參與馬鈴薯低鉀反應的蛋白和基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于植物基因工程【技術領域】，涉及一個參與馬鈴薯抵抗低鉀反應的關鍵基因StWRKY6及其應用。克隆到與馬鈴薯抵抗低鉀反應顯著相關的StWRKY6，StWRKY6蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示。通過在煙草中過量表達該基因，轉基因株系表型證明，本發明的StWRKY6基因在馬鈴薯抵抗低鉀反應中有顯著功能，這為馬鈴薯抵抗低鉀脅迫分子機理的研究以及對現有馬鈴薯品種的改良提供了新的思路。
【專利說明】參與馬鈴薯低鉀反應的蛋白和基因及其應用
一、【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程【技術領域】，具體涉及一個參與馬鈴薯低鉀反應的關鍵基因StWRKYe及其應用。該基因在馬鈴薯參與低鉀脅迫反應方面具有顯著的功能，可以在馬鈴薯的遺傳育種和品質改良方面進行應用。
二、【背景技術】
[0002]馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)作為我國重要糧食作物之一，具有產量高、營養豐富、可食用加工等特點，對糧食安全保障具有重要意義。在我國的糧食作物中，馬鈴薯是位于水稻、玉米、小麥之后的第四大糧食作物，目前已在世界各地廣泛種植(魏延安，2005)。馬鈴薯也是重要的工業原料，尤其是塊莖與人類的關系尤為密切。但由于馬鈴薯是同源四倍體作物，用常規育種方法改良品種，其過程復雜且需時較長(張鶴齡，2000)。同時馬鈴薯生長過程中會面臨著許多非生物逆境如高鹽、干旱、高溫等；并且大多數品種對這些脅迫敏感。因此通過基因工程手段，培育抗逆性強的馬鈴薯新品種，同時揭示馬鈴薯參與非生物逆境基因的功能，具有重要理論和應用價值。
[0003]植物在生長發育過程中，不僅面臨病害、蟲害等生物逆境的威脅，同時也面臨如機械傷害、干旱、冷、高溫和高鹽等非生物逆境。WRKY蛋白最初是從甘薯(Ipomoea batatas)中發現的一類的轉錄因子，當時命名為SPFl (Ishiguro and Nakamura, 1994)主要參與糖信號途徑的建立。迄今為止，已從擬南芥、野生馬鈴薯、棉花、水稻、大麥、小麥、煙草、可可豆、沙漠豆類、甘菊和甘蔗和中分離出許多的WRKY基因(Chen et al.2000 ；Xu et al.2004 ；Ashida et al.2002 ；Borrone et al.2004 ；Lagace and Matton, 2004 ；Zhang et al.2004 ；Sun et al.2003 ；Lambais, 2001 ；Pneuli et al.2002)。這類蛋白共同特點是在其N端含有高度保守的具有60個氨基酸的WRKY結構域，其中包括一個十分保守的七肽WRKYGQK，WRKY也由此得名。
[0004]已有研究表明，一些WRKY基因參與調控植物對非生物逆境的響應。在擬南芥中有7 個 WRKY 基因(WRKY11，15，22，33，40，53，60)是受傷害誘導表達的(Cheong et al.2002)。在煙草中也發現，WIZZ(—個WRKY蛋白)在植株受到傷害后表達量增加，而且在半小時后達到頂峰(Hara et al.2000)。而煙草的另一個WRKY基因在干旱和熱激的雙重作用下被激活，但對其中任何一個單一因子沒有響應(Rizhsky-et al.2002)。大麥中的WRKY38參與冷害和干旱的信號轉導過程(Mare et al.2004);水稻中有10個WRKY基因受鹽、冷和高溫的誘導表達，表明它們可能參與這些非生物逆境的調控(Qiu et al.2004)。
