專利名稱：:評價用靶向ret受體酪氨酸激酶的藥物治療的患者的方法評價用靶向RET受體酪氨酸激酶的藥物治療的患者的方法本發明涉及選擇患者的方法，所述患者是采用RET藥物治療的l，者，由此預澳樹RET藥物反應的增加的可能性。本發明提供了一種測定RET序列的方法。該方法提供了最優化用于測定RET序列的ARMS引物。本發明還提供了包含ARMS引物的診斷試劑盒。蛋白在酪氨酸殘基上的磷酸化是細胞內信號轉導的關鍵因素。能催化這種反應的酶稱作酪氨酸激酶。許多跨膜受體含有具有酪氨酸激酶活性的結構域，并被歸類為受體酪氨酸激H(RTK)。RTK轉導多種多樣過程的胞外信號，所述過程如細胞生長、分化、存活和程序性細胞死亡。響應胞外配體的結合，RTK通常二聚化，從而導致自身磷酸化以及M識別RTK的磷酸化形式并與之相互作用的效應物的胞內信號轉導。RTK家族有幾個成員，其中之一為RET原癌基因，其編碼120kDa的蛋白RET(在轉染過程中重排)。RET是膠質細胞衍生的神經營養因子(GDNF)家族的生長因子受體。巳鑒定了2個RET的配體GDNF和neutunn(NTN)。當RET的配體結合共同受體且該復合物與RET相互作用時，RET被活化(Eng，1999JournalClinicalOncology.17(1)380-393)。活化使得RET在酪氨^^基上磷酸化，從而導致細胞生長和分化的信號通過RAS-RAF和PI3激酶途徑和其他可能的途^ii行轉導。已知活化RET的點突變弓胞3種相關的顯性遺傳的癌癥綜合征多發性內分泌腺瘤2A型和2B型(MEN2A和MEN2B)以及家族性甲狀腺髓樣癌(FMTC)(Santoro等.2004Endocrinology:145,5448-5451)。在幾乎所有的MEN2A病例和一些FTMC病例中，在胞外的近膜半胱氨酸富集結構域具有半胱氨酸的置換，而95%的MEN2B病例是在激酶結構域的密碼子918的單個點突變(M918T)造成的。密碼子918被認為位于催化核心的底物識別口袋中。該位點的突變被認為改變了RET催化結構域活化環的結構，進而組成型激活RET。M918T突變同樣發現于偶發性髓樣癌中，其中它與侵襲性疾病表型相關。體外研究已表明，所述突變影響底物特異性，從而RETtti^通過非受體酪氮酸激酶諸如c-src和c-abl識別和磷酸化底物(Eng等1996JAMA:276,1575-1579;Ponder等1999CancerResearch:59,1736-1741;Schilling等.2001InternationalJournalofCancer:95,62-66;Santoro等.1995Science:267,381-383;Zhou等1995Nature:273,536-539)。因為RET基因中的突變在大多數MEN2家族中已得到鑒定，所以分子診斷觀賦是可能的，且可用于證實臨床診斷。RET突變的觀!l試可采用基于聚合髒連反應的規程進行，其中擴增靶外顯子序列用于直接測序或限制性內切核酸酶消化(Zhong等.2006ClinicaChimicaActa:364,205-208)。RTK家族的另一個成員是血管內皮生長因子受體2(VEGFR2(含激酶插入結構域受體，KDR(也稱FIk-l)))。VEGFR2是血管內皮生長因子(VEGF)的受體。VEGF被認為是正常和疾病相關的血管發生(Jakeman,等1993Endocrinology:133,848-859;Kolch,等.1995BreastCancerResearchandTreatment:36,139-155)和血管鵬性(Connolly,等1989J.Biol.Chem:264,20017-20024)的重要刺激物。通過用抗體螯合VEGF拮抗VEGF作用可導致抑制腫瘤生長(Kim,等.1993Nature:362,841-844)。VEGF基因的雜合破壞導致血管形成的致命缺陷(Carmeliet,等1996Nature380:435439;Fe訂叫等.1996Nature380:439442)。VEGF與VEGFR2的結合導致了受體的二聚化作用，弓胞VEGFR2特定胞內酪氨酸殘基的自身磷酸化。自身磷酸化增加了所述酪氨酸激酶的催化活性，并為胞質信號轉導分子例如磷脂酶Oy提供了可能的對接位點。這些蛋白相互作用介導了對誘導針對VEGFR2的細胞應答必需的胞內信號傳導，例如內皮細胞增殖、存活和遷移(Ryan等2005BritishJournalCancer:92(增刊1)S6-S13)。病理血管發生中VEGF介導的VEGFR2信號傳導的關鍵作用的認識已導致了各種抑制VEGFR2活化的選擇性方法的開發。這些包括小^fATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑，其在防止ATP結合中阻止自身磷酸化，進而阻止細胞內信號轉導(Ryan,2005)。喹唑啉衍生物是VEGF受體酪氨酸激酶的抑制劑，其描述于國際專利申請公開號WO98/13354和WO01/32651中。在WO98/13354和WO01/32651中描述了具有對抗VEGF受體酪氨酸激酶活性的化合物，其同時具有一些對抗表皮生長因子受^(EGHl)酪氨酸激酶的活性。