專利名稱：櫻桃s基因型的快速鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種快速、低成本鑒定櫻桃S基因型的方法。
背景技術：
櫻桃S基因型的鑒定，均需要提取櫻桃基因組DNA，現有技術常采用CTAB法提取， 具體步驟如下1.將櫻桃葉片去掉主要脈絡后加液氮研磨(可加入適量石英砂)成細粉狀，分裝到1. 5ml離心管中。2.加入 600 μ 1 預熱 CTAB 提取液(Tris 100mM,NaCl 1. 4Μ, EDTA 20mM,2% CTAB, 2% PVP，pH 8. 0)和2%巰基乙醇(現用現加)，混勻，65°C水浴2_4h，期間可顛倒混勻幾次。3.取出離心管，12000rpm 離心 lOmin。4.取上清，加600 μ 1氯仿，混勻，12000rpm離心5min。5.取上清，2V預冷無水乙醇沉淀，用滅菌牙簽將沉淀挑出，晾干后溶于400 μ 1 TE 溶液(10mmol/l Tris · Cl, Immol/IEDTA, pH 8. 0)。6.力卩入 2 μ IRNaseA (10mg/ml)，37°C 2h。7.力口 400μ 1 酚/氯仿(1 1)，混勻，12000rpm 離心 5min。8.重復一次。9.取上清，加500μ 1氯仿，混勻，12000rpm離心5min。10.取上清，2V預冷無水乙醇沉淀，12000rpm離心5min。11.用75%乙醇吹洗沉淀，12000rpm離心3min。12.棄掉液體，12000rpm 離心 anin。13.將多余液體吸出，真空干燥5-lOmin。14.將干燥后的沉淀溶于40μ 1 TE溶液(同上)中，備用。問題在于，現有技術的這種提取方法效率很低，需要5-7小時。而后針對櫻桃S基因型進行PCR反應，對PCR產物進行凝膠電泳及成像鑒定，問題在于，現有技術的PCR反應成本較高。
發明內容
本發明針對上述問題，以現代生物技術為基礎，旨在提供一種鑒定范圍較廣、操作簡便、速度快、成本低的櫻桃S基因型快速鑒定方法，從而為栽培櫻桃合理的配置授粉樹， 實現櫻桃自交親和育種，并未為櫻桃自交親和新品種育種提供理想的種質資源，為鑒定更多的S基因包括S4’基因等提供有效方法。為了達到上述目的，本發明提供了一種鑒定櫻桃S基因的方法，包括如下步驟步驟Sl 櫻桃基因組DNA提取技術，具體過程包括a取100_200mg已經去掉主要脈絡的櫻桃葉片、加Hmg石英砂在液氮輔助下研磨成粉末狀，移入1. 5ml Eppendorf管中，加入600 μ 1緩沖液，混勻；4°C，12000rpm，離心5分鐘；b取上清，加入體積比25 M 1的酚氯仿異戊醇溶液，混勻，4°C， 12000rpm，離心5分鐘；c取上清，加入體積比M 1的氯仿異戊醇溶液，混勻，40C，12000rpm,離心5分鐘。重復1-2次，以蛋白層不出現為止；d取水相，加2. 5倍體積的無水乙醇和1/10體積3mol/L pH5. 3NaAc,混勻。_20°C 放置0. 5小時。4°C，12000rpm，離心5分鐘；e棄上清，用70%無水乙醇洗沉淀1次；f室溫下干燥后，溶于30-50 μ 1 TE或DEPC水中，-20 V或-70 V保存備用。步驟 S2 制備AS-PCR體系10XPCR Buffer 2. 5 μ L，濃度 25mmol · L-1 的 MgC12 1 μ L,濃度 2. 5mmol · L-1 的 dNTPs 0. 5 μ L,序列為5，-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3，濃度為 10 μ mo 1 · Γ1 的上游引物 1 μ L,序列為 5，-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3，濃度為 10 μ mol · Γ1 的下游弓 | 物 IyL,50 IOOng 的 DNA 2 μ L,濃度5U · μ Γ1 的 iTaq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，PCR反應總體積25 μ L ；步驟S3 =AS-PCR反應程序預變性94°C 3min ；94°C變性 lmin，退火 lmin，72°C延伸 lmin，共 30 個循環； 最后72°C延伸IOmin ；步驟S4 將PCR產物進行凝膠電泳及成像鑒定。綜上，根據上述檢測過程，本發明還提供了一種櫻桃S基因型快速鑒定試劑盒，含有PCR Buffer,dNTPs,Taq DNA聚合酶以及DNA Marker。還含有櫻桃S基因的特異性引物對，如下上游引物5，-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3，，下游引物5，-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3，。優選方式下，本發明櫻桃S基因型快速鑒定試劑盒，還包括PCR Buffer :10 X PCR Buffer 2. 5 μ L ；MgCl2 濃度為25mmol · Γ1，用雙蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每個管中1毫升；dNTPs 濃度為2. 5mmol ·廠1，用雙蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每個管中1毫升；引物1 濃度為IOymol · L—1，用雙蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每個管中1毫升；引物2:濃度為IOymol · L—1，用雙蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每個管中1毫升；Taq DNA 聚合酶5U · μ Γ1。
