本申請涉(she)及運動發酵單胞菌表面展(zhan)示，具體涉(she)及用于運動發酵單胞菌表面展(zhan)示的蛋白。

背景技術：

1、表(biao)面展示(shi)技術原理(li)是將目(mu)的(de)蛋白的(de)基(ji)(ji)因序列與載(zai)體蛋白的(de)基(ji)(ji)因序列連接(jie)后(hou)導入(ru)運(yun)動(dong)發酵單胞菌(jun)細(xi)胞進行表(biao)達(da)，載(zai)體蛋白能(neng)夠攜帶目(mu)的(de)蛋白同時或融(rong)合表(biao)達(da)并定位于細(xi)菌(jun)表(biao)面的(de)糖基(ji)(ji)磷脂酰肌醇(chun)(gpi)上，從而(er)實現目(mu)的(de)蛋白的(de)表(biao)面展示(shi)。細(xi)菌(jun)表(biao)面展示(shi)技術已成功應用(yong)于重組細(xi)菌(jun)疫(yi)苗的(de)制備、全(quan)細(xi)胞吸附劑(ji)、全(quan)細(xi)胞催化劑(ji)、診(zhen)斷的(de)細(xi)胞固(gu)相(xiang)試劑(ji)以(yi)及生物(wu)傳感器(qi)等領域。

2、目前，常用(yong)于表(biao)面(mian)(mian)展(zhan)示的細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)主要包括(kuo)大腸桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、乳(ru)酸菌(jun)(jun)(jun)、黃(huang)單(dan)胞(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)、惡臭假單(dan)胞(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)和芽(ya)孢桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、運(yun)動發酵單(dan)胞(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)等。用(yong)于細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)表(biao)面(mian)(mian)展(zhan)示系統的載(zai)體蛋(dan)白(bai)包括(kuo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外膜蛋(dan)白(bai)、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)附屬物、脂蛋(dan)白(bai)、毒力因子、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜孔道蛋(dan)白(bai)或細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)壁(bi)相關蛋(dan)白(bai)質，例(li)如ompa、lamb、ompc、ompx和omps等。

3、運動發酵(jiao)單(dan)胞菌(jun)(zymomonas?mobilis)作(zuo)為發酵(jiao)單(dan)胞菌(jun)屬的一個種(zhong)，其通過(guo)ed代謝(xie)途徑將葡萄糖和果糖轉化為乙醇(chun)的細(xi)菌(jun)。因(yin)其丙酮酸脫(tuo)羧(suo)酶和乙醇(chun)脫(tuo)氫酶基(ji)因(yin)能夠高效(xiao)表達，乙醇(chun)發酵(jiao)能力非(fei)常突出。同時z.mobilis生長的營養(yang)需求相對(dui)簡單(dan)。這些優(you)點(dian)使得z.mobilis在工業化生產領域具(ju)有廣闊的應用(yong)前(qian)景。

4、因此，開發能(neng)(neng)夠(gou)于z.mobilis表(biao)(biao)面展示(shi)(shi)技術，使得靶向蛋(dan)白展示(shi)(shi)其表(biao)(biao)面，能(neng)(neng)夠(gou)為z.mobilis底物范圍拓寬和應用(yong)價值提升提供技術支(zhi)持。

技術實現思路

1、本(ben)申請提供了一種(zhong)載體(ti)蛋(dan)(dan)白(bai)。該載體(ti)蛋(dan)(dan)白(bai)能(neng)(neng)夠(gou)通過構建表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)構建體(ti)，促使目的蛋(dan)(dan)白(bai)與其融合(he)，從而促使目的蛋(dan)(dan)白(bai)展(zhan)示于(yu)運(yun)(yun)動發(fa)酵單胞菌(jun)的菌(jun)體(ti)表(biao)(biao)(biao)面。該載體(ti)蛋(dan)(dan)白(bai)能(neng)(neng)夠(gou)增加運(yun)(yun)動發(fa)酵單胞菌(jun)將(jiang)異源(yuan)基因表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)在細胞膜外(wai)的途徑。該載體(ti)蛋(dan)(dan)白(bai)為運(yun)(yun)動發(fa)酵單胞菌(jun)將(jiang)異源(yuan)酶類融合(he)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)其細胞膜表(biao)(biao)(biao)面，以(yi)減少(shao)利(li)用淀粉、纖維素等(deng)為原料生產工業乙醇過程中的商品化酶的用量，降(jiang)低(di)生產成本(ben)，提供了一種(zhong)新(xin)的工具。