已公開了化合物4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(l-甲基哌啶-4-基甲氧蜀喹唑啉是VEGFR2酪氨酸激酶抑制劑(Wedge等.2002CancerResearch:62,546454655)。該化合物也稱作ZactimaTM(注冊商標)，商品名為凡德他尼(vandetanib)，編號為ZD6474。該化合物在下文中稱為凡德他尼。凡德他尼是作為ATP與VEGFR2酪氨酸激酶結合的有效且可逆抑制劑被開發的。此外，凡德他尼同樣抑制EGFR酪氨酸激酶活性。EGFR信號傳導途徑對于癌癥進展也是關鍵的，其中異常的EGFR活性增加了腫瘤細胞的增殖、存活和侵襲力以及VEGF的超表達。已顯示EGER信號傳導的抑制誘導腫瘤內皮細胞的選擇性凋亡。2002年，有報道稱凡德他尼已顯示有效抑審'廊體^#、的RET酪氨酸激酶活性，從而抑制RET的信號傳導和轉化能力。而且，凡德他尼體外顯示對RET依賴的甲狀腺腫瘤細胞生長具有強生長抑制作用(Carbmagno等.2002CancerResearch.62,7284-7290)。凡德他尼抑制RET的多數突變、活化形式以及野生型受體。因此除抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶外，認為通過凡德他尼對RET酪氨酸激酶的抑制可能在治療具有導致RET依賴的腫瘤細胞生長的RET基因突變的腫瘤中貢獻額外的抗腫瘤作用(Ryan,2005)。本發明允許選擇患者以預測對RET藥物反應的增加的可能性，所述患者是用RET藥物治療的候選者。由于已知組成型'i^活RET的突變導致幾種RET信號傳導依賴的癌癥綜合征，所以在患者中測定這些突變可用于評價患者對于采用RET藥物治療的適合性。根據本發明的一個方面，提供了一種預測作為用RET藥物治療的候選者的患割每對所述治療反應的可能性的方法，包括測定來自于該患者的樣品中RET的序列在下述如SEQIDNO:l中定義的位置105位不為胸腺嘧啶。在一個實施方案中，所述方纟跑括測定來自于患者的的樣品中RET的序列在如SEQIDNO:l中所定義的105位是否不為胸腺嘧啶，由此預測對RET藥物反應增加的可能性。在一個實施方案中，所述方法包括測定來自于患者的的樣品中RET的序列在下述如SEQIDNO:l中定義的位置105位為胞嘧啶。在一個實施方案中，所述方、跑括測定來自于患者的的樣品中RET的序列在如SEQIDN0:1中所定義的105位是否為胞嘧啶，由此預測對RET藥物反應增加的可能性。根據本發明的另一個方面，提供了預測作為用RET藥物治療的fl魏者的患者將對所述治療反應的可能性的方法，包括測定來自于該患者的樣品中RET的序列在下述如SEQIDNO:2中定義的位置918位不為甲硫氨酸。在一個實施6方案中，所述方纟跑括測定來自于患者的樣品中RET的序列在如SEQIDNO:2中所定義的918位是否不為甲硫氨酸，由此預測對RET藥物反應增加的可能性。在一個實施方案中，所述方法包括測定來自于患者的樣品中RET的序歹贓下述如SEQIDNO:2中定義的位置918位為蘇氨酸。在一個實施方案中，所述方法包括測定來自于患者的的樣品中RET的序列在如SEQIDNO:2中所定義的918位是否為蘇氨酸，由此預測對RET藥物反應增加的可能性。在一個實施方案中，提供了一種預測作為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性的方法，包括測定來自于患者的樣品中RET的序列在下述如SEQIDNO:l中定義的位置105位是否為胞嘧啶，^*自于該患者的樣品中RET的序列在下述如SEQIDNO:2中定義的位置918位是否為蘇氨酸，由此預測對RET藥物反應增加的可能性。在一個實施方案中，本發明特別適用于在患有斜蟲或部分依賴于RET的腫瘤的患者中預測作為用RET藥物治療的候選者的患者對RET藥物的反應。在一個實施方案中，本發明特別適用于在患有斜蟲或部分依賴于突變RET的腫瘤的患者中預測對RET藥物的反應。此種腫瘤包括例如甲狀腺癌。在另一個實施方案中，本發明尤其適用于在患有腫瘤的患者中預觀樹RET藥物的反應，所述腫瘤選自甲狀腺髓樣癌、腎上腺腫瘤(諸如嗜鉻細胞瘤)、肺癌(尤其是小細胞肺癌)、乳頭狀甲狀腺癌、間皮瘤和結腸直腸癌。在另一個實施方案中，本發明尤其適用于在患有腫瘤的患者中預測對RET藥物的反應，所述腫瘤選自甲狀腺髓樣癌、腎上腺腫瘤(例如嗜鉻細胞瘤)和肺癌(尤其是小細鵬市癌)。在另一個實施方案中，本發明特別適用于在患有制蟲或部分依賴于RET的腫瘤患者中預觀怖為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性。在一個實施方案中，本發明特別適用于在患有單獨或部分繊于突變RET的腫瘤的患者中預測作為用RET藥物治療的，魏者的患者將對所述治療反應的可能性。此種腫瘤包括，例如甲狀腺癌。在另一個實施方案中，本發明特別適用于在患有腫瘤的患者中預測作為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性，所述腫瘤選自甲狀腺髓樣癌、腎上腺腫瘤(諸如嗜鉻細胞瘤)、肺癌(尤其是小細鵬市癌)、乳頭狀甲狀腺癌、間皮瘤和結腸直腸癌。在另一個實施方案中，本發明特別適用于在患有腫瘤的患者中預領舴為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性，所述腫瘤選自甲狀腺髓樣癌、7腎上腺腫瘤(例如嗜鉻細胞瘤)和肺癌(尤其是小細鵬市癌)。