專利名稱：用于實體瘤的化學栓塞治療的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有聚合栓塞物質和一種結合到該聚合物基質中的治療劑的組合物。這種組合物用于栓塞腫瘤和向腫瘤釋放細胞毒劑。
栓塞治療是介入醫學中一個正在發展的領域，但是通常它要依賴導管經動脈到達指定位置，從而釋放出一種試劑以阻塞特定的血管。這種治療已經被用于阻斷諸如肝細胞腫瘤的某些血管過多的腫瘤的血液供應，而且近來正成為子宮纖維瘤治療的一個普遍選擇。
臨床應用的栓塞物質具有一定的范圍，需要能夠經導管釋放到栓塞部位，從而被釋放到血流中并將其阻斷。這可以通過應用小的粒子或小球從物理上阻斷血管實現，或者在液體栓塞劑情況下，需要某種相變或反應使流動性物質固化并在血管內形成鑄型物(cast)。
最普遍的基于微粒的栓塞劑是已經應用了數十年的聚乙烯醇(PVA)泡沫粒子(如埃弗倫)。最近，已經出現了這種物質的微粒而不是薄片形式，因此不需要在釋放前由外科醫師制成顆粒狀。
在WO-A-0168720中敘述了基于PVA的栓塞治療組合物。先將PVA衍生化形成具有丙烯酸側鏈基團的大單體。然后任選在共聚單體存在下使這些丙烯酸基團聚合，形成遇水可膨脹但不溶于水的聚合物基質。聚合反應可以在原位發生，藉此PVA在被釋放入血管到達栓塞部位后具有了水不溶性。另外，聚合也可在釋放前進行，通常形成微球并在以在水性媒介中的懸浮液形式釋放。
在WO-A-0168720中，建議可以在栓塞組合物中加入生物活性劑，使活性劑可以從所形成的水凝膠中釋放。一類活性劑是化學治療劑。化學治療劑的實例有順鉑、阿霉素和絲裂霉素。該文獻給出了關于將活性劑結合到栓塞組合物中的方法的一些一般性的指導。如果組合物是一種原位固化的液體，活性劑能夠很容易地和液體混合。如果該制品是預先形成的，則建議可通過“包封”或者通過涂到表面上來結合活性劑。還沒有將治療劑結合到任何類型的組合物中成功的例子。
用醛交聯劑如戊二醛使聚甲基丙烯酸羥乙酯、經水解的聚甲基丙烯酸甲酯和PVA交聯形成的水凝膠物質的微球也已經用作栓塞劑。甲基丙烯酸羥乙酯可與共聚單體如含有酸性基團的共聚單體共聚。例如，甲基丙烯酸羥乙酯和約1-2摩爾％丙烯酸通過0.3-1.0摩爾％乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯后形成的交聯共聚物，其平衡水分含量范圍在55-60％(重量)之間，并已以隱形眼鏡形式使用多年。
市場上的一種栓塞產品由Biosphere公司出售，該產品含有帶有膠原蛋白涂層的三丙烯酰明膠(trisacrylgelatin)微球。膠原蛋白在生理pH下總體上帶有正電荷。在Ball，D.S.et al.，J.Vasc.Interv.Radiol.(2003)，14，83-88中，Biosphere公司證明，當微球體與常與栓塞組合物同時給予的一系列藥物混合時，微球的機械特性并沒有受到不利的影響。對阿霉素、順鉑和米托蒽醌進行了專門的測試。
阿霉素和其他蒽環類已經結合到許多以聚合物基質為基礎的釋放系統中，例如聚丙交酯類或聚乙交酯類微球以及交聯纖維蛋白原和白蛋白微球。Juni，K.等人(Chem.Pharm.Bull.(1985)，33(1)，313-318)描述了將阿霉素結合到聚乳酸微球中以及使該組合物動脈內釋放至狗的肝臟。該組合物栓塞了肝臟的外周動脈。這些類型的微球比較堅硬，不易存儲和釋放。已經將阿霉素共價連接到交聯聚乙烯醇表面并且檢測了它的細胞毒特性(Wingard，L B et al.CancerResearch(1985)45(8)3529-3536)。由于藥物被共價結合到聚合物上，在釋放之前必須從表面上切下，因此在生理條件下可能無法釋放。
Jones，C.等人(Brit.J.Cancer(1989)59(5))描述了將阿霉素結合到離子交換微球上及用該組合物對大鼠腫瘤模型進行化學栓塞治療。
本發明的一種新的適用于栓塞的組合物包含具有一種遇水可膨脹但不溶于水的聚合物基質和一種吸收在該基質中的水溶性治療劑的粒子，其特征在于該聚合物在pH6-8范圍內總體帶有負電荷，當粒子在水中膨脹達到平衡時，其粒子大小在40-1500μm之間，治療劑為帶有至少一個氨基的蒽環類化合物。
本發明中的聚合物必須是遇水可膨脹但不溶于水的。因此，在水性液體存在下，聚合物會形成水凝膠。一般而言該聚合物是共價交聯的，但該聚合物至少部分離子交聯也是合適的。該聚合物可以通過烯鍵不飽和單體在雙官能或更高官能度的交聯單體存在下進行聚合而制成，烯鍵不飽和單體包括陰離子單體。可以使用甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸和交聯單體如乙二醇二甲基丙烯酸酯或亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物，如用于基于etafilcon A的隱形眼鏡的共聚物。
另一類可以用于形成遇水可膨脹但不溶于水的基質的聚合物是用醛類交聯劑如戊二醛交聯的聚乙烯醇。對于這種產物，聚乙烯醇必須是陰離子型的，例如通過使含有酸性官能團的單體與羥基反應提供陰離子側鏈基團。合適的試劑的例子有二酸，如二羧酸。
如果聚合物基質由每個分子都含有不止一個烯鍵不飽和側鏈基團的聚乙烯醇大分子單體，通過與包括一種酸性單體的烯鍵不飽和單體共聚合而制成，則本發明具有特殊的價值。PVA大分子單體可以通過例如提供具有合適的分子量如1000-500,000D之間，優選在10,000-100,000D之間，帶有乙烯或丙烯酸側鏈基團的PVA聚合物來制成。丙烯酸側鏈基團可以由例如丙烯酸或甲基丙烯酸與PVA通過某些羥基發生反應生成酯鍵來形成。能夠使乙烯基團聚合到聚乙烯醇上的方法在例如US 4,978,713，優選US 5,508,317和5,583,163中有所敘述。例如，優選的大分子單體包含一個聚乙烯醇的骨架，該骨架通過一個環狀縮醛鍵與一個(烷基)丙烯酰氨烷基部分連接。實施例1描述了這樣一種大分子單體的合成。優選每個分子具有約2-20個(例如5-10個)烯基側鏈基團的PVA大分子單體，。
