽性克隆。其中一個名為Nhr1(SEQ ID NO60)的陽性克隆含有兩個鋅指樣結構域和一個bromo結構域，提示Nhr1可能是一種轉錄調節物或信號蛋白。
為了分離Nhr1的全長基因，構建了含有所述FMV啟動子控制之下的INF1基因和平均大小為20千堿基對的煙草DNA片段的雙元粘粒文庫，并用Nhr1篩選。將陽性克隆接合到農桿菌中，將所產生的菌株的過夜培養物重懸浮于0.1×MS培養基(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中，并稀釋至OD600＝1.0，并如下所述將該培養物注射到Nicotianabenthamiana胞間隙中。實施例4篩選功能基因的植物系統的鑒定為了獲得基因活性的初步證據，需要允許根據功能活性篩選煙草R基因、NHI和推定激衛素受體的模型植物系統。該植物系統應該(1)高度容易瞬時轉化，(2)對目標病原體致病疫霉和典型病原體例如丁香假單胞菌易感，和(3)對于INF1肽不敏感。Nicotiana benthamiana符合所有這些標準。為了確定瞬時轉化效率，將OD600＝0.1的攜帶編碼在T-DNA兩個邊界之間的綠色熒光蛋白(GFP)的基因的農桿菌菌株注射到N.benthamiana葉片的胞間隙中。注射后3天，用以下方案分離原生質體將葉片切成小塊，并用含2％纖維素酶、0.5％離析酶R-10、0.5M蔗糖和5mM CaCl2的溶液消化2.5小時。使消化的產物流過40微米篩，并以80-100xg離心4分鐘。然后將飄浮的原生質體轉移到新試管中，并通過光學顯微鏡計數。隨后，通過UV輻射測定發熒光的原生質體數。通過將原生質體總數與發熒光原生質體之比乘以100，確定轉化細胞的百分比。如表1所示，該實驗和采用GUS基因代替GFP基因作為報道基因的相似實驗證明了轉化率約為90％。
表1.在從農桿菌感染的葉片中分離的原生質體中的基因表達
用分別在T-DNA邊界之間攜帶編碼綠熒光蛋白(GFP)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的農桿菌菌株注射葉片。GUS基因被一個內含子間斷，以防止細菌基因表達。GFP基因由玄參花葉病毒的35S啟動子驅動；GUS基因由花椰菜花葉病毒的35S啟動子驅動。所用的農桿菌菌株分別是ABI和GV2260。浸潤后2天，監測原生質體的自身熒光，以確定GFP表達細胞的頻率。通過用X-葡糖苷酸將原生質體染色，測定GUS表達細胞的頻率。數據是GFP的7個獨立實驗的平均值，是GUS的3個獨立實驗的平均值。
人們對于N.benthamiana對在其它近緣植物(例如煙草)無毒的真菌病原體的反應知之甚少。為了確定N.benthamiana對致病疫霉的感病性，用8000個孢子/ml的基因型US-1和US-8侵染6周齡的植株。同時侵染煙草和馬鈴薯植株分別用作抗性對照和感病性對照。將受侵染的植株置于潮濕的17℃生長室中，在黑暗中放置約40小時，以保證侵染，然后將其轉移至18℃生長室，光周期為16h光/8h黑暗，以產生晚疫病癥狀。侵染后5天，N.benthamiana植株大范圍衰萎。用錐蟲藍染色并用水合氯醛脫色(Keogh等，1980)的受侵染葉片的顯微鏡分析證明在病灶中存在嚴重的真菌生長。正如所預期，在煙草上沒有觀察到病癥，而馬鈴薯植株在所有地上組織中均表現出嚴重的病癥。
用包含谷胱甘肽-S-轉移酶和INF1的純化融合蛋白證明了N.benthamiana對INF1肽的敏感性低。這種融合蛋白通過以下步驟產生(1)用SEQ ID NO53-54所示引物擴增INF1基因，(2)將擴增的DNA片段亞克隆到pCRscript(Stratagene，La Jolla，CA)中，(3)用BamHI和NotI從該載體中釋放INF1基因，(4)將含INF1的BamHI-NotI DNA片段亞克隆到pGEX-5X-3(Pharmacia，Piscataway，NY)中，(5)在大腸桿菌中表達GST-INF1融合物，和(6)如先前所述(Zhang等，1995)純化該融合蛋白。使用8葉期的植株，用所述純化蛋白注射第3片葉。注射后2天，不足10％的接種區產生過敏性壞死反應。因為在煙草中相似的實驗在整個接種區產生壞死，所以可以推斷出N.benthamiana對于INF1的敏感性至少比煙草低10倍。