在本發明的一個實施方案中提供了一種上文中所述的方法，其中檢測RET中核酸突變并由此測定RET序列的方法選自測序、WAVE分析、擴增受阻突變系統(ARMS)和限制性片段長度多態性(RFLP)。ARMS描述于歐洲專利公開號0332435，該內容引入本文作為參考，其公開并要求保護一種選擇性擴增差異低達1個m的模版序列的方法，該方法現通常稱為ARMS。RFLP見Zhong所述(Zhong等2006ClinicaChimicaActa:364,205-208)。在本發明的一個實施方案中，提供了一種上述的方法，其中測定來自于患者的樣品中RET序列的方法選自擴增受阻突變系統、限制性片段長度多態性或WAVE分析中的任何一種。本發明的一個實施方案中，提供了一種上述的方法，其中測定來自于患者的樣品中RET序列的方法為擴增受阻突變系統。在一個實施方案中，ARMS可包括使用瓊脂糖凝膠、測序凝膠或實時PCR。在一個實施方案中，ARMS包括使用實時PCR。ARMS測定可以與檢測反應物中DNA存在第二PCR反應復合(multiplex)，由此表明成功的PCR。TaqManTM技術可采用由不同熒光標記進行標記的TaqManTM探針檢測兩個反應的PCR產物。采用ARMS而非測序或RFLP來檢測突變的優勢在于ARMS是較快的單步驟分析，其需要更少的處理和數據分析，并且ARMS可在野生型多核苷酸背景下檢測樣品中的突變。在一個實施方案中，本發明提供了一種在來自患者的樣品中測定RET序列的方法，包括使用能在如SEQIDNO:1所示的105位識別RET序列的ARMS突變正向引物。在本發明的一個實施方案中，提供了一種在來自患者的樣品中測定RET序列的方法，包括使用最優化以擴增包括如SEQIDNO:l所示的105位在內的RET序列區域的ARMS突變正向弓卿和ARMS反向弓l物用。本領域技術人員應當理解'最優化以擴增"包括確定正向引物和反向弓l物最合適的長度和位置。在一個實施方案中，最優化所述ARMS突變正向引物和ARMS反向弓l物以擴增少于500個堿基的區域。在一個實施方案中，最優化所述ARMS突變正向引物和ARMS反向引物以擴增少于250個堿基的區域。在一個實施方案中，最優化所述ARMS突變正向引物和ARMS反向引物以擴增少于200個堿基的區域。在一個實施方案中，最優化所述ARMS突變正向弓l物和ARMS反向弓嫩以擴增多于100個iS的區域。在一個實施方案中，所述ARMS突變正向引物能在如SEQIDNO:1中所定義的位置105上識別RET序歹U。在一個實施方案中，所述ARMS突變正向引物包括與SEQIDNO:3中公幵序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一個實施方案中，所述ARMS突變正向弓卿包含SEQIDNO:3。在另一個實施方案中，所述ARMS突變正向引物由SEQEDNO:3組成。在一個實施方案中，所述ARMS反向引物包括與SEQIDNO:4中公開序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序歹)J。在一個實施方案中，所述ARMS反向引物包含SEQDDNO:4。在一個實施方案中，所述ARMS反向引物由SEQIDNO:4組成。鎖定核酸(LNA)寡核苷酸含有連接核糖的2'氧禾卩4'碳的亞甲橋。該橋導致鎖定的3'內向構象，降低了核糖的構象柔性，瓶高了磷te鏈的局部組織。Braasch和Corey綜述了LNA/DNA雜禾中的性質(Braasch和Corey,2001,Chemistry&Biology8,1-7)。幾項研究己表明,包含LNA的弓l物具有改善的對互補DNA序列的親和力。與相同長度和序列的DNA:DNA復合物相比，摻入單個LNADtt可允許解鏈溫度(Tm)上升最高4rC，且其同樣使Tm值升高多達9.6匸。Braasch禾BCorey提出包括LNA堿基對于短于10個堿基的寡核苷酸將具有最大作用。LNA在設計PCR弓卿中的用途的暗示己被綜述CLatoira,Arar和Hurley,2003,MolecularandCellularProbes17,253-259)。注意到明確的引物設計規則并沒有確立，但PCR引物中LNA置換的最優化是復雜的，且取決于數目、位置和序列背景。Ugozolli^(Ugozolli,Lato呵PucketArar和Hamby,2004,AnalyticalBiochemistry324,143-152)描述了LNA探針在應用5'核酸酶測定的實時PCR中檢測SNP的用途。Latorra,ato叫Campbell,Wolter和Hurley,2003，HumanMutation22，79-85)合成了一系列在3'末端和3'末端鄰近位置含有LNA堿基的引物，其用作等位基因特異性引物。盡管相對于DNA引物來自錯配的LNA序列的弓l發已得到降低，但個別反應的最優化仍是需要的。在一個實施方案中，所述ARMS突變正向引物包含其中一個或多個標準的DNA堿基已被LNA堿基置換的序列。在一個實施方案中，所述ARMS突變正向引物包含與SEQIDNO:9中公開序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一個實施方案中，所述ARMS突9變正向弓嫩包含SEQIDNO:9。