本發明(ming)屬于分(fen)子生物(wu)學，具體涉及一種hpv16、hpv18分(fen)型(xing)檢測試劑盒及其應用。

背景技術：

1、人乳(ru)頭(tou)瘤病(bing)毒(du)(du)(human?papillomavirus，hpv)屬于乳(ru)頭(tou)瘤病(bing)毒(du)(du)科，是一種小分(fen)子的(de)、無包(bao)被膜的(de)雙鏈環(huan)狀(zhuang)dna病(bing)毒(du)(du)，基因組長約8000堿基對(dui)(bp)，分(fen)為(wei)(wei)3個功能(neng)區(qu)，即(ji)早期(qi)(qi)轉錄(lu)區(qu)(e區(qu))、晚(wan)期(qi)(qi)轉錄(lu)區(qu)(l區(qu))和(he)(he)非轉錄(lu)區(qu)(長控制區(qu)，lcr)。hpv通過直接或(huo)(huo)間接接觸(chu)污染(ran)(ran)(ran)物品或(huo)(huo)性(xing)(xing)傳播感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)人類。該病(bing)毒(du)(du)不但具(ju)有(you)(you)(you)宿主特(te)異性(xing)(xing)，而且具(ju)有(you)(you)(you)組織特(te)異性(xing)(xing)，只能(neng)感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)人的(de)皮(pi)膚(fu)和(he)(he)黏膜上皮(pi)細(xi)胞，引起人類皮(pi)膚(fu)的(de)多種乳(ru)頭(tou)狀(zhuang)瘤或(huo)(huo)疣及生殖道上皮(pi)增(zeng)生性(xing)(xing)損(sun)傷。對(dui)于感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)生殖道和(he)(he)肛門的(de)hpv，根據各基因型別致病(bing)力大小或(huo)(huo)致癌(ai)危(wei)(wei)(wei)(wei)險(xian)(xian)性(xing)(xing)大小可分(fen)為(wei)(wei)低危(wei)(wei)(wei)(wei)型和(he)(he)高危(wei)(wei)(wei)(wei)型兩大類。研究發(fa)(fa)現，宮(gong)頸(jing)(jing)癌(ai)的(de)發(fa)(fa)病(bing)風(feng)險(xian)(xian)與人乳(ru)頭(tou)瘤病(bing)毒(du)(du)(hpv)感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)有(you)(you)(you)關，尤(you)其是高危(wei)(wei)(wei)(wei)型人乳(ru)頭(tou)瘤病(bing)毒(du)(du)(hr-hpv)持續感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)是高級別宮(gong)頸(jing)(jing)病(bing)變(bian)(hsil)及宮(gong)頸(jing)(jing)癌(ai)發(fa)(fa)生發(fa)(fa)展的(de)必(bi)要條件。hpv16、18發(fa)(fa)病(bing)率高，是醫學(xue)界(jie)極為(wei)(wei)重(zhong)視的(de)兩個型別。對(dui)hpv16、18檢測能(neng)在病(bing)毒(du)(du)感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)的(de)初期(qi)(qi)發(fa)(fa)現病(bing)毒(du)(du)，將(jiang)宮(gong)頸(jing)(jing)病(bing)變(bian)的(de)高危(wei)(wei)(wei)(wei)人群篩查出來，增(zeng)加hsil和(he)(he)早期(qi)(qi)宮(gong)頸(jing)(jing)癌(ai)的(de)檢出率。臨床上對(dui)hpv16、18感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)需(xu)高度重(zhong)視外，對(dui)具(ju)有(you)(you)(you)進展為(wei)(wei)hsil的(de)高風(feng)險(xian)(xian)hpv(16、18)識別，能(neng)進一步預測宮(gong)頸(jing)(jing)病(bing)變(bian)的(de)進展和(he)(he)預后，對(dui)指導制定個性(xing)(xing)化(hua)的(de)隨診和(he)(he)治(zhi)療(liao)方案有(you)(you)(you)重(zhong)大意義。