在兩組實驗中證明了用N.benthamiana來篩選功能性抗病R基因的原理。首先，表明用番茄R基因Pto穩定轉化N.benthamiana產生有效的抗病性(Rommens等，1995)。其次，N.benthamiana的葉片用煙草抗病R基因N(具有新霉素磷酸轉移酶作為植株選擇標記和壯觀霉素抗性作為細菌標記的質粒SPDK167，由Barbara Baker博士提供，USDA，Albany)瞬時轉化，并在3天后用病毒病原體煙草花葉病毒(TMV)攻擊。攻擊感染后5天，轉化組織產生過敏反應(HR)，表明N基因在N.benthamiana中發揮有效活性。在用GFP基因瞬時轉化并用TMV感染的對照植株中沒有觀察到HR反應。實施例5通過篩選R基因同系物和NHI鑒定功能基因篩選R基因同系物在含有適當抗生素的液體肉湯中將農桿菌菌株培養約2天，以根據同時存在農桿菌和粘粒載體進行選擇。沉淀農桿菌細胞并將其在TT培養基(含有Gamborg維生素[Sigma MS B5鹽]、3.9g/L MES pH 5.4、20g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的0.1 X Murashige和Skoog基礎培養基)再懸浮至OD600＝0.05。用1ml注射器將細胞懸浮液注射到N.benthamiana葉片的胞間隙中。預期識別疫霉屬激衛素INF1的R基因在N.benthamiana瞬時表達系統中在INF1蛋白存在下將誘導HR。注射了總共181種帶有I類R基因的菌株。在7例中，注射導致在注射后3天內產生快速HR。相應的R基因命名為R1-R7。對前6種R基因的P回折和GLPLAL區之間的0.5kb片段的序列分析表明，這些基因最類似煙草R基因N。第7種R基因同系物僅誘導弱HR。該同系物看來與番茄R基因Prf的同源性最高。為了證實由R1-R7誘導的HR是依賴于INF1的，用插入無INF1基因的雙元粘粒載體04541中的煙草基因組DNA片段構建了第二文庫。用來與這種第二文庫雜交的探針通過以下步驟產生(1)用引物SEQ ID NO40-41擴增R1-R7的P回折-GLPLAL區，和(2)合并并放射性標記這些擴增的片段。將雜交陽性克隆接合到農桿菌中，并將所產生的菌株的細胞懸浮液(OD600＝0.05)與等量的農桿菌菌株細胞混合，所述農桿菌菌株或者含有攜帶GFP基因的雙元粘粒，或者含有攜帶INF1基因的雙元粘粒。然后將混合菌株注射到N.benthamiana的胞間隙中。如表2所示，R1-R7基因的10種同系物能夠強有力地增強由INF1誘導的HR反應。激發依賴于INF1的HR的R1-R7基因的10種煙草同系物命名為Enh1-Enh10(INF1誘導的HR的增強子(enhancer ofINF1-induced HR))。Enh1-Enh10的部分序列分別示于SEQ ID NO1-10。圖3顯示氨基酸序列SEQID NO11-20的序列對比，證明這些R基因共有高水平的同源性。表2.N.benthamiana對一個亞組的R基因與或者INF1或者GFP瞬時共表達的反應。
為了根據在INF1存在下激發HR的能力篩選R基因同系物，用以下農桿菌菌株共注射植物一種菌株含有R基因同系物，而另一種菌株含有INF1基因。作為對照，用攜帶GFP基因的農桿菌菌株共注射攜帶R基因同系物的農桿菌菌株。注射后4天和7天(DAI)，確定HR程度。“-”＜10％注射組織發生HR反應；“+”10-20％HR；“++”20-50％HR；“+++”50-100HR。
可以通過農桿菌介導的轉化，將攜帶功能未知的煙草R基因同系物的雙元粘粒載體穩定引入N.benthamiana中。以這種方式可以產生轉基因N.benthamiana植物的文庫，每一不同植株表達至少一種煙草R基因。為了限制需要進行的獨立轉化數目，我們將約180種含有具I類R基因同系物的雙元載體的農桿菌菌株分為18個庫，每個庫10種菌株。每個庫產生25個轉基因N.benthamiana系。由不同庫分離的種子可用來根據對在煙草中無毒而在N.benthamiana中有毒性的任何病原體的抗病性進行篩選。表達對這種病原體抗性的轉基因N.benthamiana可能含有功能性煙草R基因。用對鄰接所述煙草DNA插入片段的T-DNA序列特異性的引物，通過PCR反應(例如大尺度(long range)PCR或反向PCR)測定這種R基因的序列。然后可以通過用合適的載體克隆和轉化，將這種R基因引入任何目的作物中，以在該作物中產生抗目標病原體的抗病性。