在另一個實施方案中，所述ARMS突變正向引物由SEQIDNO:9組成。在一個實施方案中提供了一種能在ARMS測定中與使用上述ARMS突變正向引物和ARMS反向引物所得擴增產物結合的ARMS探針。在一個實施方案中，所述ARMS探針包含與SEQIDNO:5中公開序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一個實施方案中，所述ARMS探針包含SEQIDNO:5。在另一個實施方案中，所述ARMS探針由SEQEDNO:5組成。在一個實施方案中，所述ARMS探針包含其中一個或多個標準DNA堿基已被LNAltt置換的序列。在一個實施方案中，所述ARMS探針包含與SEQIDNO:10中公開序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序歹1」。在另一個實施方案中，所述ARMS探針包含SEQIDNO:10。在另一個實施方案中，所述ARMS探針由SEQIDNO:10組成。在--個實施方案中，所述ARMS探針在5'末端包含YakimaYellowTM熒光標記。在一個實施方案中，所述ARMS探針在3'末端包含BHQtm猝滅劑。本領域技術人員可認識到，探針與擴增產物(且因此探針的序列與其互補)結合的位置僅被確定擴增產物的正向和反向弓l物所安放的邊界限定。采用對照探針以證實ARMS測定照預想進行，以及證實在ARMS測定中使用的樣品中存在DNA。本領域技術人員可了解，對照探針可耙向任何選擇的基因。在一個實施方案中，對照正向引物包含與SEQIDNO:6中公開序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97°/。、98%或99%同一性的序列。在另一個實施方案中，所述對照正向引物弓l物包含SEQIDNO:6。在另一個實施方案中，所述對照正向弓胸引物由SEQIDNO:6組成。在一個實施方案中，對照反向引物包含與SEQIDNO:7中公開的序列具有至少75y。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一個實施方案中，所述對照反向引物引物包含SEQIDNO:7。在另一個實施方案中，所，照反向引物引物由SEQIDNO:7組成。在一個實施方案中，對照探針包含與SEQIDNO:8中公開的序列具有至少75。/。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序歹1」。在另一個實施方案中，所述對照探針包含SEQIDNO:8。在另--個實施方案中，所述對照探針由SEQDDNO:8組成。在一個實施方案中，所述對照探針包含其中一個或多個標準DNA堿基已被LNA自置換的序列。在一個實施方案中，所述對照探針包含與SEQIDNO:11中公開序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一個實施方案中，所述對照探針包含SEQEDNO.'ll。在另一個實施方案中，所艦照探針由SEQIDNO:ll組成。在一個實施方案中，所艦照探針在5'末端包含Cy-5熒光標記。在一個實施方案中，所述對照探針在3'末端包含ElleQuencher猝滅劑。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1ARMS測定引物和探針對照基因為a1抗胰蛋白酶，YakimaYellow和Cy-5是熒光標記，且BHQ(BlackHoleQuencher"禾口ElleQuencher是猝滅劑。粗體下劃線的堿基表示錯配位置。LNA位置用'+表示，例如+C、+A、+T和+G。在本發明的另一方面，提供了前文中所述的方法，其中該用于測定RET序列的方法包括測定從檔案腫瘤切片或其他臨床材料中提取的RETmRNA逆轉錄生成的cDNA的序列。來自福爾馬林固定的組織的RNA的提取已描述于Bock等,2001AnalyticalBiochemistiy:295116-117，從非固定組織中提取RNA的禾聘；以及通，轉錄生成cDNA、PCR擴增和測序的規程描述于SambroobJ.和Russell,D.W.,針克隆實驗手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第三版，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，紐約，2001。在本發明的另一個方面中，提供了一種前述的方法，其中所述測定RET序列的方法包括擴增RET基因的個別外顯子，個另拼顯子的雙鏈體退火，并隨后用CelI消化(見Crepin等，2006Endocrinology:36，369-376;和Marsh等,2001Neoplasia:3,236-244所述)。在另一方面，本發明提供了一種突變人RET多核苷酸，其在如SEQEDNO:1中所定義下述位置含有以下核酸堿基105位的胞嘧啶；或其包含至少20個核酸堿基的片段，前體是該片段包含位置105。在另一個方面，本發明提供了一種突變人RET多肽，絲如SEQIDNO:2中所定義的下述位置含有以下氨基酸殘基918位的蘇氨酸；或其包含至少10個氨基酸殘基的片段，前體是該片段包含位置918。