[0005]在植物所需的三大營養元素中，鉀直接參與植物的生長發育，能量代謝和各種生理功能。當植物生長發育過程中鉀營養缺乏時，會出現明顯的缺鉀癥狀，例如莖桿柔弱，易倒伏；對逆境耐受性降低，葉綠素被分解，葉色發黃，進而導致組織壞死，直接影響農作物的產量和品質。在我國農業生產中，耕地中土壤缺鉀是一個非常嚴重問題，一方面我國現有耕地大約1/4~1/3的土壤出現了缺鉀或嚴重缺鉀，另一方面我國鉀肥資源相當匱乏，鉀肥主要依賴進口。因此耕地土壤中鉀元素已成為限制作物生長的重要因子。馬鈴薯需鉀量最多，鉀能顯著提高馬鈴薯的產量、品質和抗旱耐寒能力。同時鉀對馬鈴薯塊莖的形成和品質具有至關重要的作用(Hans et al.1973 ；Beringe et al.1983),鉀離子通道和鉀轉運體是植物吸收和轉運鉀離子的重要功能蛋白，目前已報道的馬鈴薯鉀離子通道包括SKTI>SKT2>SKT3>KSTI>StKCOl (Thomas et al.1997 ；Zimmermann et al.1998 ；Zimmermarinet al.2008)韓新愛等對28個馬鈴薯品種(系)鉀營養特性的研究表明:低鉀顯著降低馬鈴薯塊莖產量和水分含量，影響加工品質(韓新愛等，2007)。在擬南芥中過量表達AtCIPK23、CBLl/9基因均可增強AKTl的活性，能顯著提高植株對低鉀脅迫的耐受性(Xu etal.2006)。AtCIPK23基因導入馬鈴薯并篩選到耐低鉀脅迫的株系6個，其中3個轉基因株系具有耐低鉀的性狀。推測馬鈴薯中可能存在與擬南芥相似響應低鉀脅迫相似的信號轉導途徑(Wang et al.2011)。近年來，隨著基因組學、蛋白質組學和生物信息學等前沿交叉學科的發展，從分子水平研究馬鈴薯生長發育和適應外界環境的生理機制，特別是闡明馬鈴薯中WRKY轉錄因子參與低鉀反應具有重要的理論和實踐意義。
三、
【發明內容】

[0006]本發明的馬鈴薯中StWRKYe是通過同源比對的方法從西南地方馬鈴薯主栽品種“米拉”中克隆的。該基因全長的⑶S為882bp，編碼一個294氨基酸的可讀框。后續的實驗證明該基因在煙草中超量表達后，能顯著提高煙草對低鉀脅迫的耐受性，目前國內外關于這個基因的功能均未有相關文獻報道。 [0007]本發明的目的在于提供一種參與馬鈴薯低鉀脅迫的StWRKY6基因和蛋白及其應用。[0007]為了實現上述目的，本發明第一方面提供了一種StWRKYe蛋白，它的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO:lo
[0008]本發明的第二個方面提供了編碼StWRKYe蛋白的多核苷酸序列；其中優選的多核苷酸為 SEQ ID NO:2。
[0009]本發明的第三個方面提供了包含上述多核苷酸序列的表達載體，其中優選的表達載體是PBI121。
[0010]本發明的第四個方面提供了包含上述表達載體的細胞；其中優選的的細胞是大腸桿菌DH5a或農桿菌LBA4404。
[0011]本發明通過試驗研究發現，該基因在煙草中超量表達后，采用水培的方法對在MS生長10天的煙草幼苗進行低鉀脅迫，低鉀脅迫10天后發現三個轉基因株系生長正常，葉色翠綠，根系發達，而非轉基因株系子葉明顯變黃，根系較短，表現出明顯缺鉀脅迫癥狀。這為將來該基因在馬鈴薯中的應用奠定了堅實基礎。
[0012]因此，本發明的第五個方面提供了上述的氨基酸序列SEQ ID NO:1或多核苷酸序列SEQ ID NO:2在馬鈴薯抗低鉀脅迫中的應用。
[0013]關于馬鈴薯WRKY6蛋白的功能，至今國內外未見報道。本發明利用克隆的StWRKY6基因在煙草中超量表達，超量表達的StWRKY6基因后可極顯著提高煙草抵抗低鉀脅迫能力，在馬鈴薯體內干涉該基因的表達可以使植物對低鉀脅迫更敏感，這為馬鈴薯的遺傳育種研究提供新的思路。
四、【專利附圖】

【附圖說明】[0014]圖1轉StWRKY6基因煙草目的基因特異引物RT-PCR電泳圖