在本申請中已經描述了與R基因具有同源性的許多序列。這些基因中的任一種均可以用作探針，以研究抗性在植物分離群體中的分離。這樣，有可能在DNA印跡上鑒定出與抗性共分離的條帶。這些條帶是抗性的良好標記，并且因此可以用于育種程序中。另外，這些條帶可以顯現分離的R基因本身。因此，本文所述的R基因同源序列可用于R基因的作圖和分離。例如，我們已經在含有抗US-8基因型致病疫霉抗性分離的馬鈴薯植株DNA的DNA印跡上，測試了作為探針的上述所有亞類代表性DNA片段。我們在標準條件下用引物SEQ ID NO40-41從煙草DNA擴增的DNA片段，在許多抗性植株中鑒定出一個在感病植株中總是缺乏的條帶。將活性R基因同系物穩定轉化到N.benthamiana中為了檢查Enh基因增強INF1誘導的HR的能力是否增強轉基因N.benthamiana植株抗致病疫霉的抗病性，通過農桿菌介導的轉化將10種不同的Enh基因(SEQ ID NO1-10)引入這種植物種中。如下進行這些轉化。用無菌種苗繁殖的小植株產生葉圓盤，將其置于固體MS104預培養平板上，所述平板中已經加入2ml液體TXD培養基(4.3g/L MS鹽、2ml/L Gamborg B-5 500x、4mg/L對氯苯氧乙酸、0.005mg/L激動素、30mg/L蔗糖，pH5.8)和無菌Whatman圓濾紙。葉圓盤在溫室(23℃，連續光照)下預培養1-2天后，將過夜生長培養物在補充四環素(2mg/L)、氯霉素(35mg/L)和卡那霉素(50mg/mL)的LB培養基中稀釋10倍獲得的7ml農桿菌懸浮液，加入所述預培養平板中。15分鐘后，吸出過量的農桿菌，將外植體與其余的農桿菌細胞共培養2-3天。然后將外植體轉移至含有羧芐青霉素(500mg/L)、頭孢噻肟(100mg/L)和萬古霉素(150mg/L)的MS104(4.4g/L MS堿性鹽+B5維生素、30g/L蔗糖、1.0mg/L6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L α-萘乙酸、9g/L瓊脂)平板上。3天后，將外植體轉移至含有羧芐青霉素(500mg/L)、頭孢噻肟(100mg/L)、萬古霉素(150mg/L)和卡那霉素(300mg/L)的MS104平板上，以進行轉基因細胞的選擇和再生。從愈傷組織切下伸長并含有頂端分生組織的嫩枝(shoot)，將其在含有羧芐青霉素(500mg/L)的MSO培養基(4.4g/L MS堿性鹽+B5維生素、30g/L蔗糖、9g/L瓊脂)上培養。隨后將生根的嫩枝轉移至4”盆中，以產生轉基因小植株。這些小植株和未轉化的對照在18℃生長室中生長，光周期為16h光/8h黑暗。3周后，用每毫升約104US-8基因型致病疫霉的孢子囊侵染植株。將接種的植株在潮濕、黑暗的17℃生長室中放置約40小時以確保侵染，隨后將其轉移至18℃生長室中，以產生晚疫病癥狀。在接種后3、4和5天，通過估計病變葉片組織的百分比評價病害嚴重程度。
大多數轉基因植株以與對照植株相似的方式對致病疫霉侵染反應，并在注射后5天顯示出嚴重的病癥，45％-50％的葉片組織衰萎。然而，31株Enh3(SEQ ID NO3)中的2株沒有表現出任何病癥并顯示出抗性。觀察到在含有Enh6(SEQ ID NO6)的40株植株中的1株(致病疫霉損害5％的葉片組織)和攜帶Enh9(SEQ ID NO9)的30株植株中的1株(致病疫霉損害15％的葉片組織)的抗性水平幾乎相同。為了確定抗性是否由于存在所述轉基因，使抗性轉基因植株自交。將得自Enh6和Enh9植株的轉基因種子種植于土壤中，以產生兩個所述轉基因分離的群體。第三個群體得自未轉化對照植株的種子。抗性Enh3系看來無菌，不能用于進一步分析。萌發后6周，用每毫升約104US-8基因型致病疫霉的孢子囊侵染植株。病原體侵染后5天，Enh6和Enh9分離的群體中衰萎葉片組織的平均百分比均是33％。在對照植株中致病疫霉誘發的損害高得多，平均為55％。