在另一方面，提供了在由突變RET基因編碼的mRNA中測定RET序列的方法。在本發明的另一方面，提供了本文中所述的方法，其中該用于測定RET序列的方法選自，例如可采用來自單個患者的載玻片的基于免疫組織化學的測定，或組織微陣列(Mayr等,2006AmericanJournalofClinicalPathology:126,101-109;Zheng等，2006AnticancerResearch:26,2353-2360)或備選的蛋白質組方法學的12應用，其可包括裂解細胞、消化蛋白、于凝膠上分離蛋白片段、獲得含突變氨基酸的肽并Mil質譜分析法分析i刻太。在另一方面，本發明提供了對，突變人RET多肽特異性的抗體。本發明的另一方面提供了一種診斷試劑盒，包含能檢測如SEQIDNO:l中所定義的105位的RET中突變的ARMS突變正向引物，以及任選ARMS反向引物，和任選的使用說明書。在本發明的一個實施方案中，提供了診斷試劑盒，其包含ARMS突變正向引物，所述ARMS突變正向引物包含一個或多個LNA堿基并能識別如SEQIDNO:1中所定義的105位的RET序列，以及任選ARMS反向引物，和任選的使用說明書。在一個實施方案中，所述診斷試劑盒可用于預測作為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性的方法中。在備選的實施方案中，所述診斷試劑盒可用于選擇作為用RET藥物治療的候選者的患者進行所述治療。在備選的實施方案中，所述診斷試劑盒可用于評價患者對所述治療的適合性，所述患者是用RET藥物治療的候選者。本發明的另一方面提供了一種診斷試劑盒，包含對上述定義的突變人RET多肽特異性的抗體，以及任選的使用說明書。在一個實施方案中，所述診斷試劑盒可用于預測作為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性的方法中。在備選的實施方案中，所述診斷試劑盒可用于選擇作為用RET藥物治療的候選者的患者進行所述治療。在備選的實施方案中，所述診斷試劑盒可用于評價患者對所述治療的適合性，所述患者是用RET藥物治療的f魏者。在本發明的另一方面，前述的ARMS弓卿和探針可用于在一組表達野生型或突變RET的細胞系中測定RET的序列。關于細胞系是否表達野生型或突變RET的知識可用于篩選程序中，以鑒定具有對突變RET表型的特異性的新RET抑制劑或具有針對與野生型受體相關的表型的活性的新抑制劑。表達突變RET的細胞系組的可用性將有助于限定通過RET活化的信號傳導途徑，且可能導致其他治療介入耙的鑒定。在另一方面，本發明提供了一種制備患者個人化(personalized)基因組概況的方法，包括在下述如SEQIDNO:l中定義的位置105位和/或下述如SEQIDNO:2中定義的位置918位測定來自該患者的樣品中RET的序列，并生成捐誠從所述分析中獲得的數據的報告。在具體的實施方案中，J:述方法可用于評價RET藥物的藥物遺傳學。藥物遺傳學是對導艦藥物不同反應的遺傳變異的研究。通過測定來自患者的樣品中的RET序列并分析該患者對RET藥物的反應，該RET藥物的藥物遺傳學可得以闡明。在一個實施方案中，所述預測作為用RET藥物治療的候選者的患者將對所述治療反應的可能性的方法可用于選擇用RET藥物治療的腫瘤患者或患者人群。在一個實施方案中，所述預測作為用RET藥物治療的候選者的患割各對所述治療反應的可能性的方法可用于預測用RET藥物治療的腫瘤患者或患者人群的反應性。來自患者的樣品可以是任何腫瘤組織或任何含有源于腫瘤的材料的生物樣品，例如含有循環腫瘤細胞或DNA的血液樣品。在一個實施方案中，所ML液樣品可以是全血、血漿、血清或血小板。在一個實施方案中，腫瘤樣品是腫瘤組織樣品。所述腫瘤組織樣品可以是固定或未固定的樣品。在另一個實施方案中，可應用最低侵入性技術獲得腫瘤或疑似腫瘤小樣品而獲得生物樣品，從其測定RET序列。在另一個實施方案中，所述生物樣品包括單樣品，其可被用于測試任何J^的突變，或多樣品，其可被用于檢測任何Jl^的突變。根據本發明的另一方面，提供了應用i^方法的結果確定RET藥物適當劑量的方法。例如預測患者具有對RET藥物的反應增加的可能性的知識可用于確定所述RET藥物的適當劑量。計算治療性藥物的劑量是一項復雜的工作，需要考慮藥物、藥物代謝動力學和藥物遺傳學。給定患者的治療藥物劑量將由其主治醫師確定，其中考慮各種已知改變藥物作用的因素，包括疾病嚴重性和，、體重、性別、飲食、施用時間和途徑、其他藥療法和其他相關臨床因素。治療有效劑量可Mil體外或體內方法確定。RET藥物是RET抑制劑。RET抑制劑是抑制RET活性的試劑。所述試劑可以是抗體或小M。在一個實施方案中，RET抑制劑是RET酪氨^^敫酶抑制劑。RET抑制劑可具有針對其他蛋白的活性，諸如抑制其他酪氨酸激酶例如VEGFR2和/或EGFR的活性。在一個實施方案中，RET抑制劑同樣抑制EGFR酪氮酸激酶活性。在一個實施方案中，RET抑制劑同樣抑制VEGFR2酪氨酸激酶活性。在一個實施方案中，RET抑制劑同樣抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶活性。