一種診治顱內動脈瘤的分子標志物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地涉及人DMBXl基因在顱內動脈瘤的診斷、治療 中的用途。
【背景技術】
[0002] 顱內動脈瘤又叫做腦動脈血管瘤，是指腦動脈內腔的局限性異常擴大造成動脈壁 的一種瘤狀突出。顱內動脈瘤多因腦動脈管壁局部的先天性缺陷和腔內壓力增高的基礎上 引起囊性膨出，是造成蛛網膜下腔出血的首位病因。過去人們稱之為先天性腦動脈瘤，事實 上先天性腦動脈瘤占腦動脈瘤的70%~80%。由于病程隱匿，起病突然，一旦發病，死、殘 率極高，因而被稱為顱內的"不定時炸彈"，是最危險的腦血管病之一。在腦血管意外中，僅 次于腦血栓和高血壓腦出血，位居第三。由于該病的年發病率高達1~2/10000,我國每年 新增動脈瘤患者多達20萬，顱內動脈瘤是威脅人類生命和健康的最常見的重大疾病。
[0003]目前關于顱內動脈瘤的形成和破裂的具體機制還不完全清楚，故在動脈瘤破裂之 前尚無有效的篩選方法和令人滿意的防治措施。在分子水平探討顱內動脈瘤的發病機制， 將有助于人們發現動脈瘤的早期診斷的分子標記物，為顱內動脈瘤的防治提供新的分子靶 點。

【發明內容】

[0004] 為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可用于顱內動脈瘤早期診 斷的分子標志物。相比傳統的顱內動脈瘤的診斷方法，使用基因標志物來診斷顱內動脈瘤 的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高 低，采取相應的預防和治療措施。
[0005] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0006] 本發明提供了檢測DMBXl基因表達的產品在制備診斷顱內動脈瘤的工具中的應 用。
[0007] 進一步，所述檢測DMBXl基因表達的產品包括檢測DMBXl基因 mRNA水平的產品、 和/或檢測DMBXl蛋白水平的產品。
[0008] 進一步，所述檢測DMBXl基因表達的產品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 測、原位雜交或芯片檢測DMBXl基因表達以診斷顱內動脈瘤的產品。
[0009] 進一步，所述用RT-PCR診斷顱內動脈瘤的產品至少包括一對特異擴增DMBXl基因 的引物；所述用實時定量PCR診斷顱內動脈瘤的產品至少包括一對特異擴增DMBXl基因的 引物；所述用免疫檢測診斷顱內動脈瘤的產品包括：與DMBXl蛋白特異性結合的抗體；所述 用原位雜交診斷顱內動脈瘤的產品包括：與DMBXl基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯 片診斷顱內動脈瘤的產品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與DMBXl蛋白特 異性結合的抗體，基因芯片包括與DMBXl基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 所述用實時定量PCR診斷顱內動脈瘤的產品至少包括的一對特異擴增DMBXl基因 的引物如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
[0011] 所述檢測DMBXl基因表達的產品可以是檢測DMBXl基因表達的試劑、也可以是包 含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。
[0012] 所述診斷顱內動脈瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平 臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷顱內動脈瘤的工具，隨著高通量測序技術的發展，對 一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因 表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知DMBXl基因的 異常與顱內動脈瘤相關也屬于DMBXl基因的用途，同樣在本發明的保護范圍之內。
[0013] 本發明還提供了一種診斷顱內動脈瘤的工具，所述工具包括檢測DMBXl基因表達 的試劑；所述試劑包括檢測DMBXl基因 mRNA的引物和/或探針、和/或檢測DMBXl蛋白的 抗體。
[0014] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
[0015] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測DMBXl基因轉錄水平的針對 DMBXl基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質芯片包括固相載體以及固定在固相載體的DMBXl 蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括DMBXl基因在內的多個基因（例如，與顱 內動脈瘤相關的多個基因）的表達水平。所述蛋白質芯片可用于檢測包括DMBXl蛋白在內 的多個蛋白質（例如與顱內動脈瘤相關的多個蛋白質）的表達水平。通過將多個與顱內動 脈瘤的標志物同時檢測，可大大提高顱內動脈瘤診斷的準確率。
[0016] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測DMBXl基因轉錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括DMBXl蛋白 的特異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯 片方法檢測DMBXl基因表達水平過程中所需的試劑。優選度，所述試劑包括針對DMBXl基 因的引物和/或探針。根據DMBXl基因的核苷酸序列信息容易設計出可以用于檢測DMBXl 基因表達水平的引物和探針。
[0017] 所述試紙包括檢測DMBXl基因表達的試劑。
[0018] 所述高通量測序平臺包括檢測DMBXl基因表達的試劑。
[0019] 與DMBXl基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結 合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述 探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針 長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最 長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探 針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0020] 進一步，所述DMBXl蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述DMBXl 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與DMBXl蛋白的結合能力即可。用于蛋白質 水平的抗體的制備時本領域技術人員公知的，并且本發明可以使用任何方法來制備所述抗 體。
[0021] 在本發明的具體實施方案中，所述檢測DMBXl基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO. 3 和SEQ ID NO. 4所示的引物對。
[0022] 本發明還提供了 DMBXl基因和/或其表達產物的抑制劑在制備治療顱內動脈瘤的 藥物中的應用。所述抑制劑包括抑制DMBXl基因表達的試劑、和/或抑制DMBXl基因表達 產物的試劑。
[0023] 進一步，所述抑制DMBXl基因表達的試劑包括抑制基因轉錄的試劑、抑制基因翻 譯的試劑；所述抑制DMBXl基因表達產物的試劑包括抑制DMBXl基因 mRNA的試劑、抑制 DMBXl蛋白的試劑。所述抑制DMBXl基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩定性的試劑、抑制 mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制DMBXl蛋白的試劑包括抑制DMBXl蛋白穩定性的試劑、抑 制DMBXl蛋白活性的試劑、抑制DMBXl蛋白功能的試劑。
[0024] 進一步，抑制DMBXl基因 mRNA的試劑包括針對DMBXl基因 mRNA的雙鏈核糖核酸； 抑制DMBXl蛋白功能的試劑包括DMBXl抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制DMBXl蛋白功能的抗體。 所述抗體可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0025] 所述針對DMBXl基因 mRNA的雙鏈核糖核酸可以是siRNA。為了確保DMBXl基因能 夠被高效剔除或沉默，根據DMBXl基因的mRNA序列設計siRNA特異性片段。siRNA的設計根 據已發表的通用設計原則（Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003, Reynolds et.al 2004, Hsieh et.al 2004, Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完 成設計，該在線工具為：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004，//jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi DesignerofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research Award，//rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/) 〇 為了進一步提高 siRNA 片斷的 有效性，綜合兩個在線設計工具的優點來設計用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源性比 對（NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶 效應。
[0026] 本發明還提供了一種用于治療顱內動脈瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包括上 面所述的DMBXl基因和/或其表達產物的抑制劑。
[0027] 本發明的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，載體，這類載體包括（但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑季銨 化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣 和鎂、聚乙二醇等。
[0028] 本發明的藥物組合物還可與其他治療顱內動脈瘤的藥物聯用，多種藥物聯合使用 可以大大提到治療的成功率。
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