因此，Enh6和Enh9(和可能Enh3)在N.benthamiana中賦予對致病疫霉的部分防治。因為這三種基因共享高水平的序列同源性，它們最可能具有相似的作用方式。這種作用方式可能基于INF1誘導的HR的增強。有可能Enh基因的超量表達將導致抗病性的進一步增強。此外，有可能Enh基因或這些基因的同系物參與對其它疫霉菌種的抗性，所述其它疫霉菌種包括大雄疫霉、德雷疫霉(P.drechsleri)、辣椒疫霉(P.capsici)、惡疫霉(P.cactorum)、隱地疫霉(P.cryptogea)和樟疫霉(P.cinnamomi)，因為它們均編碼在結構上與INF1非常相似、并且在煙草中均誘導HR的激衛素(Yu，1995)。甚至可能這些基因提供對產生INF1樣激衛素的其它病原體(例如鐘器腐霉(Pythium vexans)的抗性。對致病疫霉的煙草非寄主抗性的可持久特性可能部分緣于這樣一個事實煙草含有至少4個參與識別激衛素INF1的功能性R基因。
為了證明識別INF1的R基因在防治非致病疫霉的疫霉方面的適用性，我們分離了大豆疫霉腐爛病的病原體大豆葉斑疫霉的激衛素編碼基因。通過用SEQ ID NO55-56所示的兩種引物，對大豆葉斑疫霉的總DNA進行PCR，可以分離出該基因。可以將PCR產物亞克隆到PCRscript載體(Stratagene，La Jolla，CA)中，并對其測序以證明所擴增DNA的完整性。可以將用KpnI和BglII消化的含有INF1同源基因的300bp片段與用XbaI和KnpI消化的PR1基因(Hammond-Kosack等，1994)的100bp信號肽序列連接，并將其亞克隆到pMON11770載體(圖2)中。然后可以純化含有FMV啟動子、信號肽、大豆葉斑疫霉激衛素和nos終止子的NotI消化片段，并將其亞克隆到pMON17227(圖4)T-DNA雙元載體中。可以選擇成功的克隆，并將其接合到農桿菌中用于進一步測試。
Enh基因增強HR活性可能不限于疫霉激衛素。有可能Enh基因的表達或超量表達導致對病毒、細菌或真菌病原體的廣譜防治。這可能由于參與抗病性的信號途徑的自發誘導。篩選NHI通過用毒性細菌病原體煙草假單胞菌(“野火病”的病原體)處理瞬時表達這些基因的N.benthamiana葉片，可以獲得抗性相關基因活性的指示。為此，用攜帶含目的基因的pMON30656(圖3)衍生物的農桿菌菌株注射葉片的右側半。作為對照，用含有雙元載體pMON30656的農桿菌菌株注射葉片的左側半。注射后2天，用細菌懸浮液注射葉片的左側半和右側半。該懸浮液通過用10mM MgCl2洗滌煙草假單胞菌的過夜培養物，并將該懸浮液稀釋至OD600為0.001(相當于106菌落形成單位)而獲得(Rommens等，1995)。病原體攻擊后4天，將葉片右側半的病害進展與對照左側半的病害進展比較。
至今以該方式分析的兩個基因中，表明一個基因的表達部分防治野火病。TOB-F12(SEQ ID NO58)編碼胡蘿卜(Daucus carota)的21kDa蛋白的同系物，并在N末端區與Xa21共享某些保守的氨基酸，Xa21是一種參與抗水稻細菌病原體黃單胞菌屬抗性的受體激酶(Song等，1995)。測試Nhr1為了證明HR的誘導是依賴于INF1，產生了不含INF1的第二個粘粒文庫。將與Nhr1雜交的克隆接合到農桿菌中，并與在T-DNA邊界之間攜帶或者INF1基因或者編碼綠熒光蛋白(GFP)基因的農桿菌菌株混合。將混合菌株以OD600＝0.3注射到N.benthamiana葉片中。測試的5種菌株中的3種在存在INF1時在注射后3天內誘導HR。全部5種株均在5天后產生HR，而且這5種菌株中的一種甚至可以在OD600＝0.1時可誘導HR。這種粘粒Nhr1克隆用來進一步分析在INF1存在下其HR誘導力(表3)。在GFP存在下沒有誘導HR，證明誘導HR的能力是依賴于INF1的。表3粘粒Nhr1在INF1存在下顯著增強HR