RET、EGFR或VEGFR2酪氨酸激酶抑制劑包括凡德他尼、塞地蘭尼(cediranib)(AZD2171,Recentin,(Wedge等，2005CancerResearch:65,43894400))、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)(SU11248,Sutent,Pfizer)、SU14813(Pfizer)、瓦他拉尼(vatalanib)(Novartis)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，Nexavar,Bayer)、XL-647(Exelixis)、XL~999(Exelixis)、AG-013736(Pfizer)、莫替沙尼(motesanib)(AMG706，Amgen)、BIBF1120(Boehringer)、TSU68(Taiho)、GW786034、AEE788(Novartis)、CP-547632(Pfizer)、KRN951(Kirin)、CHTR258(Chiron)、CEP-7055(Cephalon)、OSI-930(OSIPh羅aceuticals)、ABT-869(Abbott)、E7080(Eisai)、ZK-304709(Schenng)、BAY57-9352(Bayer)、L-21649(Merck)、BMS582664(BMS)、XL-880(Exelixis)、XL-184(Exelixis)或XL-820(Exelixis)。在一個實施方案中，RET抑制劑選自凡德他尼、塞地蘭尼、舒尼替尼、莫替沙尼或抗體。在一個實施方案中，RET抑制劑為凡德他尼。在一個實施方案中，RET抑制劑為塞地蘭尼。在一個實施方案中，RET抑制劑為莫替沙尼。在一個實施方案中，RET抑制劑為舒尼替尼。在一個實施方案中，RET抑制劑為抗體。RET藥物的有效量將例如取決于治療目的、施用途徑以及患者的狀況。因此，醫生,滴定劑量并且如所要需要的那樣修^M用途徑以獲得最佳治療效果。通常的每日或斷續劑量，例如每周、每兩周或每月齊糧范圍為約0.5mg至最高300mg、500mg、1000mg或1200mg或更高，這依賴于上述提到的因素。我們預期RET藥物可用作單一療法或與其他藥物聯合。本發明還可用于輔助治療或用作第一線(first-line)治療。在一個實施方案中，本發明的方法還包括根據上述方法向選擇或預測對用RET藥物治療反應的患者施用RET藥物。在本發明的一個實施方案中，提供了RET藥物在制備治療患者或患者群的藥物中的用途，所述患者或患者群根據上述方法選擇或預測對用RET藥物治療反應。在本發明的一個實施方案中，提供了一種治療患者或患者群的方法，所述患者或患者群根據前述方法選擇或預測具有對RET藥物反應的增加的可能性，該方法包括向所述患者施用RET藥物。15在本發明的一個實施方案中，提供了治療作為采用RET藥物治療的候選者的患者的方法，包括(i)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定義的下列位置105位是否不為胸腺嘧啶；或(ii)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定義的下列位置918位是否不為甲硫氨酸；以及施用有效量的RET藥物。在本發明的一個實施方案中，提供了治療作為采用RET藥物治療的候選者的患者的方法，包括①確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:l中定義的位置105是否不為胸腺嘧啶；或(ii)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定義的位置918是否不為甲硫氮酸；以及施用有效量的RET藥物。在本發明的一個實施方案中，提供了一種治療作為采用RET藥物治療的候選者的患者的方法，包括確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定義的下列位置105位是否為胞嘧啶；或(ii)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定義的下列位置918位是否為蘇氨酸；以及施用有效量的RET藥物。在本發明的一個實施方案中，提供了一種治療作為采用RET藥物治療的候選者的患者的方法，包括(i)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定義的位置105是否為胞嘧啶；或(ii)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定義的位置918是否為蘇氨酸；以及施用有效量的RET藥物。實施例本發明通過下述非限制性實施例得以闡明，其中圖l.顯示采用常規DNAAMRS弓I物檢測M918TRET突變。空心菱形表示來自IOOO個拷貝的突變DNA的信號，黑色正方形表示來自10000個拷貝的野生型DNA的信號，以及黑色菱形表示來自1000個拷貝的野生型DNA的信16號。圖2.顯示采用LNA修飾的ARMS弓卿檢測M918TRET突變。黑色三角形表示來自1000個拷貝的突變DNA的信號，黑色正方形表示來自1000個拷貝的野生型DNA的信號，且黑色圓圈表示來自10000個拷貝的野生型DNA的信號。