當PVA大分子單體與包括一種酸性單體的烯鍵不飽和單體共聚合時，所述酸性單體優選具有通式IY1BQ其中Y1選自 CH2＝C(R)-CH2-O-，CH2＝C(R)-CH2OC(O)-，CH2＝C(R)OC(O)-，CH2＝C(R)CH2＝C(R)CH2OC(O)N(R1)-，R2OOCCR＝CRC(O)-O-，RCH＝CHC(O)O-，RCH＝C(COOR2)CH2-C(O)-O-， 和 其中R是氫或者C1-C4烷基；R1是氫或者C1-C4烷基；R2是氫或者C1-4烷基或者BQ，其中B和Q定義如下A是-O-或者-NR1-；
K1是基團-(CH2)rOC(O)-、-(CH2)rC(O)O-、-(CH2)rOC(O)O-、-(CH2)rNR3-、-(CH2)rNR3C(O)-、-(CH2)rC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)O-、-(CH2)rOC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)NR3-(其中基團R3相同或不同)、-(CH2)rO-、-(CH2)rSO3-、或任選與B1結合而形成一個共價鍵，r為1到12，R3是氫或C1-C4烷基；B是直鏈或支鏈烷二基、氧亞烷基、烷二基氧烷二基或烷二基低聚(氧烷二基)鏈，該鏈任選包含一個或更多個氟原子，直到形成全氟取代鏈；或者，如果Q或Y1包含一個與B鍵接的末端碳原子，是一個共價鍵；Q是一個陰離子基團。
所述陰離子基團可以是諸如羧酸鹽、碳酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、膦酸鹽或磷酸鹽基團，優選磺酸鹽基團。單體可以以游離酸或者鹽的形式聚合。優選共軛酸的pKa值小于5。
在通式I的單體中，Y1優選為CH2＝CRCOA-基團，其中R是氫或甲基，優選甲基，A優選為NH。B優選為1-12個碳原子，優選2-6個碳原子的烷二基。
一種特別優選的單體類型是(烷基)丙烯酰氨基烷基磺酸，如2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)。
在烯鍵不飽和單體中可以包含稀釋單體，例如非離子單體。這種單體可能有利于控制酸性基團的pKa，控制產物的親水性或疏水性，在聚合物中提供疏水區，或者僅起惰性稀釋劑的作用。非離子稀釋單體的例子有(烷基)丙烯酸烷基酯和(烷基)丙烯酰胺，尤其是含有1-12個碳原子的烷基的這類化合物；羥基和二羥基取代的(烷基)丙烯酸烷基酯和(烷基)丙烯酰胺；乙烯基內酰胺；苯乙烯及其他芳香單體。
烯鍵不飽和單體還可以包括兩性離子單體，例如為了增加粒子的親水性、潤滑性、生物相容性和/或血相容性。合適的兩性離子單體在我們先前公開的WO-A-9207885、WO-A-9416748、WO-A-9416749和WO-A-9520407中有所敘述。兩性離子單體優選為2-甲基丙烯酰氧基-2’-三甲胺乙基磷酸內鹽(MPC)。
在聚合物基質中，陰離子水平優選在0.1-10meq g-1的范圍，優選至少為1.0meq g-1。
在PVA大分子單體與其他烯鍵不飽和單體共聚合時，PVA大分子單體與其他單體的重量比優選在50∶1到1∶5范圍內，更優選在20∶1到1∶2范圍內。在烯鍵不飽和單體中，陰離子單體的含量優選在10-100摩爾％范圍，優選至少25摩爾％。
通過重量分析測定，遇水可膨脹但不溶于水的聚合物優選具有40-99％(重量)的平衡水含量，優選75-95％。
聚合物可以通過幾種方法形成粒子。例如，交聯的聚合物可以制成整塊材料如薄片或塊狀，然后粉碎成所需的尺寸。另外，交聯聚合物也可以本身就制成粒子形式，例如在連續的不互溶載體的分散相中以單體的小滴進行聚合。已知的例子如合適的油包水聚合能夠產生膨脹時具有預期大小的粒子。例如，US 4,224,427描述了在存在懸浮劑的情況下，通過將水溶性單體分散到連續的溶劑相中，形成最大直徑為5mm的大小一致的球狀珠的方法。可以加入穩定劑和表面活性劑以控制分散相粒子的大小。聚合后，交聯的微球用已知方法回收，清洗并任選消毒。粒子例如微球優選在水性液體中膨脹并根據它們的大小進行分級。
本發明所使用的治療活性物質是一種蒽環類化合物，它包括連接有一個氨基糖的蒽醌基團。據認為，糖上的氨基與聚合物基質中的陰離子基團結合，從而實現高水平的載藥量和給藥后的受控釋放。
合適的蒽環類化合物的例子具有通式II 我們已經發現，對各種腫瘤的有效性已經得到全面測試的阿霉素具有特別有趣的載藥和釋放特性。該藥物似乎對聚乙烯醇-接枝-丙烯酰氨基丙磺酸共聚物有特殊的親和力，因此高水平的阿霉素能夠結合到該聚合物中并在多日內釋放。
在本發明中，藥物非共價結合到聚合物基質上是很重要的。
治療活性物質可以通過多種方法結合到聚合物基質中。在一種方法中，在聚合或交聯之前治療活性物質可以與一種聚合物前體混合，例如一種單體或大分子單體混合物或者一種可交聯的聚合物和交聯劑的混合物。另外，活性物質也可以在聚合物交聯后再加載到其中。例如，微粒狀干燥聚合物可以在治療活性物質的溶液(優選水溶液)中膨脹，隨后任選除去未吸收的藥物并/或蒸發溶劑。活性物質溶于諸如乙醇等有機溶劑(或更優選的是水)的溶液，可以噴射到粒子的移動床上，藉此藥物在除去溶劑的同時被吸收到粒子本體內。最為方便的是，我們已經發現可以僅僅將懸浮于連續液體介質如水中的膨脹粒子與藥物溶液長時間接觸，由此藥物被吸收到粒子本體內。據認為，這類似于陽離子交換型過程。隨后可以將膨脹介質除去，或者方便地將膨脹介質和粒子一起作為產物的一部分保留下來，以后用作為栓塞劑。
在一個特別優選的實施方案中，膨脹粒子通過簡單的凝膠/液體分離技術與未被基質吸收的膨脹介質分離，例如經孔徑合適的濾器(方便的是玻璃濾器)過濾。帶有很少或沒有粒子外液體的膨脹粒子漿可被泵入合適的貯存容器中以消毒和以原樣保存。發現該粒子漿足夠穩定，因為在這種形式的儲存過程中很少有液體滲出，也沒有藥物損失。
另外，粒子的懸浮液也可以通過過濾來除去任何殘留的載藥溶液，粒子可以通過用于干燥藥物產品的任何經典方法來干燥。這包括但不局限于室溫或高溫、或減壓或真空下的空氣干燥；經典的冷凍干燥；常壓冷凍干燥；超臨界流體的溶液強化分散(SEDS)。另外，載藥的微球可以用有機溶劑取代水通過一系列步驟而脫水，接著使更易揮發的有機溶劑蒸發。有機溶劑應當選擇不能溶解藥物的溶劑。