M =Maker DL2000 ；K:Κ326未轉基因的煙草植株，為陰性對照組，1-9轉基因的煙草
[0015]圖2轉基因株系和對照在低鉀溶液中進行水培情況 左上，左下，右上是轉基因株系；右下是非轉基因材料Κ326 五、【具體實施方式】
[0016]以下結合具體實施例對本發明做出更詳細的描述，根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做適當的修改。
[0017]本發明克隆的馬鈴薯中StWRKYe基因，可以通過農桿菌介導的遺傳轉化方法或其他轉基因方法把基因轉入植物中，通過篩選鑒定獲得轉基因植株或株系均屬于本發明的保護范圍。本發明通過在煙草超量表達該基因可以提高植物的低鉀脅迫能力，在馬鈴薯體內干涉該基因的表達可以使植物對低鉀脅迫更敏感，其在抗逆方面的應用均屬于本發明保護的范圍。
[0018]本發明基 因的克隆與序列分析
本發明基因是根據GenBank公布的馬鈴薯StWRKY6基因編碼序列(登陸號EU056918.1),利用Primer Premier 5.0設計引物，從馬鈴薯品種“米拉”中克隆該基因。所使用的正向引物序列為(5' ATGGATAACTCATCGACTG3'反向引物(5' CTACACTTGATCAAAATTCC3')，通過PCR方法獲得WRKY6全長⑶S序列，然后通過凝膠電泳的方法檢測該基因的長度。
[0019]擴增和測序方法為:
先用試劑盒(購置Takara公司，日本)提取馬鈴薯試管苗全株總RNA，具體過程參見說明書，然后用反轉錄試劑盒(購自Τ0Υ0Β0公司，日本)將mRNA反轉錄為cDNA，具體過程參見說明書，再以此為模板用以上正反引物用高保真酶(購置Takara公司，日本)擴增該基因的全長序列，產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶后，用凝膠回收試劑盒(天根公司，中國)回收目標條帶，具體過程參見說明書。然后克隆至PMD19-T載體(購置Takara公司，日本)，取5 μ L連接產物采用熱擊法轉化大腸桿菌DH5 α感受態，涂布于新配置含有氨芐青霉素的LB固體平板上，37°C培養過夜，采用PCR方法檢測陽性克隆，然后選取3個陽性克隆送到華大基因身為技術公司進行測序。測序結果顯示，克隆基因的全長為882bp，編碼294氨基酸。
[0020]StffRKY6表達載體構建
在擴增的StWRKY6基因的引物兩側分別加上BamH I和Sma I酶切位點，隨后用BamHI和Sma I雙酶切把目的基因從pMD19-T載體切割下來，凝膠電泳后利用凝膠回收試劑盒進行回收，同時對PBI121載體進行BamH I和Sma I雙酶切和回收。然后將目的基因片段與PBI121載體大片段以3: I的比例混合，加入T4連接酶(購自Takara公司，日本)1U，IX反應緩沖液，無菌水補充至1(^1^體系，161:連接16小時，然后把全部連接產物進行熱擊法轉化大腸桿菌DH5ci，涂布于新配置含有氨芐青霉素的LB固體平板上，37°C培養過夜，采用PCR方法檢測陽性克隆，然后選取5個陽性克隆搖菌提質粒，進行酶切鑒定。對獲得的重組質粒利用電轉移儀在1800V的電壓下轉化農桿菌EHA105，用含利福平100mg/L，卡納霉素50mg/L的YEB固體抗性平板篩選轉化陽性菌落，采用PCR方法檢測陽性克隆，然后選取3個陽性克隆送到華大基因身為技術公司進行測序，確定陽性菌株且序列完全正確的菌株保存用于后續的遺傳轉化。
[0021]煙草遺傳轉化
I煙草無菌苗的培養
用70%酒精浸泡I分鐘,再用10%的次氯酸鈉處理40分鐘。然后,用無菌水清洗4遍，在無菌條件下，接種到MS培養基上，放入光照培養箱即可。培養條件:25°C，光照時間16小時，光照強度 70 μ mol.m_2.s_l。
2含有目的基因農桿菌準備