常規分子生物學技術描述于"CuirentProtocolsinMolecularBiology"巻1-3，FMAsubel,RBrent和REKingston編輯；JohnWiley出版，1998以及SambrooKJ.和Russell,D.W.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，2001。微靜微麟辦縱俠鄉鑒定腫瘤切片在診斷或外科手術時取自患者。切片用福爾馬林固定，且用石蠟包埋。將制備的樣品切成切片，其厚度在5-20不等。含有腫瘤的切片區域通過主載玻片的組織病理學鑒定，并從相同腫瘤樣品中切下的相鄰載玻片的相關區域回收腫瘤材料，見Lynch等，2004NewEnglandJournalofMedicine:3502129-2139所述。其他類型的腫瘤樣品可包括例如新鮮或冷凍的組織或循環腫瘤細胞。采用這種樣品的技術細節可參見SambroolU.和Russell，D.W.,舒克隆實驗手冊，第三版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，2001。鄉脅賴載齢縱游腦微給定提取1個切片的體積。通過將來自切片的相關區域刮至eppendorf管中從而從相鄰的切片分離在一個切片上經組織病理學鑒定的腫瘤區域。將來自20微米切片的材料重懸浮于0.5Q/。吐溫-20(SigmaAldrich)中，加熱至9(TC10射中，隨后冷卻至55。C。向懸浮液中加入蛋白酶K(2Ml，10mg/ml)，混合溶液，且在55。C下溫育3小時，伴有偶爾混合。加入Chelex-100TM(C7901,Sigma)(100mJ,溶于TnsEDTA中的5o/。(w/v))，且懸浮液在99。C溫育10分鐘。通過在10500xg離心15射中回收提取的DNA，將所形成的蠟層下的溶液轉移至干凈的管中。加熱溶液至45。C，然后添加氯仿(100nl)。混合懸浮液后在10500xg再次離心15併中，然后ffiM乙醇沉淀從上層水性層回收DNA。用70X的乙醇沖洗DNA沉淀，通過離心脈沖回收，風干并用水(50ita)溶解。歹/激微/朋r麵e頻77r,f,殿鵬l緣可采用擴增受阻突變系統測定(ARMS)檢測與正常DNA背景相比較的RET基因中核苷酸堿基改變的存在。ARMS測定都是對給定突變特異性的，例如經設計以在給定的位置檢測一個堿基到另一個堿基的改變。該測定與檢測反應物中DNA的存在的第二PCR反應復合，由it據明成功的PCR。TaqMan技術采用由不同熒光標iaiS行標記的TaqManTM探針檢測兩個反應的PCR產物。在含有不同比例的突變和野生型DNA以及不同濃度的輸入DNA的基因組DNA上進行PCR。^PCR使用的總反應體積為25Ml。每個反應中采用1單位的Amplitaq金DNA聚合,80080246,ABI)，以及最終濃度為在緩沖液(最終緩沖組成15mMTns-HClPh8.3,50mMKC1)中的3.5mM的氯化鎂，200^MdNTP(脫氧核糖核苷酸三磷酸)和1.0mM的各ARMS突變正向引物和ARMS反向引物短(參見表l)。向各反應中加入終濃度0.5^M的TaqManTM探針(Eurogentech)。循環條件如下在實時PCR儀(例如StratageneMx4000或ABI7900)中95°C，10射中，隨后為40個如下循環94°C45秒，60°C45秒，72°C1力H中。在1000個拷貝的野生型DNA背景中可檢測到10個拷貝的突變體。實盧斷-鄉^MS翩鑿繊賴//線存，臟柳她頻》,殿超效凝福爾馬林固定的組織樣品來自參加臨床試驗以評價凡德他尼對偶發性甲狀腺髓樣癌的活性的患者。如實施例2中所述提取DNA。19例樣品可用于進行分析，包括來自單個患者的兩個樣品。所有的樣品一式三份進行分析，且由2名獨立的操作者評分。采用擴增受阻突變系統測定(ARMS)檢測與正常DNA背景相比較的RET基因中核苷酸堿基改變的存在。該測定與檢測反應物中DNA的存在的第二PCR反應復合，由此表明成功的PCR。TaqManTM技術采用由不同熒光標記進行標記的TaqManTM探針檢測兩個反應的PCR產物。在含有不同比例的突變和野生型DNA以及不同濃度的輸入DNA的基因組DNA上進行PCR。每個PCR使用的總反應體積為25nl。^反應中采用1單位的Amplitaq金DNA聚合酶，以及最終濃度為在緩沖液(最終緩沖組成15mMTris-HClPh8.3,50mMKC1)中的3.5mM的氯化鎂，200一dNTP禾口1.0mM的各ARMSLNA突變正向引物和ARMS反向引物短(參見表l)。向各反應中加入終濃度0.5^iM的TaqManTM探針。循環條件如下在實時PCR儀(例如StratageneMx4000或ABI7900)中95°C10分鐘，隨后為40個如下循環94°C45秒，在6(TC1分鐘，72。C45秒。有6個樣品由于低DNA濃度無法評分。可評價樣品的8/13中檢測到突變，從而給出突變頻率為61.5%。對所有的樣品進行測序，以確認突變狀態，但序列數據僅能從DNA濃度〉50個拷貝的樣品中獲得，且因此只有4個樣品給出了在密碼子918可讀的序列。測序獲得的結果與ARMS觀啶獲得的娜完f致。