簡言之，一個典型的經典冷凍干燥過程可以如下進行將一份樣品分裝到一些被部分塞住的玻璃小瓶中，將小瓶放置在冷凍干燥器中冷卻的控溫架上。降低控溫架的溫度，使樣品凍結至均勻的確定溫度。冷凍完成以后，降低干燥器中的壓力至確定的壓力以啟動初級干燥。在初級干燥過程中，水蒸氣通過升華從凍結塊中被逐步除去，同時控溫架的溫度被控制在恒定的低溫。二級干燥通過提高控溫架溫度并進一步降低室壓來啟動，因此吸收在半干燥塊中的水可以被除去直到殘余的水分減少到希望的水平。小瓶可以在原位密封，如果需要可在保護氣氛下密封。
常壓冷凍干燥法是通過在冷凍產物上進行非常干燥的空氣的快速循環來完成的。與經典的冷凍干燥方法相比，非真空冷凍干燥具有許多優點。循環的干燥氣體改善了冷凍樣品的熱量和質量轉移，這與洗滌物在有風的天氣中干得更快是相同的。這個領域的大多數工作都與食品生產有關，已經觀察到揮發性芳香化合物的保留量有所增加，其對生物制品干燥的潛在益處尚不確定。特別引人注意的是，使用常壓噴霧干燥方法得到的是自由流動的細粉末而不是塊狀物。可以獲得具有亞微米級直徑的粒子，這比通常由磨制得到的粒子小十倍。微粒的本質以及它的大表面積導致產生易于再水合的產物，目前還不可能對可吸入和經皮膚應用所需的粒子大小進行精細的控制，但是這個領域仍存在潛力。
對于患有實體瘤如肝細胞腫瘤并需要進行栓塞治療的患者給予的組合物是含有吸收藥物的膨脹粒子的水懸浮液。通常希望懸浮液在釋放之前與成像劑如用于凝膠型栓塞組合物的常規造影劑混合。例如，含有吸收藥物的膨脹粒子的水懸浮液可以在臨給藥之前與通常與栓塞劑一起使用的液體造影劑如碘油按體積比2∶1到1∶2的量(優選約1∶1)混合。對于本發明中含有吸收藥物但極少或不含有粒子外液體的膨脹粒子漿的實施方案，粒子漿和造影劑可以類似地在臨釋放前混合在一起，例如按體積比在1∶5到2∶1范圍，優選在1∶2到1∶1范圍的量混合。當含有藥物的組合物以干燥的形式供給使用時，可將干燥的粒子加入造影劑中，或者優選先在水性介質如生理鹽水中膨脹以形成漿液或懸浮液，然后在釋放之前與造影劑混合。另外，除蒽環化合物外，粒子還可以預先裝載造影劑。給藥的組合物也可以與其他治療劑相混合，或者也可以與其他治療劑分開聯合給藥。通常，組合物用常規的釋放裝置如動脈內導管從注射器針筒中給藥。
給予需要栓塞治療的患者的栓塞組合物可以以一次性單劑量釋放。栓塞過程采用常規技術通過跟蹤造影劑來監控。可能會發現，最好在第一次劑量給予一段時間后，如在第一次用含有阿霉素的組合物治療4-10周后，釋放二次劑量的栓塞組合物，以栓塞新形成的向腫瘤供血的血管，優選二次劑量的栓塞組合物，優選可用于本發明的化學栓塞組合物。組合物以每次治療25-100mg/m2范圍的藥物劑量給藥，但也可以在經過充分的安全性評估后使用更高的劑量。阿霉素每次治療的優選劑量可大于50mg/m2，例如達到100mg/m2或更高。通常認為每個患者每次治療給予高于150mg的劑量是不可取的。
作為本發明的第二方面，提供了一種蒽環化合物在制備用于對實體瘤進行栓塞治療的組合物中的用途，在此治療中，蒽環化合物從一種聚合物基質中釋放，所述聚合物基質是由每個分子帶有至少兩個烯鍵不飽和側鏈基團的聚乙烯醇大分子單體和烯鍵不飽和陰離子單體共聚合形成的。
在本發明的這個方面，聚合物基質可以在原位形成。這樣，含有大分子單體、陰離子單體和蒽環化合物的液體組合物可以被釋放到患者的血液循環中并被置于能夠在靶部位引發聚合的條件下，由此形成栓塞凝膠。另外，聚合物基質也可以在給藥前預先形成，如本發明的第一方面所述。
PVA大分子單體和陰離子單體優選如以上第一方面所述。其他單體也可以如本發明第一方面所述進行共聚合。
本發明由以下實施例具體說明，其結果如下圖所示

圖1顯示實施例2的結果；圖2顯示實施例3的結果；圖3顯示實施例4的結果；圖4顯示實施例5的結果；圖5顯示實施例6的結果；圖6a和b顯示實施例7的結果。
實施例1微球制備方法概述Nelfilcon B大分子單體合成微球合成的第一個階段步包括制備Nelfilcon B，它是一種來自廣泛使用的水溶性聚合物PVA的可聚合性大分子單體。將Mowiol 8-88聚乙烯醇(PVA)粉末(88％水解，含12％醋酸鹽，平均分子量約67,000D)(150g)(Clariant，Charlotte，NC USA)加入到一個2升的玻璃反應容器內。隨著輕緩輕地攪拌下加入1000ml水并將使攪拌速度增加提高到400rpm。為了確保PVA完全溶解，將溫度提高增加到99±9℃保持2-3小時。在冷確卻到室溫后，將時N-丙烯酰氨基乙醛(NAAADA)(Ciba Vision，德國)(2.49g或0.104mmol/g的PVA)混合到PVA溶液中，隨后加入濃鹽酸(100ml)，以催化NAAADA通過酯交換作用與PVA的加成。反應在室溫進行6-7小時，然后使用2.5M的氫氧化鈉溶液中和至pH7.4來終止反應。所生成的氯化鈉和所有未反應的NAAADA用透析過濾法除去(步驟2)。
大分子單體的透析過濾透析過濾(切向流過濾)的原理是使需要純化的進料溶液(在本例中為Nelfilcon B溶液)跨過濾膜表面連續循環，濾膜能使不需要的物質(NaCl、NAAADA)透過成為廢棄物，同時具有足夠小的孔徑可以阻止保留液通過而使其留在循環中。
Nelfilcon B透析過濾使用不銹鋼Pellicon 2小型支架進行，該支架上堆放有若干其孔徑的截留分子量為3000的0.1m2纖維素濾膜(Millipore Corporation，Bedford，MA美國)。Mowiol 8-88的重均分子量為67000，因此透過濾膜的能力有限。
向裝有大分子單體的燒瓶中放入磁性攪拌棒并將燒瓶放置在攪拌板上。使用LS24 VI型導管，經安裝有Easy Load II泵頭的MasterflexLS蠕動泵將溶液加入到透析過濾組件中。Nelfilcon以大約50磅/平方英寸在濾膜上循環以加速滲透。當溶液被濃縮到約1000ml時，以與廢棄的濾出液收集速度相同的速度加入水以保持體積恒定，直到額外加入6000ml水。完成后立即在25℃下將溶液濃縮至20-23％固體，粘度為1700-3400厘泊。Nelfilcon通過GFC、NMR和粘度來定性鑒定。
微球合成用懸浮聚合法合成微球，其中將水相(Nelfilcon B)加入到與其不互溶的有機相(乙酸丁酯)中。采用快速混合能夠使水相分散形成液滴，液滴的大小和穩定性受諸如攪拌速度、粘度、水相和有機相的比例以及影響兩相之間界面能的穩定劑和表面活性劑的使用等因素的控制。制造了兩個系列的微球，即較低AMPS系列和較高AMPS系列，它們的組成如下所示。