2、現(xian)(xian)有(you)技(ji)術(shu)(shu)中(zhong)針(zhen)對hpv的(de)(de)檢測(ce)主要使用(yong)熒光定(ding)量pcr技(ji)術(shu)(shu)和(he)pcr反向(xiang)點雜(za)交技(ji)術(shu)(shu)，以上方法均需(xu)(xu)要搭配(pei)昂貴的(de)(de)檢測(ce)儀器(qi)同時(shi)還需(xu)(xu)要在(zai)特(te)定(ding)的(de)(de)實(shi)驗環(huan)境(jing)以及專(zhuan)業的(de)(de)的(de)(de)技(ji)術(shu)(shu)人(ren)員(yuan)進(jin)行(xing)操作(zuo)，無法實(shi)現(xian)(xian)居家(jia)檢測(ce)，全過程的(de)(de)操作(zuo)步(bu)驟(zou)復雜(za)且(qie)耗(hao)時(shi)長，從核(he)酸提取(qu)到出檢測(ce)結(jie)果需(xu)(xu)要1.5-2h，不利于(yu)檢測(ce)的(de)(de)推廣(guang)和(he)便捷化。且(qie)檢測(ce)hpv主流(liu)(liu)的(de)(de)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)為液態(tai)pcr試(shi)劑(ji)(ji)(ji)，需(xu)(xu)在(zai)特(te)定(ding)的(de)(de)溫(wen)度條件(jian)下保(bao)存和(he)運(yun)輸(shu)，對冷(leng)鏈物流(liu)(liu)有(you)較(jiao)高的(de)(de)要求，一(yi)方面(mian)增(zeng)加了(le)(le)保(bao)管和(he)運(yun)輸(shu)的(de)(de)復雜(za)性(xing)，另一(yi)方面(mian)也增(zeng)加了(le)(le)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)的(de)(de)損耗(hao)風(feng)險；而且(qie)市面(mian)上現(xian)(xian)有(you)的(de)(de)hpv檢測(ce)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)均面(mian)向(xiang)實(shi)驗室，樣(yang)本裂解后需(xu)(xu)進(jin)行(xing)復雜(za)的(de)(de)核(he)酸純化過程，不能用(yong)于(yu)直接擴增(zeng)。這些問(wen)題使得pcr試(shi)劑(ji)(ji)(ji)在(zai)部分地區和(he)環(huan)境(jing)中(zhong)的(de)(de)應用(yong)受(shou)到了(le)(le)限制。現(xian)(xian)有(you)專(zhuan)利cn?116769975?b公開(kai)了(le)(le)《hpv檢測(ce)引物組、試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)及其應用(yong)》，但其單獨(du)使用(yong)膠體(ti)金法進(jin)行(xing)結(jie)果判讀，但對于(yu)高濃度樣(yang)本容(rong)易出現(xian)(xian)hook效應導致(zhi)假陰性(xing)的(de)(de)缺陷。

3、因此，建立一種操作簡便(bian)，準確性高，成(cheng)本低廉的(de)hpv16、18的(de)檢(jian)測(ce)方法十(shi)分必要。

技術實現思路

1、本發明(ming)第一方面的(de)目的(de)，在于提(ti)供一種用于檢測hpv16和/或hpv18的(de)引(yin)物組(zu)合(he)。

2、本發明第二方(fang)面的目的，在于提供(gong)一種(zhong)核酸釋放劑(ji)。

3、本發明(ming)第(di)三(san)方面的(de)目的(de)，在于提供一種用于檢測hpv16和/或hpv18的(de)試劑(ji)盒。

4、本發(fa)明第四方面的目的，在于提供(gong)上述(shu)引(yin)物組合、試劑盒的應用(yong)。

5、本發明第五方面的目的，在于提供上述(shu)試(shi)劑(ji)盒的使用方法。

6、本發(fa)明所(suo)采取的技術(shu)方(fang)案是：

7、本發明的(de)第一(yi)方面，提(ti)供一(yi)種用(yong)于(yu)檢(jian)測hpv16和/或(huo)hpv18的(de)引(yin)物組合(he)，包含用(yong)于(yu)擴增hpv16和/或(huo)hpv18的(de)引(yin)物；