將含有目的基因的農桿菌EHA105在培養養基上劃板，28°C下暗培養兩天；挑取單菌落，接種于5ml含50mg.L-1卡那霉素、慶大霉素及利福平的液體YEB培養基中，28°C下振蕩培養過夜；活化過夜的農桿菌，按1: 50的比例，稀釋到含50mg.L-1卡那霉素的新鮮液體YEB培養基中，繼續培養至OD值約為0.6-0.8 ;取培養物10ml，置于無菌的離心管中，5000rpm離心10分鐘。棄上清；加入5-lOml的MSO培養基，混勻。
3葉盤的制備與預培養
取無菌的煙葉，切去葉緣，將葉片切成約0.5厘米見方的小塊，接種在分化培養基上進行預培養2-3天(注意葉的正面向下)。材料切口出剛剛開始膨大時，即可進行侵染。
4侵染與共培養
在超凈臺上，將菌液倒入無菌的培養皿中，將預培養過的葉盤投入菌液中，浸泡10-15分鐘。然后取出，用無菌濾紙吸去其表面的菌液。將侵染過的葉盤接種在覆有兩層濾紙的分化培養基(MS+6-BA1.0mg.L-1+IAA0.2mg.L-1)上，26°C下暗培養2-3天。取出外植體，用無菌水沖洗3遍。每次沖洗要在搖床上搖0.5-1小時。最后一次沖洗時，水中要放入羧芐青霉素(濃度為500mg.L-1) ο5分化培養、煉苗及移栽
取出葉盤，用無菌濾紙吸去其表面的水分，然后倒置在分化培養基上(含羧芐青霉素500mg.L-1 及頭孢 200 μ g.L-1)，用 Parafilm 封貼培養皿，在 26°C，光強為 70 μ mol.m_2.s-1下進行培養。光暗周期為16/8小時。每隔兩周轉接繼代一次。共培養約30天后，第一個小芽長出。帶小苗長到4-5厘米，根系發達，取出幼苗，洗去培養基，移栽到室內，煉苗7d左右(其中前3d需覆膜保溫)移到室外，最后植入土壤。
[0022]轉基因煙草DNA和RNA水平檢測
選取一部分轉基因株系采用CTAB法進行DNA提取，以提取的DNA為模板進行采用PCR檢測，然后選擇部分DNA水平為陽性株系進行轉錄水平的檢測。首先對提取后的RNA樣品進行反轉錄，然后用StWRKY6特異的引物進行PCR擴增，證明在轉錄水平有目的基因的表達。
[0023]馬鈴薯StWRKY6功能鑒定
把在MS培養基上生長10天的幼苗移栽至低鉀的培養液中進行處理，十天后觀察3個轉基因株系和非轉基因材料K326的表型，發現三個轉基因株系生長正常，葉色翠綠，根系發達，而非轉基因材料K326兩個子葉明顯變黃，根系較短，表現出明顯缺鉀脅迫癥狀。根據這個實驗，說明轉馬鈴薯StWRKY6煙草能夠增強耐低鉀脅迫能力。
【權利要求】
1.StWRKY6蛋白，它的氣基酸序列為序列表SEQ ID N0:1所不。
2.編碼StWRKY6蛋白的多核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于:該序列為SEQID N0:2。
4.包含權利要求2或3所述多核苷酸序列的表達載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于:它是PMD18-T載體或PBI121載體。
6.包含權利要求4或5所述表達載體的細胞。
7.根據權利要求6所述的細胞，其特征在于:它是大腸桿菌DH5α或農桿菌ΕΗΑ105。
8.權利要求1所述的氨基酸序列SEQID NO:1在馬鈴薯抵抗低鉀脅迫中的應用。
9.權利要求2或3所述的多核苷酸序列SEQID NO:2在馬鈴薯抵抗低鉀脅迫中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103965308SQ201310051433
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月24日 優先權日:2013年1月24日
【發明者】李立芹, 黃玉碧, 王西瑤, 魯黎明, 倪蘇, 劉帆, 楊先泉, 王偉 申請人:四川農業大學