A 高AMPS水相 約21％w/w Nelfilcon B溶液(約400±50g)約50％w/w 2-丙烯酰氨基-2甲基丙磺酸鈉鹽(140±10g)純化水(137±30g)過硫酸鉀(5.22±0.1g)四甲基乙二胺TMEDA(6.4±0.1ml)有機相乙酸正丁酯(2.7±0.3L)乙酸乙酯中的10％w/w乙酸丁酸纖維素(46±0.5g)(穩定劑)純化水(19.0±0.5ml)B 低AMPS水相 約21％w/w Nelfilcon B溶液(約900±100g)約50％w/w 2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸鈉鹽(30.6±6g)純化水(426±80g)過硫酸鉀(20.88±0.2g)TMEDA(25.6±0.5ml)有機相乙酸正丁酯(2.2±0.3L)乙酸乙酯中的10％w/w乙酸丁酸纖維素(CAB)(92±1.0g)純化水(16.7±0.5ml)用計算機控制的具有連續檢測反應溫度的反饋傳感器的熱浴(Julabo PN 9-300-650)加熱帶夾層的4000ml反應器。
25℃下將乙酸丁酯加入反應器中，然后加入CAB溶液和水。系統用氮氣吹掃15分鐘，然后加入PVA大分子單體。加入TMEDA并在氮氣下將溫度升至55℃保持3小時，引發分散的PVA溶液的交聯。交聯反應通過氧化還原引發的聚合反應來進行，即，TMEDA的氨基與過硫酸鉀中的過氧化基團反應生成自由基。然后這些自由基引發PVA和AMPS上的雙鍵的聚合和交聯，從而將分散的PVA-AMPS小滴轉化成不溶性的聚合物微球。冷卻到25℃后，產物被轉移到過濾反應器上進行純化，其中過濾除去乙酸丁酯，然后進行以下步驟·用2×300ml乙酸乙酯清洗以除去乙酸丁酯和CAB·在乙酸乙酯中平衡30分鐘，然后過濾·用2×300ml乙酸乙酯在真空過濾下清洗·在丙酮中平衡30分鐘并過濾除去乙酸乙酯、CAB和水·用2×300ml丙酮在真空過濾下清洗·在丙酮中平衡過夜·用2×300ml丙酮在真空下清洗·55℃下真空干燥2小時以除去殘余溶劑染色這一步是任選的，但是通常當藥物與有色活性物一起加載時這一步是不必要的(因為該有色活性物本身就可提供顏色)。當水合時，微球含有約90％(w/w)的水，很難觀察。為了便于在臨床環境中進行觀察，微球用活性藍4號染料(RB4)染成藍色。RB4是一種水溶性氯三嗪染料，它在堿性條件下能與PVA骨架上的羥基側鏈基團反應生成共價醚鍵。反應在pH12(NaOH)下進行，因此所生成的HCl會被中和而生成NaCl。
在染色之前，微球被完全重新水合并以35g為一份分成多份(分別處理)。染色液如下制備將0.8g RB4溶于2.5M NaOH溶液(25ml)和水(15ml)中，然后將其加入到2升80g/l鹽溶液中的微球中。混合20分鐘后，用32μm篩收集產物并漂洗除去未反應的染料塊。
提取采用一種粗提取方法來除去所有未結合的或非特異性吸附的RB4。所用的方案如下所示·在2升水中平衡5分鐘。在篩上收集并漂洗。重復5次。
·在2升80mM磷酸氫二鈉在0.29％(w/w)鹽溶液中的溶液中平衡。加熱至沸騰30分鐘。冷卻，在篩上收集并用1升鹽溶液洗滌。再重復2次。
·收集，在篩上洗滌，并在2升水中平衡10分鐘。
·收集并于1升丙酮中脫水30分鐘。
·合并所有各份微球并在2升丙酮中平衡過夜。
篩分所制得的微球產品大小范圍在100-1200微米，必須使用一定范圍篩孔大小進行篩分從而使其分級，獲得下列的額定分布。
1.100-300μm2.300-500μm3.500-700μm4.700-900μm5.900-1200μm在篩分之前，將微球真空干燥以除盡溶劑，然后于60℃在水中平衡以完全重新水合。使用帶有15英寸不銹鋼篩分盤、篩孔大小在32-1000μm范圍的316升不銹鋼渦旋篩裝置(vortisieve unit)(MMIndustries，Salem Ohio)對微球進行篩分。使過濾后的鹽溶液通過該裝置再循環以幫助分級。棄去32微米篩中收集的微球。
實施例2阿霉素的加載本實驗使用如實施例1制備的低AMPS微球。對所使用的每一種大小的微球，取0.5ml轉移至2個1ml注射器中，一個用于吸收藥物，另一個用作對照。實驗所選用的大小為106-300μm、300-500μm、500-710μm和850-1000μm。為了驗證操作的可靠性，再另外準備3個裝500-710μm微球的注射器。將11個10ml小玻璃瓶用箔蓋上，以防止在實驗過程中阿霉素被光降解。繪制標準曲線。用80ml濃度為20mg/ml的藥物溶液制備下列濃度并測定其光吸收(483nm)100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml和3.125μg/ml。將所得到的光吸收繪制成曲線圖，用曲線方程計算實驗中被微球吸收的藥物濃度。在加入微球時在4個小玻璃瓶中裝入5ml蒸餾水(ROMIL)用作對照。剩下的7個小玻璃瓶中加入5ml所需濃度的藥物溶液。起始光吸收及其對應的溶液濃度在制作標準曲線時就已經得知。(為了測定20mg/ml溶液的光吸收，必須將其稀釋200倍而使用100μg/ml的濃度。這種1∶200的稀釋液在測定微球對溶液的吸收的整個過程中都一直采用。)從第一批微球加入到第一個裝有藥物的小玻璃瓶中時就立即開始用計時表計時，微球按從最小到最大的順序加入其余6個小玻璃瓶的每個瓶中。小玻璃瓶用蓋子密封后，立即將其放到旋轉混合器上。對照組樣品重復同樣的操作。以和設立小玻璃瓶相同的順序在0.167小時(10分鐘)、0.5小時、1小時、2小時、24小時和96小時的時間間隔測定光吸收。從這些數據可以計算出每1ml微球的藥物量(mg數)和每1ml微球的藥物吸收百分率。結果如圖1所示。
實施例3藥物濃度對加載的影響依照實施例2所概述的方法，可以將一定范圍不同濃度的阿霉素加載到高AMPS微球制品上。據觀察，大部分藥物在幾小時內加載到微球(500-710μm大小范圍)上(見圖2)。可以觀察到加載量按重量計遠高于低AMPS制品。
實施例4微球大小對加載的影響在幾個不同大小范圍的微球上進行阿霉素的加載以便比較藥物吸收量。盡管觀察到較小的微球加載藥物較快，24小時內連續加載的結果表明，等重的微球達到平衡后的載藥量也大致相同。較快的吸收是由于較小微球的表面積增大(見圖3)。
實施例5加載的重現性為了測定阿霉素加載的重現性，將實施例2中概述的加載實驗重復多次。500-710μm大小范圍的高AMPS微球用20mg/ml藥物水溶液加載藥物，并監測藥物隨時間的吸收(圖4)。