(hai接種后的小時數)用Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)的5’/3’RACE試劑盒，按照廠商的方案，分離Nhr1全長的cDNA形式。用于5’RACE的引物是SEQ ID NO61TAA GCC TCT CGA CAC ATG GCSEQ ID NO62TCG GTT GCA CAA TTA GTG GCSEQ ID NO63CGA TTC GTG GCA CAA CAT TC用于3’RACE的引物是SEQ ID NO64TGG TCA AAG TAT TGC CAC CSEQ ID NO65GGG GGA GAA CTG ATT TGC TGSEQ ID NO66TTA GGT GTA CAG TGT ACC CC。實施例6將活性基因克隆到馬鈴薯中以賦予晚疫病抗病性在模型系統中增強HR和/或防衛反應的所有鑒定的非寄主基因是增強作物病害防治的良好候選物。在前一節中描述的研究鑒定出含有在N.benthamiana中瞬時穩定表達時能夠增強INF1誘導型HR的Enh和Nhr1基因的雙元粘粒載體。同樣的雙元載體用來轉化馬鈴薯。
在含有2μg/ml四環素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的2mlLB培養基中，將攜帶具有Enh3基因的雙元粘粒載體(pMON30621；圖7)的農桿菌菌株培養過夜。第二天，用在1升體積中含有4.4gMS鹽(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)、30g蔗糖和2ml維生素B5，pH5.7的MSO培養基稀釋細菌10倍，或直至于600nm下獲得0.1的光密度讀數。
從已經在每升含有4.4g MS鹽、30g蔗糖、0.17g NaH2PO4·H2O、0.4mg鹽酸硫胺素、25g抗壞血酸和0.1g肌醇，pH6.0和0.2％Gelrite瓊脂的PM培養基上，在以下條件下由含多個節(nodes)的枝插(stemcuttings)生長的馬鈴薯植株(Solanum tuberosum)的莖上取下葉片，所述條件為無菌條件，溫度為19℃，光周期為16小時光/8小時黑暗，光強為100μE/sec/m2。將莖切成3-5mm的節段。
在接種之前，將30個莖段置于共培養平板上，用作非接種對照。共培養平板含有0.9％瓊脂固化的愈傷組織誘導培養基，所述培養基含有1X MS鹽、5.0mg/L玉米素核糖核苷、10mg/L AgNO3、3％蔗糖、500mg/L羧芐青霉素、0.3mg/L GA3和0.025mM草甘膦。8周后開始出現嫩枝。在12周內每4周將外植體轉移到至新鮮的嫩枝誘導培養基中。從愈傷組織切下嫩枝，置于用0.2％ Gelrite瓊脂固化的PM培養基上約2周。用所產生的植株產生每次轉化至少包含4個插條的轉基因系。當插條足夠大并且產生根后，立即將每個系的3個插條置于土壤中。
轉基因小植株和得自未轉化對照的小植株在生長室中于18℃在4”盆中生長。約3周后，用約104孢子囊/ml的US-8基因型致病疫霉接種植株。將接種的植株置于17℃、潮濕、黑暗的生長室中約40小時以確保侵染，隨后將其轉移至18℃的生長室，以產生晚疫病癥狀。在接種后3、4和5天，通過估計病害葉片組織的百分比評價病害嚴重程度。對照植株被致病疫霉嚴重侵染，在第3天25％的組織被該病原體損害。侵染后5天，快速的病害發展已經導致83％的葉片組織衰萎。平均“病害發展曲線下的面積”(AUDPC)是感病性水平的一個可靠指示，所有對照植株的AUDPC均為107。某些轉基因系對致病疫霉的感病性與對植株相同，表明在這些系中的所述轉基因或者缺乏或者表達不足。有趣的是，4個轉基因系一致地表現出顯著的抗性增強，在第5天僅有50-60％的病癥。這些系的AUPDC值為60-70。該結果表明，Enh3在馬鈴薯中的表達可以增強對致病疫霉的抗病性。