8、所述用于(yu)擴(kuo)增(zeng)hpv16的引物序列為：

9、外引物h-16-f3：tgtaaccttttgttgcaagtgt；

10、外引物h-16-b3：agcatcccctgtttttttttcca；

11、內引(yin)物h-16-fip：cagatggggcacacaattccta-caaagcacacacgtagac?a；

12、內引物h-16-bip：accataatctaccatggctg-aaccatccattacatcccgtac?c；

13、環引物h-16-lb：caggtaccaatggggaagag；

14、所述用于擴增hpv18的引物序列為(wei)：

15、外引物h-18-f3：agcgactcagaggaagaaaac；

16、外(wai)引物h-18-b3：gccattgttgcttactgctg；

17、內引(yin)物h-18-fip：tctggcttcacacttacttcacata-gttaatcatcaacattt?accag；

18、內(nei)引物h-18-bip：gctagtagtagaaagctcagcag-accacggacacacaaa?gg；

19、環(huan)引物h-18-lf：ttgtgtgacgttgtggttcggc；

20、環引物h-18-lb：ttcgagcattccagcagctgtt。

21、本發明(ming)第二方面，提供一種(zhong)核(he)(he)酸(suan)釋放劑(ji)，所述(shu)核(he)(he)酸(suan)釋放劑(ji)包括緩(huan)沖液、強堿、螯(ao)合劑(ji)、鹽、硫酸(suan)銨、表面活性劑(ji)；其中(zhong)核(he)(he)酸(suan)釋放劑(ji)的ph為8～9。

22、優(you)選地，所述緩沖液包括tris-hcl、hepes緩沖液磷酸(suan)鹽(yan)緩沖液中的至少一種。

23、優選地，所(suo)述強堿包括氫氧化鈉(na)和(he)/或氫氧化鉀。

24、優選地，所述螯(ao)合劑包括edta2na；

25、優(you)選地，所述鹽包括氯化鉀(jia)和/或氯化鈉。

26、優選地，所述表面(mian)活(huo)性劑包括(kuo)曲(qu)(qu)拉通(tong)(tong)(如曲(qu)(qu)拉通(tong)(tong)x-100、曲(qu)(qu)拉通(tong)(tong)x-114、曲(qu)(qu)拉通(tong)(tong)x-102曲(qu)(qu)拉通(tong)(tong)x-405等)、土溫(wen)(如土溫(wen)80、吐(tu)(tu)(tu)溫(wen)60、吐(tu)(tu)(tu)溫(wen)40、吐(tu)(tu)(tu)溫(wen)20等)、np-40。

27、優(you)選地，所(suo)述緩沖液的(de)濃(nong)(nong)度為10-50mm、所(suo)述強堿的(de)濃(nong)(nong)度為10-50mm、螯合劑(ji)的(de)濃(nong)(nong)度為1-4mm、鹽(yan)的(de)濃(nong)(nong)度為10-30mm、硫酸銨(an)的(de)濃(nong)(nong)度為10-30mm、和/或，表面(mian)活性劑(ji)的(de)體積百分比為1％-4％。

28、優(you)選地(di)，所述(shu)核(he)酸(suan)釋放(fang)劑包含(han)：tris-hcl、氫氧化(hua)鈉、edta2na、氯化(hua)鉀、硫酸(suan)銨、曲拉通-100、吐溫20，其中核(he)酸(suan)釋放(fang)劑的ph為8～9。

29、優選地，所述(shu)tris-hcl的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)為(wei)10-50mm、所述(shu)氫(qing)氧化(hua)鈉的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)為(wei)10-50mm、edta2na的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)為(wei)1-4mm、氯化(hua)鉀的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)為(wei)10-30mm、硫酸銨的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)為(wei)10-30mm、曲(qu)拉通-100的(de)體積百分比(bi)為(wei)0.5％-2％、和/或，吐(tu)溫20的(de)體積百分比(bi)為(wei)0.5％-2％。