實施例6阿霉素從微球中的洗脫高AMPS微球用不同濃度的阿霉素加載并將微球洗脫至250ml蒸餾水中(圖5)。
從133.2μg/ml和2mg/ml載藥微球上洗脫的藥物在3小時時仍低于檢測限。對于較高的載藥量，在最初的幾分鐘內有明顯的突釋效應(burst effect)，隨后是較緩慢的延時釋放。據推測，突釋反映了從微球內攜帶的水中洗脫出的游離藥物，而延時洗脫是由主要通過帶電基團間的離子相互作用“結合”到微球上的藥物造成的。就最高載藥量(來自20mg/ml加載溶液)而言，突釋效應代表了微球總載藥量的約45％，其余部分從載體上完全洗脫需要數天。研究表明，最終100％的藥物都能從微球上洗脫。
實施例7高AMPS微球對阿霉素吸收作用的觀察將1ml阿霉素在磷酸鹽緩沖液PBS中的溶液(66.6μg/ml)和3mlPBS加入裝有約0.5g大小在850-1000μm范圍(手工篩分)的高AMPS微球的小瓶中。將微球放在CCD照相機下，每隔2分鐘拍照一次，持續2.5小時。在此時間段內樣品未出現攪動，但觀察到由于光源的局部加熱所致的小量運動。因此最初和最后的微球是相同的，在整個時間段中都是可比的。借助微球中紅色的增強和周圍溶液的減少而觀察到藥物的吸收(圖6)。
實施例8干燥的載藥微球的制備微球可以按照實施例2所述的方法加載阿霉素。微球使用如下方法脫水將待脫水的微球放在塑料容器內，并用在PBS(InverclydeBiologicals)中制備的10％丙酮(ROMIL)溶液覆蓋。微球在溶液中放置10分鐘，在這個過程中攪拌幾次，每次30秒。然后將溶液傾倒出來，將這個過程再重復兩次。增加丙酮濃度至25％、50％、75％和最終100％，重復該步驟。在最終100％脫水步驟后，倒出丙酮并將微球放在50℃烤箱中干燥至恒重。
得到的干燥產物在栓塞操作前可以重新懸浮/重新水合于鹽水/造影劑中。水合速度很快，膨脹至＞80％完全水合時的體積只需幾分鐘。
實施例9微球漿的制備使按上面實施例1生產的高AMPS微球在20mg/ml阿霉素水溶液中膨脹30分鐘。在此之后觀察到粒子外液體已基本脫色，顏色(紅色)已基本被局限在微球內。懸浮液經燒結的玻璃漏斗過濾除去上清液。微球在輕微的負壓下，在過濾器上用兩倍體積的蒸餾水洗滌。然后將微球轉移到廣口瓶中，并用蠕動泵將其從廣口瓶泵入玻璃注射器中。移走泵后用注射器塞將注射器封閉并用伽馬射線滅菌。
實施例10加載-目標載藥劑量和實際載藥劑量在水中制備濃度為22-80mg/ml的一系列阿霉素溶液。取1ml這些溶液加入1ml高AMPS微球中，紫外檢測藥物吸收。樣品在滾動混勻器上攪動。取10、20、30、60分鐘時間點，其后是2小時，再后是24小時。由溶液中剩余的阿霉素計算吸收量。微球可以用最高至每ml水合微球80mg的不同劑量加載，在不到30分鐘內，99％的藥物溶液都已處于微球內。
實施例11高劑量阿霉素在實施例10中制備了80mg/ml的阿霉素溶液。這是一種粘稠的膠狀混合物，不適于日常使用。重復該高劑量，但使用4ml 20mg/ml的阿霉素溶液。紫外檢測藥物吸收，又獲得了1ml水合的高AMPS微球中載有80mg藥物的最終載藥量。
實施例12加載-藥物來源使用三種來源的阿霉素制備本發明中25mg/ml載藥量的微球。
·AdriamycinTMPFS是一種市售(Pharmacia and Upjohn)的濃度為2mg/ml的溶液。
·AdriamycinTMRDF是一種市售(Pharmacia and Upjohn)的加入了乳糖以助溶的粉劑。
·阿霉素EP。
對Adriamycin RDF和阿霉素EP溶液，取2ml加入2ml微球中，紫外檢測藥物吸收。對Adriamycin PFS溶液，取50ml 2mg/ml的溶液加入2ml微球中，檢測藥物吸收。30分鐘后兩個25mg/ml的溶液均已全部加載，而2mg/ml的溶液被跟蹤了24小時才顯示完全吸收(圖8)。
實施例13其他蒽環類的加載制備4個1ml水合的高AMPS微球(900-1200μm)裝入一個8ml玻璃容器的樣品。用10ml玻璃量筒量取1ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中的微球，并將其轉移到一個玻璃容器內。然后，用巴斯德玻璃吸管移出每個樣品中的所有PBS。加載溶液如下制備將1個小瓶中的20mg柔紅霉素(Beacon Pharmaceuticals)用1ml水(ROMIL)復原，達到終濃度20mg/ml。將1個小瓶中的50mg表柔比星速溶液(Pharmacia)用2.5ml水復原，達到終濃度20mg/ml。制備20mg/ml阿霉素(DaburOncology)溶液以和前面的樣品相比較。制備后立即測定溶液在483nm處的紫外吸收，并制備稀釋液以制作每種藥物溶液的標準曲線。
取1ml每種加載溶液和1ml水(作為對照)加入每個裝有1ml如上所述制備的微球的小瓶中，并開始計時。整個實驗中小瓶都放置在滾動混勻器上。在預定的時間點(0、10、20、30、45和60分鐘)取出50μl，按需要進行稀釋并在483nm處讀數。由這些讀數，根據每種情況下的相應標準曲線來計算每個時間點的溶液濃度。加載到微球中的藥物量通過用該裝置提取時溶液中藥物的減少來測定。由這些數據計算每1ml水合微球載藥的mg數并做圖(圖9)。這表明被測試的蒽環類均以相同的方式加載。
實施例14其他蒽環類的洗脫用如實施例13所述載藥的微球確定藥物釋放形式。每種類型的載藥微球取1ml轉移到裝有100ml PBS的棕色玻璃容器中并開始計時。在整個實驗中容器置于37℃水浴中。在預定的時間點(0、0.16、0.5、1、2和72小時)取出1ml溶液，讀數后放回容器中，這樣使體積保持恒定。樣品在483nm處讀數，并由實施例12所確定的各個蒽環類的標準曲線的方程式計算濃度。由這些數據計算每1ml微球中洗脫出的藥物的mg數并做圖(圖10+11)。這表明所研究的蒽環類從微球上0洗脫時具有相同的洗脫形式。
實施例15蒽環類對微球大小的影響使用實施例13所述的微球，用CCD照相機和顯微鏡所拍攝的微球圖像確定大小分布，然后用Image Pro Plus 4.05辨別其直徑。將加載了不同蒽環類的微球轉移到小細胞培養瓶中，每張圖像拍攝50-1500個微球。Image Pro Plus 4.05根據大小范圍辨別100-1500個微球的直徑。將直徑列表并轉換成大小范圍對出現頻率的柱形圖，將其標準化并用Excel做圖(圖12)。這表明蒽環類對微球大小具有相同的影響。
實施例16其他市售微球的載藥按照前面實施例中概述的步驟，將阿霉素加載到本發明的微球和另一種市售栓塞微球(Embosphere，包覆有膠原包衣的三丙烯酰微球)中，并對其進行比較。顯然，由圖15可見，本發明的微球具有吸收藥物的能力，而標準的市售產品則沒有。
實施例17載藥-物理效應通過測定藥物加載和洗脫后的大小和壓縮及阿霉素載藥微球的釋放能力，評估阿霉素的加載和洗脫對高AMPS微球的影響。當藥物有效地從水合微球上取代水時，藥物的加載使整體大小范圍少許下降(圖14)，這同時伴隨著可壓縮性的少許下降。洗脫后觀察到大小和可壓縮性都未受到持久的影響(如通過用Instron拉伸試驗儀測定楊氏模量所確定的)。微球通過標準導管釋放的能力在載藥過程中保持不變。
實施例18洗脫-微球大小的影響用70mg/ml阿霉素溶液加載本發明的各種大小的微球。然后將微球放入500ml磷酸鹽緩沖液中，紫外測定釋放量。體外洗脫圖顯示高至40％加載的阿霉素在洗脫的最初2小時以突釋的形式釋放，然后剩余的藥物在至少12天時間內洗脫。所有大小范圍的釋放均具有相似的特征，相差在±5％以內(圖15)。
實施例19洗脫-介質的影響將本發明的載有25mg/ml阿霉素的微球放置于不同的介質中并在60分鐘內監測洗脫。在血漿和PBS中顯示在最初的60分鐘內釋放緩慢。水中的釋放低于紫外檢測限。這說明藥物的釋放取決于離子的存在，因為這樣才能從帶有陰離子電荷的聚合物基質上置換出離子鍵結合的藥物(圖16)。
實施例20阿霉素的穩定性測定加載和釋放過程對藥物穩定性的影響。測定了阿霉素溶液在不同條件下保存時的穩定性。用USP方法通過HPLC跟蹤本發明的微球中阿霉素的加載和釋放，以確定阿霉素是否受到該過程的影響。產生的色譜圖均在相似的保留時間出現單峰，顯示微球加載和釋放的過程對阿霉素沒有任何不利的影響。
實施例21阿霉素加載的微球-材料相容性本發明的微球用25mg/ml阿霉素加載。然后將微球懸浮于造影劑和鹽水中，然后在釋放導管(ProgreatTM，Terumo)和注射器(Merit)中放置24小時。在不同的時間點，測定阿霉素和各組分的穩定性(阿霉素用紫外/HPLC法，組分用肉眼觀察/SEM法)。在室溫下24小時內未觀察到組分或藥物的降解。
實施例22預載產品-加載劑量在本發明微球的大小范圍內制備系列劑量為5、10、20、45mg/ml的樣品。每個樣品的載藥量由紫外檢測法測定。25個獨立試驗的數據列于下表表1加載溶液紫外檢測測得的實際劑量
測得的劑量范圍是45mg/ml44.37-45.77mg/ml(3.11％范圍)20mg/ml21.11-21.32mg/ml(1.05％范圍)10mg/ml9.93-9.98mg/ml(0.5％范圍)5mg/ml4.98-5.14mg/ml(3.2％范圍)這些數據表明，在不同試驗之間幾乎沒有差異，可以達到精確而準確的載藥量。
實施例23預載產品-凍干失重對本發明中的阿霉素加載的微球用一種專用循環進行凍干。所有大小范圍的微球以25個獨立試驗測定劑量為5、10、20、45mg/ml時的失重百分數(以載藥微球的百分數表示，表2)。得到了一致的失重量，表明凍干前載藥微球的任何重量變化對凍干后的產品都沒有影響。圖17的數據顯示凍干時由于失水總是導致大于82％的失重。
表2阿霉素載藥微球在凍干時的失重
實施例24預載產品-殘留水分制備用5、10、20、45mg/ml的阿霉素加載的所有大小范圍的本發明微球，凍干，然后用伽馬射線滅菌。然后用重量法測定樣品中殘留的水分，包括在70℃加熱微球至達到恒重。測得所有樣品中殘留的水分少于5％。
表3
實施例25預載產品-重新水合后釋放制備用5、20、45mg/ml的阿霉素加載的所有大小范圍的本發明微球，凍干，然后用伽馬射線處理。然后使樣品在水中重新水合，紫外跟蹤藥物在PBS中的釋放100小時(圖18)。
實施例26重新水合的阿霉素載藥微球的大小制備用20mg/ml阿霉素加載的本發明微球(300-500μm)，凍干，然后對部分樣品進行伽馬射線處理。樣品在水中重新水合，然后用校準的圖像分析儀(Image Pro-Plus，圖19)測定大小。
未載藥的樣品也同樣進行處理和測定大小。圖20的數據顯示進行不同的處理后大小略有變化，但是均未使產品超出250-500μm的合格范圍。
實施例27兔肝癌模型(Vx-2)中經導管動脈化學栓塞后阿霉素從阿霉素載藥微球中持續釋放本研究的目的是為了評估在兔肝癌模型中通過經導管動脈化學栓塞(TACE)釋放的本發明的阿霉素載藥微球的性能。該研究在美國巴爾的摩的約翰·霍普金斯醫院(The John Hopkins Hospital)進行。
27.1材料與方法將動物分成6組(第1、2、3、4、5、6組)，每組5只(實驗動物4只，對照動物1只)。所有組的對照動物都動脈內注射阿霉素(與實驗動物濃度相同)，而實驗動物按照經修改的化學栓塞方案用含有阿霉素的藥物洗脫微球處理。不同組的動物在以下時間點處死第1組化學栓塞操作后1小時第2組化學栓塞操作后12小時第3組化學栓塞操作后24小時第4組化學栓塞操作后3天第5組化學栓塞操作后7天第6組化學栓塞操作后14天27.2動物的準備將VX2腫瘤細胞系注射到載體兔(新西蘭白兔)的后腿并生長培養14天。從每一只載體兔上體內收集產生的腫瘤，并通過對每只兔解剖活體腫瘤組織、，無菌切割切碎和通經過不銹鋼濾網篩，從每只兔來制備腫瘤漿。兔子預先肌內給予乙酰丙嗪(1mg/kg)和鹽酸氯胺酮(20mg/kg)的混合物將兔預麻醉。大約15分鐘后，經耳緣靜脈做靜脈入口，并靜脈給予動物硫噴妥鈉(40mg/kg)，以在手術過程中保持麻醉狀態。刮去腹部的毛，用聯苯胺備皮并做一個中線切口。通過中間正中剖腹暴露每只兔的肝臟，然后用21G靜脈血管穿刺針(angiocath)直接注射一份腫瘤漿液(0.2ml)至暴露的肝臟的左葉以形成周圍有足夠肝實質的唯一的孤立損傷。每兩只實驗兔用一份腫瘤漿。使腫瘤在兔肝中生長14天，使其大小達到根據以前的實驗所預期的直徑在2.5-3.5cm范圍的大小。用電灼燒控制出血。然后將腹部用running縫連續縫線縫合和關閉，皮膚用縫線和紗布縫和合并用繃帶包扎。整個操作中均采用適當的無菌技術。手術后，將動物放入籠子中，用毛毯保暖并進行潮氣末CO2濃度監測，直至動物從麻醉中蘇醒。如果動物明顯出現疼痛或身體上的痛苦，皮下給予0.02-0.05mg/kg止痛劑似普羅啡，每12小時一次，連續3天。
27.3阿霉素洗脫微球的制備按實施例22制備本發明的大小范圍在100-300微米并用45mg/ml阿霉素加載的微球，按實施例23凍干并用伽馬射線滅菌。在臨使用前將微球用1ml無菌水水合，并加入2ml歐乃派克和1ml鹽水。溶液在要注射前至少10分鐘準備好，每只兔動脈注射總溶液中的1ml(如下所述)。
27.4化學栓塞操作腫瘤移植入兔肝臟兩周后，將動物取回做“化學栓塞”。按上述進行預麻醉、做靜脈入口、用硫噴妥鈉麻醉。做進入股總動脈的入口，然后將一個導管插入肝總動脈。注射造影劑證實腫瘤所在的位置后，插入一個2F JB1導管使其盡可能接近腫瘤。如果需要，周Transsend導絲將導管引導至靶動脈。一旦導管被適當定位，立即如上所述將阿霉素洗脫微球注射到腫瘤床內。對照組只注射相同濃度的阿霉素，而不進行栓塞操作。完成“化學栓塞”后，移出導管，動脈用可被重吸收的縫合材料結扎來止血。整個操作及后續操作中均采用適當的無菌技術。盡所有可能盡量減小不適和痛苦，包括限制腫瘤移植的手術切口，皮下注射似普羅啡以盡量減輕疼痛，在需要評估動物的身體狀況及疼痛和不適水平時隨時臨床呼叫。然后將動物放回籠子。所有動物依照上述時間點處死。
按照獸醫管理規則處死動物。各組中的所有動物在處理后按照其時間點在通過靜脈注射100mg/kg戊硫代巴比妥IV所致的深度麻醉狀態下處死。
27.5病理學和組織學評價剖出兔的肝臟，小心摘除并放置在裝有5％甲醛的容器中。將肝臟以5mm的間距切片以用于肉眼檢查。每一個切片都用石蠟完全包埋，然后切成4μ厚的切片并用蘇木精合伊紅染色處理。通過肉眼觀察估計腫瘤存活率，并以每張切片上活腫瘤面積的百分率表示。用HPLC測定腫瘤中和無腫瘤肝組織中阿霉素的濃度。
27.6采集血液以進行阿霉素分析通過在耳中插入動脈導管，從注射藥物洗脫微球時開始，分別在20分、40分、60分、120分和180分時采集3ml全血，然后轉移到加有肝素的真空管中，并在室溫下2000g離心10分鐘。分離出血漿并將其移到標記的聚丙烯帶蓋管中。使其在甲醇/冰中迅速凍結，于-20℃保存以供進行分析。
27.7對組織進行處理以確定腫瘤中和無腫瘤肝組織中阿霉素的濃度切下腫瘤和無腫瘤肝組織(約100mg)并除去上面的表皮和死細胞。使用預先稱重的試管準確稱量組織的重量并記錄，然后立即將其放到干冰上，而后于-80℃保存以供進行分析。
27.8結果藥物分布總結1.阿霉素在腫瘤中的濃度在治療后7天達到最高，其次是3天組(圖20)。
2.阿霉素在腫瘤中的濃度甚至在14天組中仍然很高，表明阿霉素是從微球中連續洗脫的(圖20)。
3.所有時間點阿霉素及其降解產物阿霉素醇(doxorubicinol)在血漿中的濃度很低。這在給藥后20分鐘特別顯著，而且阿霉素在血漿中的濃度在20-180分鐘幾乎以線性持續下降。當動脈注射無微球的阿霉素時，血漿中阿霉素的濃度高10-17倍(圖21)。
組織學觀察1.在7-14天腫瘤壞死最大(圖22)。
2.注意1小時組和12小時組可視為對照組，因為化學栓塞劑還未開始殺滅細胞。
3.最后，在3天和7天組中分別有50％和37％的腫瘤細胞既不是完全死亡也不是完全存活。這些細胞可能“受損”，甚至可能凋亡。
4.關于微球的分布，和預期的一樣，對照動物中均未發現任何微球。在實驗動物中，發現所有的微球都保留在具有預期的血管直徑即100-300微米的小動脈中。沒有任何微球逃離血管內空間。
5.在14天組中，腫瘤植入位置即肝組織左側似乎大部分已壞死。壞死的腫瘤和正常細胞的差別很難確定。因此，我們可以推測藥物洗脫微球的效力在14天后已達到最大。這些結果是一致的。
6.組織學分析也證實了藥物洗脫微球殺滅腫瘤細胞的效力。我們從前面的多組實驗了解到，動脈內注射阿霉素或卡鉑(濃度相同)僅導致30％的腫瘤壞死，這與未治療(即對照)動物大致相等。相反，用藥物洗脫微球對兔進行治療導致50-100％的壞死，壞死在14天最為完全，顯著高于單獨動脈內注射(圖22)。
實施例28臨床試驗用根據實施例9制備的微球漿進行臨床試驗，以評價其在用于對不能切除的肝細胞腫瘤(HCC)患者進行治療的安全性、藥物動力學形式和效力。適合本研究的患者年齡在18-75歲，患有不宜進行根除治療如切除術、肝移植、經皮治療的HCC，具有良好的肝功能(Child-PughA型)，沒有任何肝失代償。排除以下患者a)以前曾經用任何抗癌療法治療HCC的患者；b)患有另一種原發性腫瘤的患者；c)患有重度肝臟疾病的患者Child-Pugh B-C型或活動性胃腸出血、腦病或腹水。膽紅素水平＞3mg/dL；d)患有癌性疾病的患者C型BCLC(血管侵襲，包括節段性門靜脈阻塞；肝外擴散或癌癥相關癥狀＝PST為1-4)或D型BCLC(WHO體能狀況3或4，Okuda III期)；e)患有任何肝臟栓塞手術禁忌癥的患者門體分流、離肝血流、凝血實驗異常(血小板計數＜50.000/mm3或凝血酶原活性＜50％)、腎衰、嚴重動脈粥樣硬化；
f)患有阿霉素給藥禁忌癥的患者(血清膽紅素≥5mg/dL，白細胞計數≤3.000細胞/mm3，心臟射血分數＜50％)。
化學栓塞在0時和第2月進行。治療將由于任何排除標準的形成或由患者決定而中止。通過注射在臨給藥前與造影劑混合的阿霉素載藥微球進行栓塞，直至達到流動停滯。PVA微球的直徑由外科醫師來選擇，其大小可能為500μm左右。不使用抗生素預防。
為了分析阿霉素微球的藥物代謝動力學形式，對膽紅素水平＜1.5mg/dL的患者，以以下劑量開始給予按比例增大的劑量每次治療25mg/m2(2個患者)、50mg/m2(2個患者)、75mg/m2(2個患者)、100mg/m2(2個患者)。對膽紅素水平在1.5-3mg/dL的患者以以下劑量開始25mg/m2(2個患者)、50mg/m2(2個患者)、75mg/m2(2個患者)、100mg/m2(2個患者)。如果在某個劑量水平沒有觀察到任何劑量限制性毒性，則在下一組按比例增加劑量，單次治療中阿霉素的最大總劑量是150mg。
藥物代謝動力學評價在操作之后的1小時、6小時、24小時、48小時和7天，在患者住院期間或在門診部，從外周血中采集樣本進行阿霉素水平分析。