2、為此，本申(shen)請實施例至少公開了以下(xia)技術方案：

3、第一方(fang)面，實施例公開(kai)了用于運動發酵單胞菌的表面展(zhan)示的載(zai)體(ti)蛋(dan)白，所(suo)述載(zai)體(ti)蛋(dan)白如(ru)seq?id?no:1所(suo)示。

4、第二方(fang)面，實施例公開了編碼(ma)第一方(fang)面所述載體蛋白(bai)的dna分子，如seq?id?no:2所示。

5、第(di)三方(fang)面(mian)，實(shi)施例(li)公開了編碼(ma)融合蛋(dan)白(bai)的表(biao)達(da)(da)(da)構(gou)建體，應用于運動發酵單胞菌的表(biao)面(mian)展(zhan)示。所述(shu)表(biao)達(da)(da)(da)構(gou)建體包含編碼(ma)用于表(biao)達(da)(da)(da)第(di)一(yi)(yi)方(fang)面(mian)所述(shu)載(zai)體蛋(dan)白(bai)的第(di)一(yi)(yi)核(he)苷(gan)酸(suan)(suan)序列和編碼(ma)用于表(biao)達(da)(da)(da)目的蛋(dan)白(bai)的第(di)二核(he)苷(gan)酸(suan)(suan)序列；其中，所述(shu)第(di)一(yi)(yi)核(he)苷(gan)酸(suan)(suan)序列如seq?id?no:2所示。

6、第四方面，實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例公(gong)開了編碼融合蛋白的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，應用于運動(dong)(dong)發酵單胞(bao)菌的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)面展示。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker和seq?id?no:3依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker、seq?id?no:3和6×his標(biao)(biao)簽(qian)依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)d6、seq?id?no:2、tev?linker和seq?id?no:3依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)e6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tevlinker和seq?id?no:3依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)k6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker和seq?id?no:3依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)kkr2、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker和seq?id?no:3依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)d6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?idno:2、tev?linker、seq?id?no:3和6×his標(biao)(biao)簽(qian)依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)e6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tevlinker、seq?id?no:3和6×his標(biao)(biao)簽(qian)依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)k6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?idno:2、tev?linker、seq?id?no:3和6×his標(biao)(biao)簽(qian)依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)kkr2、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker、seq?id?no:3和6×his標(biao)(biao)簽(qian)依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)r6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seqid?no:2、tev?linker和seq?id?no:3依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)構(gou)(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)為(wei)(wei)r6、lacuv5啟(qi)動(dong)(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker、seq?id?no:3和6×his標(biao)(biao)簽(qian)依次(ci)(ci)(ci)(ci)連(lian)接(jie)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。

7、第五方(fang)面(mian)(mian)，實施例(li)公開了一種重組(zu)載體，其包括基(ji)礎載體以及(ji)插入于(yu)所述基(ji)礎載體上的第三方(fang)面(mian)(mian)所述的表達構(gou)建體。

8、第六(liu)方(fang)面，實施(shi)例公開了一種重組運(yun)動發酵單胞菌(jun)，其包含第三(san)方(fang)面所述(shu)的表(biao)達構建體。

9、第(di)七(qi)方面(mian)，實施(shi)例公開了一種由第(di)三方面(mian)所述(shu)的表達構(gou)建(jian)體(ti)編碼的融合蛋白(bai)。

