專利名稱：一種用于檢測c-kit基因突變的探針、引物及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種C-KIT基因突變的檢測探針、引物及試劑盒。
背景技術：
C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4qll-12基因全長約80kb。C-KIT編碼的C-KIT蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，其分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內的酪氨酸激酶區，跨膜區和配體結合位點胞外區。當配體與其結合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通過一系列反應激活下游信號轉導通路，從而調節細胞的生長與增殖。格列衛(Gleevec)是針對C-KIT開發的一種革巴向藥物,通過結合Kit蛋白胞衆內酪氨酸激酶功能區的ATP位點，阻斷磷酸基團由ATP向底物酪氨酸殘基的轉移，從而抑制腫瘤細胞的增殖和分化。胃腸道間質瘤(GIST)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。絕大部分的GIST均存在CKIT基因突變，從而使Kit蛋白的活化不需要通過配體激活就能刺激腫瘤細胞的持續增殖和抗凋亡信號的失控。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突變率約為90%，C-KIT的突變位點主要位點位于17外顯子Asp816Val的突變，其中第9外顯子Ala502_Tyr503的突變約占5_10%。臨床研究表明GIST中C-KIT基因的突變情況與靶向藥物格列衛的療效密切相關:存在外顯子17的D816V的突變患者的療效較差，表明C-KIT的突變會導致腫瘤患者對D816V的靶向藥物治療產生耐藥性。因此，在實施化療之前，通過快速的方法對C-KIT基因突變的檢測可延長患者生存期，指導患者的合理用藥，避免過度化療，指導臨床科學用藥具有重要的參考價值。目前DNA直接測序法檢測為C-KIT基因突變的檢測主要方法。然而，直接測序的靈敏度低，檢測靈敏度只有20-30%，低靈敏度的檢測會導致漏檢及假陰性的發生。此外，直接測序法實驗操作復雜，檢測效率低、樣品易污染、檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求，臨床迫切需要開發一種高靈敏度，快速的C-KIT基因突變檢測技術，以實現采用高靈敏度檢測方法對C-KIT基因突變進行檢測，從而為臨床腫瘤的個體化治療方案提供科學參考。本發明開發一種快速，高靈敏、操作簡便的C-KIT基因突變檢測試劑盒及檢測方法。該檢測方法靈敏度高，檢測時間只需90分鐘即可完成，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優點。

發明內容
本發明目的在于提供一種用于C-KIT基因突變檢測的引物和探針，通過對其突變的檢測可以用于GI ST化療預后，其特異引物與探針包括如下序列:KF:CATCGCCATACTCATGCTCGSEQNOlKR:TAATTAGAATGACCTTGATGASEQN02
KP:FAM-CGGCTAGACGATATCACATATC-BHQI SEQN03本發明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變檢測試劑盒，其PCR反應擴增體系如下:I X PCR 緩沖液
模板DNAο μ
C-KIT 引物3 μΜ
C-KIT 探針3 μΜ
Taq _1.5 U
dNTP10.0 mM
MgCL225.0 mM
甲酰胺1%本發明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變方法，其方法包括以下步驟:(I)根據COSMIC數據公布的人類C-KIT為野生型基因序列，針對C-KIT的突變點，設計特異性引物和探針。(2)提取檢測樣本中基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、全血和血漿等組織中的DNA。(3)配制實時熒光PCR擴增反應體系。(4)根據熒光PCR擴增 儀顯示的Ct值判斷檢測結果:檢測反應體系的FAM熒光強度，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為O或31:陰性；Ct值小于31:陽性。本發明的有益效果是:本發明采用了特異性引物和探針技術，可以特異性檢測C-KIT基因突變。此方法:(I)建立了實時PCR體系實現對C-KIT基因D816V快速檢測；(2)靈敏度高，5-10拷貝的突變可以檢出；(3)特異性強，IOng的野生型基因組DNA不會產生非特異性信號；(4)檢測速度快，檢測過程只需要90分鐘即可完成。(5)穩定率高。對于PCR來說，通常腫瘤細胞C-KIT的突變的模板序列的絕對數并不高；而當拷貝數低于1000，引物和探針雜交效率陡然下降，穩定檢出并不容易。因此，需要引物有較高的單次雜交效率，以便能夠有效啟動延伸反應，在本發明的實施例中，多次檢測結果表明，設計的引物和探針和傳統測序的結果符合率為100%，可以穩定檢出。


圖1為實施例檢測陰性樣本PCR圖。圖2為實施例檢測突變陽性樣本PCR圖。