30、本(ben)發(fa)明的(de)第三方面(mian)，提供一(yi)種用于檢測hpv16和/或(huo)hpv18的(de)試劑(ji)(ji)盒，所述試劑(ji)(ji)盒包(bao)含擴增試劑(ji)(ji)和/或(huo)核酸(suan)釋(shi)放劑(ji)(ji)；所述擴增試劑(ji)(ji)包(bao)括本(ben)發(fa)明第一(yi)方面(mian)所述的(de)引(yin)物組(zu)合；和/或(huo)，所述核酸(suan)釋(shi)放劑(ji)(ji)為本(ben)發(fa)明第二(er)方面(mian)所述的(de)核酸(suan)釋(shi)放劑(ji)(ji)。

31、優選地，所述外引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-16-f3的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.2-0.3μm，外引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-16-b3的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.2-0.3μm，內(nei)引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-16-fip的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)1-2μm，內(nei)引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-16-bip的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)1-2μm，環(huan)引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-16-lb-的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.3-0.4μm，外引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-18-f3的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.2-0.3μm，外引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-18-b3的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.2-0.3μm，內(nei)引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-18-fip的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.6-0.8μm，內(nei)引物(wu)(wu)(wu)(wu)h-18-bip的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.6-0.8μm，環(huan)引物(wu)(wu)(wu)(wu)hpv18?lf、hpv18?lb的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)0.3-0.4μm。

32、優選地(di)，所(suo)述擴增(zeng)試劑還包括dntps、mgso4、bst酶(mei)、凍干保護(hu)劑、顯色染料中的一(yi)種或多種。

33、優(you)選地，所述顯(xian)色染料(liao)包括但不限于(yu)hnb、鈣黃(huang)綠素(su)、hnb、酚紅試劑(ji)中的任(ren)意一種。

34、優(you)選地(di)，所(suo)述凍干保護劑包括(kuo)海藻糖、甘露醇、聚(ju)乙二醇中(zhong)的(de)至少一種(zhong)。

35、優(you)選地(di)，所(suo)述(shu)(shu)dntps的濃度為(wei)(wei)1-2mm，所(suo)述(shu)(shu)mgso4的濃度為(wei)(wei)6-8mm，所(suo)述(shu)(shu)bst酶的濃度為(wei)(wei)5-8u/μl，所(suo)述(shu)(shu)顯(xian)色染料的濃度為(wei)(wei)10-20mm，所(suo)述(shu)(shu)凍干保(bao)護(hu)劑的濃度為(wei)(wei)10％-20％。

36、優選地(di)，所述試劑盒還包括膠體金免(mian)疫層析試紙條。

37、優選地，所述引(yin)物組合的(de)5’端標(biao)記有標(biao)記物。

38、優(you)選地(di)，所(suo)述(shu)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)組合按照如下(xia)方式標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)有標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)物(wu)(wu)(wu)：所(suo)述(shu)環引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)h-16-lb、h-18-lf的5’端(duan)標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)第一(yi)標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)物(wu)(wu)(wu)，所(suo)述(shu)內(nei)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)h-16-bip、環引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)h-18-lb的5’端(duan)標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)第二(er)標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)物(wu)(wu)(wu)；所(suo)述(shu)第一(yi)標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)物(wu)(wu)(wu)與第二(er)標(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)物(wu)(wu)(wu)不同。

39、優(you)選地，所述h-16-lb、h-18-lf的5’端(duan)的第(di)一標(biao)(biao)記物(wu)不(bu)同；所述內引物(wu)h-16-bip、環引物(wu)h-18-lb的5’端(duan)的第(di)二標(biao)(biao)記物(wu)不(bu)同。