10、第八方面(mian)，實施例(li)公開了一種在運動發酵(jiao)單(dan)胞菌(jun)(jun)表面(mian)展示融合(he)(he)蛋(dan)白的(de)方法(fa)。所(suo)述方法(fa)包括：在運動發酵(jiao)單(dan)胞菌(jun)(jun)中(zhong)表達(da)第七方面(mian)的(de)融合(he)(he)蛋(dan)白；和將所(suo)述融合(he)(he)蛋(dan)白固定到所(suo)述運動發酵(jiao)單(dan)胞菌(jun)(jun)的(de)表面(mian)。

技術特征：

1.用于(yu)運動發酵單胞菌的(de)表面(mian)展示的(de)載(zai)體(ti)(ti)蛋(dan)白(bai)，所述(shu)載(zai)體(ti)(ti)蛋(dan)白(bai)如seq?id?no:1所示。

2.編碼(ma)權利要求1所(suo)述(shu)載體蛋白的(de)dna分子，如seq?id?no:2所(suo)示。

3.編(bian)碼(ma)(ma)融合蛋白(bai)(bai)的(de)表(biao)達(da)構(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)，應用(yong)于運動發酵單胞菌的(de)表(biao)面展示(shi)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)表(biao)達(da)構(gou)(gou)建(jian)(jian)體(ti)包含編(bian)碼(ma)(ma)用(yong)于表(biao)達(da)權利要(yao)求1所(suo)(suo)述(shu)(shu)載體(ti)蛋白(bai)(bai)的(de)第(di)(di)一(yi)核(he)苷酸序列和編(bian)碼(ma)(ma)用(yong)于表(biao)達(da)目的(de)蛋白(bai)(bai)的(de)第(di)(di)二核(he)苷酸序列；其(qi)中，所(suo)(suo)述(shu)(shu)第(di)(di)一(yi)核(he)苷酸序列如seq?id?no:2所(suo)(suo)示(shi)。

4.根據權(quan)利要求3所述的表達構建(jian)體(ti)(ti)，可選地，所述表達構建(jian)體(ti)(ti)還包含編碼帶電肽的第(di)三(san)(san)核苷(gan)酸序(xu)列，所述第(di)三(san)(san)核苷(gan)酸序(xu)列如seq?id?no:4～8任(ren)一所示；

5.根(gen)據權利要求3所述的表達(da)構建體，所述目的蛋白為α-淀粉酶(mei)酶(mei)。

6.編(bian)碼融(rong)合蛋白的(de)表達(da)(da)構建體，應用于運動(dong)發酵單(dan)胞菌的(de)表面展示，所述表達(da)(da)構建體為lacuv5啟動(dong)子、seq?id?no:2、tev?linker和seq?id?no:3依(yi)次(ci)連接(jie)形成的(de)核苷酸序(xu)列；或(huo)者

7.一種重組載(zai)體，其包括基礎載(zai)體以(yi)及(ji)插入于所(suo)述基礎載(zai)體上的(de)權利要(yao)求3～5任一所(suo)述的(de)表達構建體。

8.一種重(zhong)組運動發(fa)酵單胞菌，其包含權利要求3～5任一所述的表達構建體。

9.一種由權利要求3～5任(ren)一所述的表(biao)達(da)構建體(ti)編碼的融(rong)合蛋(dan)白。

10.一種在(zai)運(yun)動發酵(jiao)單胞菌表(biao)面(mian)展示融合(he)蛋白的方法，包括(kuo)：

技術總結
本申請公開了用于運動發酵單胞菌表面展示的蛋白。該蛋白能夠通過構建表達構建體，促使目的蛋白與其融合，從而促使目的蛋白展示于運動發酵單胞菌的菌體表面。該蛋白為運動發酵單胞菌將異源酶類融合表達其細胞膜表面，以減少利用淀粉等為原料生產工業乙醇過程中的商品化酶的用量，降低生產成本，提供了一種新的工具。

技術研發人員：沈威,魏映馳,楊世輝
受保護的技術使用者：武漢睿嘉康生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19