具體實施例方式本發明以野生型細胞系基因組為DNA模板，建立C-KIT實時熒光PCR檢測反應體系，針對突變位點設計特異引物和探針，檢測C-KIT基因突變的方法包括以下步驟:(I)針對突變位點設計合成特異性引物和探針根據COSMIC數據庫公布的C-KIT基因序列為野生型序列，針對C-KIT基因突變位點設計特異引物和探針。通過特異性引物和探針優化，實現高靈敏和快速檢測。設計的引物和探針序列如表I所示。(2)檢測樣本處理與DNA的提取檢測樣本包括新鮮病理組織，石蠟包埋組織、全血、血漿和胸腔積液。對于鮮病理組織和石蠟組織樣品，樣品切成5-10μπι，加入ImL 二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入ImL無水乙醇到沉淀中，室溫或37°C晾干，加入蛋白酶K和BufferATL，56°C消化裂解I小時，90°C孵化lh，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻，將上清小心轉移至Ij 01八21^離心柱中，6000父8 (8000rpm)離心 Imin,加入 500 μ LBuffer AU, 6000Xg(8000rpm)離心 lmin,小心打開蓋子加入 500 μ LBuffer AW2, 6000X g(8000rpm)離心 lmin,空管離心20000 Xg (14000rpm)離心3min,加入100 μ LBuffer ATE于膜中央,溫育5分鐘，20000 Xg (14000rpm)離心lmin。對于全血、血衆和胸腔積液,其體積不少于800 μ L,使用TIANGEN的DNA提取試劑盒提取基因組DNA。提取具體操作步驟按試劑盒操作說明進行操作。所提DNA溶于Tris-HCl中(lOmmol/L，PH8.0),經紫外分光光度計檢測提取質量，確定其濃度，然后用Tris-HCl溶液調整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進行PCR反應擴增。(2 )建立PCR擴增反應體系應用上述設計的探針和引物，取5μ L提取的DNA作為反應模板，采用如下PCR反應體系進行擴增，PCR擴增反應體系為:I X PCR 緩沖液
模板DNA5 ah
C-KIT 引物3 μΜ
C-KIT 探針3 μΜ
Taq 酶L 5 U
dNTP10.0 mM
MgCL225.0 mM
甲酰胺1%實時PCR反應條件是95°C預變性5分鐘，I個循環；95°C變性25秒，64°C退火20秒，72°C延伸20秒，15個循環；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個循環。后31個循環在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。(4)根據熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷檢測結果:檢測反應體系的FAM熒光強度，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為O或31:陰性；Ct值小于31:陽性。以下結合具體實施例，對本發明進一步闡述。應理解，這些實施例僅用于本發明而不用于限制本發明的范圍。除非另有定義或說明，本專利所述的科學術語與本領域普通技術人員所理解具有相同的含義。實施例1本實施例以基因工程構建的質粒為陽性質粒，利用本發明實時熒光PCR檢測C-KIT基因D842V突變的方法包括如下步驟:(I)檢測樣本DNA提取
將樣本加入ImL 二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入ImL無水乙醇到沉淀中，室溫或37°C晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56°C消化裂解I小時，90°C孵化lh，加入200mLBuffer AL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻，將上清小心轉移到QIA2mL離心柱中，6000Xg (8000rpm)離心 lmin,加入 500 μ LBufferAWl, 6000Xg (8000rpm)離心 lmin,小心打開蓋子加入 500 μ LBuffer AW2, 6000Xg (8000rpm)離心 lmin,空管離心 20000Xg(14000rpm)離心 3min,加入 100 μ LBuffer ATE 于膜中央，溫育 5 分鐘，20000 X g( 14000rpm)離心lmin。所提DNA溶于Tris-HCl中(lOmmol/L，PH8.0),經紫外分光光度計檢測提取質量，確定其濃度，然后用Tris-HCl溶液調整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進行PCR反應擴增。 (2)建立PCR反應體系應用上述設計的探針和特異引物，取5 μ L提取的DNA作為反應模板，采用如下PCR反應體系進行擴增，PCR擴增反應體系為:1 X PCR 緩沖液
權利要求
1.用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，其特征在于，包括以下序列:SEQIDNOl-SEQ ID N03。
2.用于檢測C-KIT基因突變的試劑盒，其特征在于，包括以下序列:SEQID NO 1-SEQID N03。
3.如權利要求2所述的檢測C-KIT基因突變的檢測試劑盒，其特征在于:包括如下熒光PCR的反應體系: I X PCR緩沖液模板DNA5 pL C-KIT 引物3 μΜ C-KIT 探針3 μΜTaq 藤L 5 U dNTP10.0 mM MgCL225.0 mM甲酰胺1%
4.如權利要求2所述的C-KIT基因突變檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟: (1)提供權利要求1所述的引物和探針序列； (2)待測樣品的處理和模板DNA的提取； (3)配制熒光PCR擴增反應體系； (4)用步驟(I)的引物和探針擴增待測基因突變靶序列； 檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值大于或等于31為陰性；Ct值小于31為陽性。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測C-KIT的引物、探針及試劑盒。本發明主要包括以下序列SEQ ID NO1-SEQ ID NO3。本發明采用特異引物和探針技術，建立了用于檢測C-KIT基因突變的實時熒光PCR體系。該方法(1)靈敏度高，可檢出5-10拷貝的突變DNA；(2)特異性強，10ng的野生型基因組DNA不會產生非特異性信號；(3)檢測速度快，檢測過程只需要90分鐘即可完成。
文檔編號G01N21/64GK103114133SQ20131002265
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者阮力, 林清華, 羅捷敏, 鄭立謀 申請人:廈門艾德生物醫藥科技有限公司