本發明的原理在于根據S基因保守序列設計PCR反應特異引物，該特異引物以櫻桃基因組DNA為模板與變性的基因組DNA單鏈復性，此后在Taq DNA聚合酶的作用下，四種脫氧核糖核苷酸按照堿基配對原則陸續加在該引物的后面，形成子鏈DNA分子。該子鏈DNA 分子作為下一次循環的模板，合成出新一代的子DNA分子，這種過程不斷重復進行，各種S 基因的拷貝大量增加，最后可通過電泳檢測到。本試劑盒在櫻桃的栽培和育種方面都有很好的應用前景。表現在，1.本試劑盒可以確定櫻桃品種的S基因型，為櫻桃授粉樹的配置提供準確的DNA水平上的遺傳基礎，有利于櫻桃授粉樹的合理配置；2.本試劑盒可為櫻桃自交親和育種提供一種十分有效的早期選擇方法，該方法大大地降低了實驗工作量，節省了實驗地和研究經費，使得實驗研究不受季節及植株生長時期的限制；3.通過應用本試劑盒選育出的櫻桃自交親和的純合體種質可為櫻桃自交親和新品種育種提供理想的種質資源。本試劑盒可以鑒定更多的S基因包括 S4’基因，且操作簡便、成本低。因此該技術的推廣使用已具備了市場和技術基礎，具有推廣應用的現實性。特別是本發明的步驟Sl櫻桃基因組DNA提取技術，與現有技術的CTAB法相比，本研究所采用的DNA提取方法提取DNA所用時間為60-65分鐘，而CTAB法所用時間大約為 5-7小時。兩種方法所提取的DNA純度基本一致，均為1. 7-1. 8，都可滿足PCR反應之需。
而在PCR反應成本上，本發明的PCR反應成本要低很多，僅是現有技術類似方法的 43% -58%。見下表。AS-PCR成本核算(一個樣品)
權利要求
1. 一種櫻桃S基因型的快速鑒定方法，其特征在于，包括步驟(Si)櫻桃基因組DNA提取技術，具體過程包括(Sla)取100-200mg已經去掉主要脈絡的櫻桃葉片、加l_2mg石英砂在液氮輔助下研磨成粉末狀，移入1. 5ml Eppendorf管中，加入600 μ 1緩沖液，混勻；、4°C，12000rpm，離心5 分鐘；(Slb)取上清，加入體積比依次為25 24 1的酚、氯仿、異戊醇溶液，混勻，4°C， 12000rpm，離心5分鐘；(Slc)取上清，加入體積比依次為M 1的氯仿、異戊醇溶液，混勻，4°C，12000rpm，離心5分鐘。重復1-2次，以蛋白層不出現為止；(Sld)取水相，加2. 5倍體積的無水乙醇和1/10體積3mol/L pH5. 3的NaAc，混勻；_20°C放置0. 5小時；4°C，12000rpm，離心5分鐘； (Se)棄上清，用、70%無水乙醇洗沉淀1次；(Slf)室溫下干燥后，溶于30-50 μ 1 TE或DEPC水中，-20°C或_70°C保存備用； 步驟(S》制備AS-PCR體系，如下、10XPCR Buffer 2. 5 μ L，濃度 25mmol · L-1 的 MgC12 1 μ L, 濃度 2. 5mmol · Γ1 的 dNTPs 0. 5 μ L,序列為 5，-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3，濃度為 10 μ mo 1 · Γ1 的上游引物 1 μ L，序列為 5，-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3，濃度為 10 μ mo 1 · Γ1 的下游引物 1 μ L，、50 IOOng 的 DNA 2 μ L,濃度 5U · μ Γ1 的 iTaq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，PCR反應總體積25 μ L ；步驟(S； ) AS-PCR反應程序預變性94°C 3min ；94°C變性lmin，退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環；最后 72°C延伸 IOmin ；步驟(S4)將PCR產物進行凝膠電泳及成像鑒定。
全文摘要
本發明一種櫻桃S基因型的快速鑒定方法，包括步驟1櫻桃基因組DNA提取。步驟2制備AS-PCR體系及反應，其中，櫻桃S基因的特異性引物對為上游引物5’-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3’，下游引物5’-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3’。步驟3將PCR產物進行凝膠電泳及成像鑒定。本發明旨在提供一種操作簡便、速度快、成本低、鑒定范圍較廣的櫻桃S基因型快速鑒定方法，以便為櫻桃栽培時合理地配置授粉樹，為櫻桃自交親和育種，為櫻桃自交親和新品種育種提供理想的種質資源，為鑒定更多的S基因包括S4’基因等提供一種十分有效的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102373272SQ20101026396
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者侯義龍 申請人:大連大學