40、優選地，所述(shu)標(biao)記物(wu)包括生(sheng)物(wu)素、地高辛、熒光基團(tuan)。

41、優(you)選地，所述熒光基團包括(kuo)fam、tamra、cy3、cy5、cy5.5、cy7、fitc、rhodamine?b、bhq。

42、優選地，所述環引物(wu)h-16-lb的(de)5’端標記(ji)的(de)第一標記(ji)物(wu)為fam。

43、優(you)選(xuan)地(di)，所述環引物h-18-lf的(de)5’端標記(ji)的(de)第一標記(ji)物為地(di)高辛。

44、優選地，所述內引物h-16-bip的(de)5’端(duan)標記(ji)的(de)第二標記(ji)物為生物素。

45、優選(xuan)地(di)，所述(shu)環(huan)引物h-18-lb的5’端標記(ji)第(di)二(er)標記(ji)物為(wei)tamra。

46、優選(xuan)地，所(suo)述(shu)擴(kuo)增試劑(ji)為凍干形(xing)態。

47、優選地，所述(shu)膠體金免(mian)疫(yi)層析試紙條包括底板、樣品墊(dian)、判讀區(qu)、金墊(dian)和(he)(he)吸水墊(dian)；所述(shu)樣品墊(dian)、判讀區(qu)、金墊(dian)和(he)(he)吸水墊(dian)設置(zhi)于(yu)底板上(shang)；所述(shu)判讀區(qu)上(shang)設置(zhi)檢測(ce)線(xian)t1和(he)(he)/或(huo)t2和(he)(he)質控線(xian)。

48、優選地，所述金墊中標記有能與第二標記物形成(cheng)特異(yi)性結合對(dui)的結合分子。

49、優(you)選(xuan)地，所述能與第二標記物(wu)形成特異性結(jie)(jie)合對的結(jie)(jie)合分子的濃度為15-25μg/ml。

50、優選地，所(suo)述(shu)結(jie)合分子(zi)包括(kuo)抗體。

51、優選地，所述能與第(di)二標記(ji)物形成特異性結(jie)合對(dui)的結(jie)合分子包括生物素抗體、tamra抗體。

52、優選地，所(suo)述(shu)生物素抗體的濃度(du)為15-25μg/ml、所(suo)述(shu)tamra抗體的濃度(du)為15-25μg/ml；

53、優選地，所述檢測線(xian)t1和/或(huo)t2中包被(bei)能與第一(yi)標(biao)記(ji)物(wu)形(xing)成特異性(xing)結合(he)對的結合(he)分子。

54、優選地，所述能(neng)與第一標記物形(xing)成特異性結合(he)(he)對的(de)結合(he)(he)分子(zi)的(de)濃度為(wei)1.0-1.5mg/ml。

55、優(you)選(xuan)地，所述檢測線t1、t2中所述的第一標記物不同(tong)。

56、優選(xuan)地，所(suo)述檢(jian)測線t1中包被有(you)digoxigenin抗體(ti)，digoxigenin抗體(ti)濃度為1.0-1.5mg/ml；

57、優(you)選地，所(suo)述檢測線t2中包(bao)被有fam抗體，fam抗體濃度為1.0-1.5mg/ml；

58、優選地(di)，所述質(zhi)控(kong)(kong)線中(zhong)包被有質(zhi)控(kong)(kong)抗體。

59、優選地，所述質控抗體的濃度為1.0-1.5mg/ml。

60、優選地，所述質控(kong)抗(kang)體包括羊抗(kang)鼠igg抗(kang)體。

61、優選地，所述試劑盒還(huan)包括樣本稀釋(shi)液。

62、優選地，所(suo)述樣本稀釋液包括(kuo)：10-30mm?ph7-9的tris-hcl、0.001％-0.003％的proclin300。

63、本發明(ming)第(di)四方面，提供本發明(ming)第(di)一方面所(suo)述(shu)的(de)引物組合或(huo)本發明(ming)第(di)二(er)方面所(suo)述(shu)的(de)核酸釋放(fang)劑或(huo)本發明(ming)第(di)三方面所(suo)述(shu)的(de)試(shi)劑盒在(zai)制備檢測hpv16和(he)/或(huo)hpv18的(de)產品或(huo)非診斷(duan)目的(de)檢測hpv16和(he)/或(huo)hpv18中的(de)應用。

64、本(ben)發(fa)(fa)明的第五方(fang)面，提供本(ben)發(fa)(fa)明第三方(fang)面所述試劑盒的使用(yong)方(fang)法，包括以下步驟(zou)：使用(yong)本(ben)發(fa)(fa)明第三方(fang)面所述的試劑盒檢測待測樣(yang)本(ben)；

65、具體包含以下步(bu)驟(zou)：

66、s1、提取待測樣品(pin)dna；

67、s2、以步驟s1所提取的dna為(wei)擴(kuo)增(zeng)(zeng)模板，采用擴(kuo)增(zeng)(zeng)試劑進行擴(kuo)增(zeng)(zeng)反應得到產物；觀察擴(kuo)增(zeng)(zeng)反應體系顏色變化；

68、s3：使(shi)用膠體金免(mian)疫(yi)層析試(shi)紙條(tiao)檢測步驟s2得到的產物(wu)，觀察(cha)結果。

69、優選地，步驟s1具體(ti)為將所述待測樣本(ben)與本(ben)發明第(di)二方(fang)面所述的核酸釋(shi)放劑(ji)混合，提(ti)取(qu)待測樣品dna。

70、優選地，所述提取時間為(wei)2～5min。

71、優選(xuan)地，步(bu)驟s2的擴增(zeng)(zeng)條(tiao)件為：61～65℃擴增(zeng)(zeng)20～30min。

72、優選地，所述(shu)步驟s2中若反應體系不發生(sheng)顯色(se)變化，則為hpv16和18型陰性(xing)(xing)；若發生(sheng)顯色(se)變化，則為hpv16或18型陽性(xing)(xing)。

73、優(you)選(xuan)地，步(bu)驟s3的(de)檢測(ce)時間為(wei)3～15min。

74、優(you)選(xuan)地，步驟s3的(de)結果的(de)判斷標準為：

75、①質控線(xian)和檢測(ce)線(xian)t1或檢測(ce)線(xian)t2共出現兩條色(se)帶，則表明待測(ce)樣(yang)本為hpv18型陽性或hpv16型陽性；

76、②質控線和(he)檢(jian)測線t1和(he)檢(jian)測線t2共出現三條色(se)帶，則表明待測樣本為hpv18、16型陽(yang)性；

77、③陰性(xing)：僅出現質控線一條色帶，表明待(dai)測樣本為hpv16、18型(xing)陰性(xing)；

78、④無效：質控區和檢(jian)測線(xian)(xian)內不出(chu)條色(se)帶(dai)或只檢(jian)測線(xian)(xian)出(chu)現(xian)條色(se)帶(dai)，表明試(shi)紙條失效。

79、本發(fa)明的有(you)益效果是：

80、市面上的(de)樣本處(chu)理(li)需要(yao)多步(bu)驟的(de)提(ti)取和(he)純(chun)化，本發(fa)明提(ti)供了一種核酸釋放劑(ji)，無(wu)需長時(shi)間的(de)裂(lie)解(jie)和(he)加熱或(huo)者低溫輔助(zhu)裂(lie)解(jie)，可以對樣本在常溫的(de)條件下直接裂(lie)解(jie)，即(ji)可用于檢(jian)測，對樣本處(chu)理(li)快速簡(jian)單，只需一步(bu)即(ji)可用于后續的(de)凍干試劑(ji)復溶擴增步(bu)驟，無(wu)需大型設備進(jin)行(xing)離心方(fang)可實現的(de)核酸提(ti)取純(chun)化操作。

81、本(ben)發(fa)明還提(ti)供了(le)一種hpv檢(jian)(jian)(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒，使(shi)用(yong)本(ben)發(fa)明的核酸釋放劑(ji)進行裂解(jie)后(hou)結(jie)合(he)等(deng)溫擴增技術(shu)和膠(jiao)體(ti)金免(mian)(mian)疫層(ceng)(ceng)析(xi)技術(shu)實(shi)(shi)(shi)現(xian)(xian)hpv16、18分(fen)型，只需要20-30min即可(ke)完成檢(jian)(jian)(jian)測(ce)判讀，解(jie)決了(le)因弱陽性(xing)可(ke)視(shi)化染色(se)判讀不準確(que)，強陽性(xing)導(dao)致免(mian)(mian)疫層(ceng)(ceng)析(xi)出現(xian)(xian)鉤狀效(xiao)應(ying)的缺點；本(ben)發(fa)明在(zai)引(yin)物設計(ji)中(zhong)引(yin)入fam，biotin，digoxigenin，tamra熒光標記集團實(shi)(shi)(shi)現(xian)(xian)膠(jiao)體(ti)金免(mian)(mian)疫層(ceng)(ceng)析(xi)結(jie)果(guo)分(fen)型檢(jian)(jian)(jian)測(ce)效(xiao)果(guo)，檢(jian)(jian)(jian)測(ce)系(xi)統(tong)中(zhong)加入hnb染料實(shi)(shi)(shi)現(xian)(xian)結(jie)果(guo)可(ke)視(shi)化，；在(zai)整個檢(jian)(jian)(jian)測(ce)系(xi)統(tong)中(zhong)實(shi)(shi)(shi)現(xian)(xian)染色(se)可(ke)視(shi)、試(shi)劑(ji)條(tiao)分(fen)型雙判讀，從根本(ben)上解(jie)決了(le)膠(jiao)體(ti)金免(mian)(mian)疫層(ceng)(ceng)析(xi)技術(shu)可(ke)能因鉤狀效(xiao)應(ying)導(dao)致的假陰性(xing)，提(ti)高檢(jian)(jian)(jian)測(ce)結(jie)果(guo)的準確(que)性(xing)，一個試(shi)紙條(tiao)一次檢(jian)(jian)(jian)測(ce)即可(ke)實(shi)(shi)(shi)現(xian)(xian)hpv16、18分(fen)型。

82、本發明核酸釋放劑及可(ke)視化(hua)等(deng)溫擴增凍干(gan)試劑均可(ke)以常溫運輸和保(bao)存(cun)，確(que)保(bao)了hpv檢測(ce)試劑在極(ji)端環境下(xia)的(de)穩定性和活性；而且凍干(gan)試劑為1人份/管可(ke)避免(mian)市面pcr試劑使用過程中反復凍融的(de)情況(kuang)，降低試劑受污染幾率(lv)，同時降低了運輸和存(cun)儲成(cheng)本。

83、本發明(ming)操作(zuo)簡單(dan)，主要(yao)包含以(yi)下(xia)三(san)步：一(yi)、凍干試劑(ji)加(jia)(jia)入(ru)樣(yang)本復溶(rong)后(hou)(hou)上機擴(kuo)增；二、對(dui)(dui)擴(kuo)增產物(wu)進(jin)(jin)行(xing)稀(xi)釋后(hou)(hou)試紙(zhi)放入(ru)產物(wu)管中(zhong)進(jin)(jin)行(xing)層析；三(san)、結果判讀。三(san)步簡便操作(zuo)，耗時短，擴(kuo)增時間(jian)20-30min，搭配(pei)一(yi)個簡易的(de)(de)單(dan)一(yi)加(jia)(jia)熱(re)(re)擴(kuo)增儀(yi)(yi)器(qi)或(huo)其他有其他加(jia)(jia)熱(re)(re)功能的(de)(de)儀(yi)(yi)器(qi)，無需復雜的(de)(de)昂(ang)貴(gui)熱(re)(re)循環功能的(de)(de)梯度pcr儀(yi)(yi)或(huo)tct設(she)備與(yu)工具，以(yi)及(ji)專業的(de)(de)技術人員進(jin)(jin)行(xing)操作(zuo)；擴(kuo)增后(hou)(hou)通過(guo)膠體金層析試紙(zhi)條(tiao)檢測對(dui)(dui)核酸擴(kuo)增產物(wu)進(jin)(jin)行(xing)可(ke)視化(hua)檢測；整個檢測過(guo)程對(dui)(dui)儀(yi)(yi)器(qi)設(she)備要(yao)求較低，可(ke)實現(xian)居家使(shi)用(yong)，在(zai)醫療條(tiao)件(jian)相對(dui)(dui)落后(hou)(hou)的(de)(de)地區也可(ke)大量推廣使(shi)用(yong)，適應(ying)各種實際應(ying)用(yong)場景。