樣品標識符DNA拷貝突變狀態序列確認E2802001<5測定失敗E1701004<5測定失敗E170廳<5測定失敗E匪OOl<5測定失敗E0002001-a<5測定失敗E0002004<5測定失敗E280腿<5突變E0002005170突變是E2002002240突變是E2002001<5突變E1001002<5突變E1001004<5突變E0002001-b<5突變E0002002430突變E0011003410對生型是E1707002120野生型是E300100190野生型E1201證<5野生型E000200310野生型表2臨床樣品中的突變賴鄰!l兩個樣品(A-b)來自患者E000200119、微廳盯臟效^4^,/辨微扁微與扁進行試驗以確定經設計以檢測M918TRET突變的ARMS引物可從野生型DNA產生信號的閾。在代表不同濃度輸入DNA的5^1突變^If生型基因組DNA上迸行PCR，每個PCR使用的總反應體積為25|il。每個反應采用1單位的Amplitaq金DNA聚合酶，以及最終濃度為在緩沖液(最終緩沖組成15mMTris-HClPh8.3,50mMKC1)中的3.5mM的氯化鎂，200岸dNTP禾口1.0|tiM的各ARMS突變正向弓l物和ARMS反向弓卿短(參見表l)。向各反應中加入終濃度0.5^M的TaqManTM探針。循環條件如下在實時PCR儀(例如StratageneMx4000或ABI7900)中95。C10射中，隨后為45個如下循環94°C45秒，在6(TC45秒，72。Cl併中。采用常規DNAARMS引物在29個循環產生了來自于IOOO個拷貝的突變DNA的信號(圖l)。然而，在含有1000或10000個拷貝的野生型DNA樣品中同樣產生信號。盡管來自野生型DNA的信號通常分別在35和32個循環產生，但從野生型DNA獲得信號的可能性限制了常規DNAARMS引物在含有正常和腫瘤組織混合物對于固定的腫瘤樣品常見臨床環境中的使用。采用LNA修飾的弓I物進行了類似的試驗。在該試驗中，從含有1000個拷貝突變DNA的樣品在31個循環產生了信號，但是從含有1000或10000個拷貝的野生型DNA的樣品甚至在分析擴展至45個循環時也均無信號產生(圖2)。實施例6-用于治療的患者選擇腫瘤樣品中RET基因中突變的檢觀何用于改進對作為用凡德他尼或其他RET酪氨酸激酶抑制劑治療(作為單一治療或聯合治療)的fl魏者的患者的選擇，從而預測對凡德他尼或其他RET酪氮酸激SW制劑反應的增加的可能性。權利要求1.一種預測作為用RET藥物治療候選者的患者將對所述治療反應的可能性的方法，包括確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO1中定義的105位是否不為胸腺嘧啶；或在如SEQIDNO2中定義的918位是否不為甲硫氨酸，由此預測對RET藥物的反應增加的可能性。2.權利要求l的方法，其中105位為胞嘧啶，或918位為蘇氨酸。3.權利要求1或2的方法，其中105位為胞嘧啶。4.權利要求1-3的方法在評價RET藥物的藥物遺傳學中的用途。5.治療作為采用RET藥物治療的fl魏者的患者的方法，包括(i)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定義的105位是否不為胸腺嘧啶；或(ii)確定來自患者的樣品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定義的918位是否不為甲硫氨酸，以及施用有效量的RET藥物。6.權利要求5的方法，其中105位為胞嘧啶，或918位為蘇氨酸，以及施用有效量的RET藥物。7.權利要求5或6的方法，其中105位為胞嘧啶。8.權禾頓求3或7的方法，其中測定來自患者的樣品中RET序列的方法選自擴增受阻突變系統、限制性片段長度多態性或WAVE分析的任一種。9.權禾腰求8的方法，其中測定來自患者的樣品中RET序列的方法為擴增受阻突變系統。10.權利要求3、7、8或9的方法，包括使用能在如SEQIDNO:l所定義的105位識別RET序列的ARMS突變正向弓卿。11.權利要求3、7、8、9或10的方法，包括^[頓最優化以擴增包含如SEQIDNO:1所定義的105位的RET序列區域的ARMS突變正向引物和ARMS反向引物。12.權利要求10或11的方法，其中所述ARMS突變正向弓卿包含SEQIDNO:9。13.前述任一權利要求的方法，其中所述RET藥物為RET酪氨酸激酶抑制劑。14.權利要求13的方法，其中所述RET藥物為凡德他尼。15.權禾腰求13的方法，其中所述RET藥物為塞地蘭尼。16.能在如SEQIDNO:1所定義的105位識別RET序列的ARMS突^IE向引物。17.權利要求16所述的ARMS突變正向引物，包含SEQIDNO:9。18.包含權利要求16或17的ARMS突變正向弓l物診斷試劑盒。專利摘要本發明提供了一種選擇患者的方法，所述患者是采用RET藥物治療的候選者，由此預測對RET藥物反應的增加的可能性。本發明提供了一種測定RET序列的方法。所述方法提供了最優化用于測定RET序列的ARMS引物。本發明同樣提供了包含ARMS引物的診斷試劑盒。文檔編號C12Q1/68GKCN101512017SQ200780033035公開日2009年8月19日申請日期2007年9月6日發明者A·J·瑞安,A·伍基,J·舍伍德申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan