與顱內動脈瘤相關的微小rna的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，設及miR-193b在診治煩內動脈瘤中的用途。
【背景技術】
[0002] 煩內動脈瘤（IntracranialAneu巧sm)是指多種因素造成的煩內動脈壁結構破 壞，進而導致的動脈壁異常膨出。煩內動脈瘤發病率較高，尸體解剖檢出率約為1-5%。煩 內動脈瘤破裂出血后30天的死亡率達45%，存活者中30 %存在不同程度的殘疾，嚴重威脅 人類的生命健康。然而，關于煩內動脈瘤的發病機制并不明確，其可能與遺傳、高血壓、血流 動力學、獲得性血管壁損傷有關。
[0003] 微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類長約19至23個核巧酸的非編碼單鏈小 核糖核酸分子。它們在進化上高度保守，并與動物的許多正常生理活動，如生物個體發育、 組織分化、細胞調亡W及能量代謝等密切相關，同時也與許多疾病的發生及發展存在著緊 密的聯系。最近的研究發現慢性淋己細胞性白血病W及Burkitt淋己瘤中的幾種微小核糖 核酸的表達水平均有不同程度的下調（Xawrie CH，Gal S，Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol2008;141 :672-675);分析比較人肺癌、乳腺癌組 織中的微小核糖核酸表達時，發現有若干組織特異性微小核糖核酸的表達水平相對于正常 組織發生了變化（Garofalo M，如intavalle C，Di Leva G etal.MicroRNA si即atures of TRAIL resist曰nee in human non-sm曰11 cell lung c曰ncer. Oncogene 2008)〇也有石開究 證明微小核糖核酸影響了屯、肌肥厚、屯、衰、動脈粥樣硬化等屯、血管疾病的發生和發展，并且 與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關聯燈巧ndyak VP，Ross SA，Beland
[0004] FA, Pogribny IP. Down-regulationof the microRNAs miR-；34a，miR-127，and miR-200b in rat liver during hep曰tocarcinogenesis induced by曰methyl-deficient diet. Mol Carcinog. 2008 0ct21)。運些實驗結果提示微小核糖核酸表達及特異性變化與 疾病發生和發展之間存在著必然聯系。 陽0化]由于微小核糖核酸在基因轉錄后的表達調控中起著超乎想象的重要作用，因此它 與疾病存在W下的關聯性：首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，運是因為疾病的抑制 因子W及促進因子都可能是微小核糖核酸的祀位點，當微小核糖核酸本身先發生了素亂表 達，比如本來抑制疾病促進因子的微小核糖核酸表達量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表達量升高了，其最終結果都會導致下游一系列基因表達的變化W及某些通 路的整體素亂，進而誘發疾病發生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結果，運是 因為當疾病（如癌癥）發生時，會導致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇 烈擴增，若微小核糖核酸正好位于運一變化區段內，那么其表達量將發生極其顯著的變化。
[0006] 因此，理論上微小核糖核酸分子完全可W作為一類新的疾病標記物，它的特異性 變化必然與疾病產生發展相關聯。同時微小核糖核酸還可W作為潛在的藥物作用祀點，通 過抑制疾病過程中上調的微小核糖核酸或過表達下調的微小核糖核酸，將有可能極大地緩 解疾病的發生和發展。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的之一在于提供一種可用于早期診斷煩內動脈瘤的微小RNA標記物。
[0008] 本發明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0009] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0010] 本發明提供了一種微小RNA在制備煩內動脈瘤診斷工具中的應用，所述微小RNA 選自W下組：初始miRNA、前體miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人細胞內被剪切并表 達成成熟miRNA;前體miRNA能在人細胞內被剪切并表達成成熟miRNA;所述微小RNA是 miR-193b。
[0011] 應當知道，本發明的微小RNA包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，盡管它們通過核巧酸殘基的缺失、置換或者插入而突 變。
[0012] 本領域人員應該了解，為了保證微小RNA的穩定性，可W在微小RNA的一端或者兩 端增加保護性堿基，如TT，也可對微小RNA堿基進行修飾，但是上述修飾不影響微小RNA的 功能。因此，本領域技術人員熟知，在不影響miR-193b功能的條件下，對miR-193b進行堿 基修飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發明的保護范圍之內。
[0013] 在本發明的一些具體的實施方式中，所述miR-193b是成熟miR-193b。
[0014] 雖然在某些【具體實施方式】中所使用的是成熟miRNA,但是本領域技術人員可W預 期，初始miRNA、前體miRNA將可W獲得與成熟miRNA同樣的技術效果，因為細胞有能力進一 步將初始miRNA、前體miRNA加工為成熟miRNA。
[0015] 本發明的微小RNA核酸分子可單鏈或雙鏈的形式存在。成熟miRNA主要呈單 鏈形式，而前體miRNA是部分自互補的，W形成雙鏈結構。本發明的核酸分子可W是RNA、 DNA、PNA、LNA的形式。
[0016] 進一步，上述診斷工具包括但不限于，忍片、試劑盒、試紙、高通量測序平臺。所述 診斷工具包括用于檢測miR-193b的表達水平的試劑。
[0017] 進一步，所述試劑盒包括針對miR-193b的引物和/或探針；所述忍片包括固相載 體；W及固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應于 miR-193b的部分或全部序列；所述試紙包括針對miR-193b的引物和/或探針；所述高通量 測序平臺包括針對miR-193b的引物和/或探針。
[0018] 本發明提供了一種煩內動脈瘤的診斷工具，所述診斷工具包括檢測miR-193b表 達水平的試劑。
[0019] 進一步，所述診斷工具包括試劑盒、忍片、試紙、高通量測序平臺。
[0020] 進一步，所述試劑盒包括針對miR-193b的引物和/或探針；所述忍片包括固相載 體；W及固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應于 miR-193b的部分或全部序列；所述試紙包括針對miR-193b的引物和/或探針；所述高通量 測序平臺包括針對miR-193b的引物和/或探針。
[0021] 進一步，所述試劑盒中的針對miR-193b的引物和/或探針還可包括針對現有技術 中已經報道的可用于檢測前面所述的微小RNA表達水平的引物和/或探針。將多種微小 RNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種微小RNA指標聯合診斷煩內 動脈瘤的情況也包含在本發明的保護范圍之內。
[0022] 進一步，所述忍片上固定的所述寡核巧酸探針還可包括針對現有技術中已經報道 的可用于檢測miR-193b的表達水平的寡核巧酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同 一忍片上通過檢測多種miRNA指標聯合診斷煩內動脈瘤也包含在本發明的保護范圍之內。
[0023] 進一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因忍片領域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經活性基團（如醒基、氨基等）修飾的玻片或娃片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0024] 所述的miRNA忍片的制備可采用本領域已知的生物忍片的常規制造方法，例如， 如果固相載體采用的是修飾玻片或娃片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡 核巧酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或娃片上，排列成預定的序 列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發明的miRNA忍片。如果核酸不含氨 基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》； J.L.erisi,V.R.Iyer,P. 0.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolof geneexpressiononagenomicscale.Science, 1997 ;278 :680和馬立人，蔣中華主編.生 物忍片.北京：化學工業出版社，2000,1-130。 陽0巧]本發明的miR-193b可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達miR-193b的DM片段的載體轉染細胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。
[0026] 病毒載體可W是任何適當的載體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、瘤疹病毒（例如