如上所述將粘粒克隆Nhr1(pMON30620；圖6)穩定轉化到馬鈴薯栽培品種Russet Burbank中。已經產生了總共50個推定的轉基因系。病害試驗表明，6個轉基因系對致病疫霉小種US8的抗性增強。所述6個系中的一個系56433含有全長的Nhr1基因，選擇它來證實其抗性增強。56433和三個載體對照系各6個插條用致病疫霉攻擊，表4總結了病害發展數據。56433系抗性顯著增強，在致病疫霉接種后5天(dai)病害防治率約為37％。56433系的RNA印跡分析表明，Nhr1基因的表達在該植物中非常低，低于煙草中表達水平的1/10。我們提出，Nhr1基因在馬鈴薯中的增強表達可以顯著提高抗性。表4對系56433和載體對照系的病害試驗
實施例7Enh3的全長序列初步數據表明，轉基因馬鈴薯植株中Enh3基因表達水平非常低。有可能在轉基因馬鈴薯植株中高水平的Enh3基因表達將導致Enh3介導的對致病疫霉的抗病性進一步增強。通過超量表達Enh3基因，應該可能進一步提高轉移馬鈴薯植株的抗病性。為了將Enh3基因與啟動子例如胭脂堿合酶基因的啟動子融合，通過ABI PRISM染料終止循環測序(Perkin Elmer，Foster City，CA)測定Enh3的全長基因組序列(SEQ IDNO57)。由于尚不能得到cDNA克隆，因此尚不能預測Enh3與其最密切的同系物-煙草抗病基因N(它具有抗煙草花葉病毒的功能活性)的同源性水平。然而，目前的估計表明，在DNA水平上的總同源性為約65％。
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請代表本發明所屬技術領域的技術人員的技術水平。所有出版物和專利申請均通過引用結合到本文中，其引用程度與具體單獨指明每個單獨的出版物或專利申請引用結合程度一樣。
雖然為了闡明本發明已經進行了詳細描述，但是應該指出，這種具體描述僅用于闡明本發明，在不偏離以下權利要求書限定的本發明的精神和范圍的情況下本領域技術人員可對其進行各種改變。
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權利要求
1.編碼賦予抗植物病原體或激衛素抗性的蛋白的核酸序列的鑒定方法，所述方法包括以下步驟選擇抗目的病原體或激衛素的非寄主植株；回收在所述抗性植株中存在的全長抗性基因同系物；通過用所述同系物轉化對病原體感病的植株的組織，根據功能性篩選所述同系物；用激衛素或病原體攻擊所述轉化的組織；以及觀察對目的病原體的功能活性。
2.按照權利要求1的方法，其中所述抗目的病原體或激衛素的植物顯示過敏反應型抗性。
3.按照權利要求2的方法，其中所述抗目的病原體或激衛素的植物是煙草。
4.按照權利要求2的方法，其中所述抗目的病原體或激衛素的植物是Solanum microdontum accession 498124。
5.按照權利要求1的方法，其中所述目的病原體是致病疫霉。
6.按照權利要求1的方法，其中用SEQ ID NO37-48的引物，采用基因擴增回收所述全長抗性基因同系物。
7.按照權利要求1的方法，其中所述轉化是農桿菌介導的轉化。
8.按照權利要求1的方法，其中所述對病原體感病的植物是Nicotiana benthamiana。
9.按照權利要求1的方法，其中所述用所述激衛素的攻擊通過與所述激衛素的基因共轉化進行。
10.按照權利要求1的方法，其中所述激衛素是INF1。
11.按照權利要求1的方法，其中根據存在依賴于病原體或激衛素的過敏反應，鑒定所述功能活性。
12.核酸區段，其通過對植物病原體的無毒基因應答而賦予植物非寄主抗病性。
13.按照權利要求12的核酸區段，它應答激衛素INF1。
14.按照權利要求12的核酸區段，其包含SEQ ID NO1-10或SEQID NO57或SEQ ID NO58或SEQ ID NO60的核酸序列。
15按照權利要求12的核酸區段，其中所述核酸區段編碼相當于SEQ ID NO11-20的氨基酸序列。
16.核酸區段，其包含SEQ ID NO1-10的核酸序列或其互補序列，或包含在高嚴格條件下與SEQ ID NO1-10雜交的序列。
17.核酸區段，其包含SEQ ID NO21-30的核酸序列或其互補序列，或包含在高嚴格條件下與SEQ ID NO21-30雜交的序列。
18.核酸區段，其包含SEQ ID NO31-36的核酸序列或其互補序列，或包含在高嚴格條件下與SEQ ID NO31-36雜交的序列。