安全性在6個月的整個研究過程中記錄并分析與治療相關的并發癥。在第0月和第2月的住院期(4天)記錄不良反應事件。在第7天、第14天和第1、3和6月，在門診部對患者進行回訪，對其進行臨床檢查并測定實驗室參數。開始治療后所有回訪中都會發現不良反應事件，其中包括骨髓抑制和其他與阿霉素相關的毒性的出現、肝功能衰竭、腎功能衰竭、感染(膽囊炎、肝腫大、自發性細菌性腹膜炎、菌血癥、缺血性肝炎或膽道狹窄)、胃腸道出血。
療效在第3和6月通過造影劑強化的螺旋斷層攝影術評價客觀反應。其幅度根據歐洲肝臟研究協會統一標準定義完全反應無癌性疾病跡象；部分反應腫瘤總量下降＞50％；無變化下降＜50％或增加＜25％；進行性疾病增加＞25％。因此，客觀反應反映了完全反應和部分反應。
權利要求
1.一種組合物，該組合物包含具有一種遇水可膨脹但不溶于水的聚合物基質和一種吸收在該基質中的水溶性治療劑的粒子，其特征在于所述聚合物在pH6-8范圍內總體帶有負電荷，當所述粒子在水中膨脹達到平衡時，其粒子大小在40-1500μm之間，所述治療劑為至少帶有一個氨基的蒽環類化合物。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述聚合物是共價交聯的。
3.根據權利要求1或2的組合物，其中所述聚合物包含交聯的聚乙烯醇。
4.根據權利要求3的組合物，該組合物通過每個分子含有至少兩個烯鍵不飽和側鏈基團的聚乙烯醇大分子單體和包括陰離子單體的烯鍵不飽和單體共聚合形成。
5.根據權利要求4的組合物，其中所述陰離子單體具有通式IY1BQ其中Y1選自 CH2＝C(R)-CH2-O-，CH2＝C(R)-CH2OC(O)-，CH2＝C(R)OC(O)-，CH2＝C(R)CH2＝C(R)CH2OC(O)N(R1)-，R2OOCCR＝CRC(O)-O-，RCH＝CHC(O)O-，RCH＝C(COOR2)CH2-C(O)-O-， 和 其中R是氫或者C1-C4烷基；R1是氫或者C1-C4烷基；R2是氫或者C1-4烷基或者BQ，其中B和Q定義如下；A是-O-或者-NR1-；K1是基團-(CH2)rOC(O)-、-(CH2)rC(O)O-、-(CH2)rOC(O)O-、-(CH2)rNR3-、-(CH2)rNR3C(O)-、-(CH2)rC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)O-、-(CH2)rOC(O)NR3-、-(CH2)rNR3C(O)NR3-(其中，基團R3相同或不同)、-(CH2)rO-、-(CH2)rSO3-、或任選與B1結合而形成一個共價鍵，r為1到12，R3是氫或C1-C4烷基；B是直鏈或支鏈烷二基、氧亞烷基、烷二基氧烷二基或烷二基低聚(氧烷二基)鏈，該鏈任選包含一個或更多個氟原子，直到形成全氟取代鏈；或者，如果Q或Y1包含一個與B鍵接的末端碳原子，是一個共價鍵；Q是一個陰離子基團。
6.根據權利要求5的組合物，其中Y1是CH2＝CRCOA，其中R是H或甲基，A是NH，其中B是C1-12烷二基。
7.根據權利要求5的組合物，其中Q是羧酸鹽、碳酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、膦酸鹽或磷酸鹽基團，優選磺酸鹽基團。
8.根據權利要求3-7中任一項的組合物，其中PVA大分子單體具有1,000-500,000D范圍的平均分子量，優選在10,000-100,000D范圍。
9.根據權利要求3-8中任一項的組合物，其中烯基側鏈基團通過環狀縮醛鍵與相鄰羥基的氧原子連接，所述環狀縮醛鍵優選通過N-(烷基)丙烯酰氨基取代的醛的反應形成，通常為二烷基縮醛形式，優選N-丙烯酰氨基乙醛二甲基縮醛。
10.根據前面任一權利要求的組合物，其中所述蒽環類化合物是具有通式II的化合物 優選阿霉素。
11.根據前面任一權利要求的組合物，其中所述粒子是微球。
12.根據前面任一權利要求的組合物，其中所述粒子膨脹并懸浮于水性液體中。
13.根據權利要求12的組合物，該組合物進一步包含一種成像劑，優選造影劑。
14.根據權利要求1-11中任一項的組合物，其中所述粒子為可泵送的漿液形式，所述漿液包含在水性液體中膨脹的粒子，且基本上不含粒子外液體。
15.根據權利要求14的組合物，該組合物裝在一個滅菌儲存容器，優選注射器中。
16.根據權利要求1-11中任一項的組合物，該組合物是基本干燥的。
17.一種蒽環化合物在制備用于對實體瘤進行栓塞治療的根據任意前述權利要求的組合物中的用途。
18.一種根據權利要求1-16中任一項的組合物的生產方法，其中在水存在下，使一種遇水可膨脹但不溶于水的聚合物的微粒與一種蒽環類化合物的溶液接觸，藉此將蒽環類化合物吸收入聚合物基質中。
19.根據權利要求18的方法，其中所述接觸通過將聚合物粒子懸浮在蒽環類化合物的水溶液中進行。
20.根據權利要求19的方法，其中基質中吸收有蒽環類化合物的聚合物粒子從懸浮液中回收并干燥，優選通過冷凍干燥法干燥。
21.根據權利要求19的方法，其中將膨脹聚合物的粒子與上清液分離并于仍然被膨脹液膨脹時轉移到優選為注射器的儲存容器中，并在該容器中滅菌和保存。
22.一種蒽環化合物在制備用于對實體瘤進行栓塞治療的組合物中的用途，在此治療中所述蒽環化合物從一種聚合物基質中釋放，所述聚合物基質是由每個分子帶有至少兩個烯鍵不飽和側鏈基團的聚乙烯醇大分子單體和一種烯鍵不飽和陰離子單體共聚合形成的。
23.根據權利要求22的應用，其中通過向患者的循環系統中引入含有大分子單體和單體的液體組合物并引發聚合，在患者的脈管系統中原位形成聚合物基質。
24.治療方法，其中使根據權利要求1-12和14-16中任一項的組合物與一種造影劑混合，然后在患者的血管中給予該混合物以栓塞實體瘤。
25.治療方法，其中在患者的血管中給予根據權利要求13的組合物以栓塞實體瘤。
26.根據權利要求24或25的方法，其中腫瘤是肝細胞癌。
全文摘要
一種用于實體瘤的化學栓塞治療的組合物，該組合物包含具有遇水可膨脹但不溶于水的合成陰離子聚合物的粒子和吸收在其中的蒽環類化合物。適宜的聚合物為以聚乙烯醇為基礎的聚合物，適宜的藥物為阿霉素。
文檔編號A61K31/704GK1747721SQ200480004062
公開日2006年3月15日 申請日期2004年2月12日 優先權日2003年2月12日
發明者A·L·劉易斯, P·W·斯特拉福德, S·W·萊帕德, B·霍爾, M·V·岡薩雷斯福哈多, P·加西亞 申請人:生物相容英國有限公司