19.核酸區段，其包含SEQ ID NO57的核酸序列或其互補序列，或包含在高嚴格條件下與SEQ ID NO57雜交的序列。
20.核酸區段，其包含SEQ ID NO58的核酸序列或其互補序列，或包含在高嚴格條件下與SEQ ID NO58雜交的序列。
21.核酸區段，其包含SEQ ID NO60的核酸序列或其互補序列，或包含在高嚴格條件下與SEQ ID NO60雜交的序列。
22.重組DNA表達系統，其包含一個其中插入一段異源DNA的表達載體，所述異源DNA通過對植物病原體的無毒基因應答而賦予植物非寄主抗病性。
23.用異源DNA轉化的細胞，所述異源DNA通過對植物病原體的無毒基因應答而賦予植物非寄主抗病性。
24.按照權利要求23的細胞，其中所述異源DNA編碼相當于SEQID NO11-20的氨基酸序列。
25.按照權利要求23的細胞，其中所述細胞選自植物細胞和細菌。
26.按照權利要求25的細胞，其中所述細胞是選自裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物的植物細胞。
27.按照權利要求26的細胞，其中所述細胞是選自以下的作物植物細胞金合歡屬、蘋果、香蕉、大麥、豆科植物、青花椰菜、甘藍、canola、胡蘿卜、柑桔、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、北美黃杉、桉樹、大蒜、葡萄、火炬松、甜瓜、燕麥、油棕、洋蔥、觀賞植物、豌豆、花生、胡椒、楊樹、馬鈴薯、Radiata pine、水稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、楓香屬(Sweetgum)、茶樹、番茄、草坪、藤本植物和小麥。
28.按照權利要求25的細胞，其中所述細胞來自農桿菌屬。
29.按照權利要求23的細胞，其中所述異源DNA插入包含表達載體的重組DNA表達系統中。
30.按照權利要求23的細胞，其中所述植物病原體是致病疫霉。
31.用核酸區段轉化的轉基因植物，所述核酸區段通過對植物病原體的無毒基因應答而賦予植物非寄主抗病性。
32.按照權利要求31的轉基因植物，其中所述植物病原體是致病疫霉。
33.按照權利要求31的轉基因植物，其中所述核酸區段編碼相當于SQE ID NO11-20的氨基酸序列。
34.按照權利要求31的轉基因植物，其中所述植物選自裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。
35.按照權利要求34的轉基因植物，其中所述植物選自金合歡屬、蘋果、香蕉、大麥、豆科植物、青花椰菜、甘藍、canola、胡蘿卜、柑桔、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、北美黃杉、桉樹、大蒜、葡萄、火炬松、甜瓜、燕麥、油棕、洋蔥、觀賞植物、豌豆、花生、胡椒、楊樹、馬鈴薯、Radiata pine、水稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、楓香屬(Sweetgum)、茶樹、番茄、草坪、藤本植物和小麥。
36.用按照權利要求1分離的R基因轉化的植物，所述R基因賦予所述植物對目的病原體的抗性。
37.含有核酸區段SEQ ID NO1-10或SEQ ID NO57或SEQ IDNO58或SEQ ID NO60的診斷試劑盒。
全文摘要
本發明描述了一種分離植物抗病基因的新方法。該方法敘述了在感病植物中瞬時表達大量的從非寄主抗性植物中分離的R基因同系物或非寄主誘導型基因。可以根據或者抗病性或者以過敏反應應答病原體激衛素處理的能力來篩選這些植株。本發明也報道了采用所述方法成功分離出的幾種R基因和非寄主誘導型基因。這些R基因在煙草中激發依賴于致病疫霉遍在性激衛素INF1存在的過敏反應。預期所述R基因既是首次分離出的賦予對致病疫霉抗性的R基因,又是首次報道的參與非寄主抗性的R基因。
文檔編號C12R1/91GK1333833SQ9981253
公開日2002年1月30日 申請日期1999年8月31日 優先權日1998年8月31日
發明者C·M·T·羅門斯, K·M·M·斯沃茲, H·彥, B·張 申請人:孟山都公司