專利名稱：顱內動脈瘤液體栓塞劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種顱內動脈瘤液體栓塞劑及其制備方法。
二，背景技術顱內動脈瘤是神經外科常見疾病，死亡的主要原因為出血及早期并發癥[Hop JW等人，“Stroke”，第28卷，第660-664頁(1997年)]。以往治療的唯一方法是采用外科開顱手術夾閉動脈瘤。然而外科開顱手術的缺點十分明顯1，可接受手術患者比例有限或因年齡、健康不適合者，或多次SAH、HH分級偏高者，或有血管痙攣者，手術風險都極大；2，外科手術夾閉具有很大的盲區對于后循環或巨大動脈瘤等難以接近或完全無法進行夾閉；3，外科手術康復慢，復發率高，給患者帶來痛苦大。而近二十年來，隨著血管內介入治療的日趨成熟，越來越多的醫師開始選擇這種低風險，微創傷，并有效彌補手術治療盲區的新方法。至1992年為止，在歐洲國家80％的動脈瘤都已經不需要采用開顱手術而僅用介入栓塞治療[Vinuela等人，“Interventional Neuroradiology”，第63-75頁(1992年)]。
已經被用作介入治療的基本方法主要有三種可脫卸球囊，電解可脫卸彈簧圈(GDC)，和液體栓塞劑。最早被起用的球囊可以對一些難以手術夾閉的動脈瘤進行栓塞，但其缺陷也很明顯1，不能針對瘤形狀進行栓塞，易導致動脈瘤破裂；2，球囊易回縮，其內必須充填硅膠液或固化劑(HEMO)；3，球囊及輸送導管柔韌性差，難以操作。而目前已得到國內外臨床應用的GDC則具有兩個較大的技術性限制1，GDC壓縮與動脈瘤復發，并可引起腦實質或顱神經的壓迫癥狀，這在寬頸和大或巨大動脈瘤中更常出現；2，GDC金屬材料具有生物學惰性，瘤內血栓不易形成[張鑫等人，“介入放射學雜志”，第12卷第3期，第233-235頁(2003年)]。液體栓塞劑的治療原理是通過進入瘤腔與瘤腔的血液接觸，溶劑迅速彌散，栓塞物質在很短時間內凝聚成固體栓塞動脈瘤。相比起以上兩種方法，液體栓塞劑擁有易流動，易控制，生物相容性好等許多不可替代的優勢，合適液體栓塞材料的開發成為了介入放射學的前沿課題。
一種理想的液體栓塞劑應具備以下條件1，良好的生物相容性；2，能產生有效的血管栓塞并誘發血栓形成；3，無毒、無致畸、致癌作用；4，低濃度，低粘度，易控制，易通過不同規格的導管；5，在X線下可顯影；6，進入瘤腔后不向遠端漂移。近年來實驗及臨床使用的血管內液體栓塞材料品種繁多，報道較多的是氰基丙烯酸正丁酯(NBCA)、醋酸纖維素聚合物(cellulose acetate polymer，CAP)、聚丙烯氰(polyacrylonitrile，PAN)、乙烯和乙烯醇聚合物EVAL(ethylene vinyl copolymer)及EVOH(ethylene vinyl alcoholcopolymer)幾種。這些材料的應用缺點也很明顯如NBCA具有粘附性，易使微導管與血管粘連，每次栓塞病灶量少等缺點；傳統的CAP溶液沒有很好的解決控制瘤腔內遠端漂移的技術難題。目前最為成熟的液體栓塞劑ONYX，則是以次乙烯醇異分子聚合物(EVOH)、二甲亞砜溶劑和微粒化鉭粉三者組成的混合物。它有較強的聚合性，且基本不粘連導管，在國內外均有栓塞成功的病例報道。但ONYX本身同樣存在無法控制瘤腔內遠端漂移的問題，在已經臨床應用的進口產品中，則是采用了在動脈瘤頸口的載瘤動脈放置封堵球囊來解決，這樣既加大了成本，又在體內引入了新的異物。此外，ONYX不能應用于無法用球囊封閉的動脈瘤，而對于非常寬頸的動脈瘤時還要首先在瘤頸處放置支架治療，然后再放置球囊封堵瘤頸后注射，這都大大限制了該液體栓塞劑的應用范圍。[宋冬雷等人，“中國臨床神經科學”，第11卷4期，第383-386頁(2003年)]。
三，發明內容本發明所要解決的技術問題是公開一種用于顱內動脈瘤介入治療的液體栓塞劑，它包含有效栓塞成分為天然藥物白芨的多糖提取物與二醋酸纖維素聚合物，顯影成分為碘海醇，溶劑成分為二甲亞砜。
本發明涉及液體栓塞劑的制備方法。
本發明還涉及液體栓塞劑中顯影成分的處理方法。
有效栓塞成分之一的天然藥物白芨的多糖提取物來自蘭科植物白芨塊莖。有關研究表明，白芨多糖具有促進凝血與血栓形成，促進血管內皮生長，血管與消化道潰瘍愈合等作用。
本發明中兩種有效栓塞成分以混合物形式溶解于有機溶劑二甲亞砜中。
顯影成分碘海醇是對商品碘海醇注射液進行處理后得到。處理方法有兩種，一種是對商品碘海醇注射液進行冷凍干燥；另一種是對商品碘海醇注射液采用減壓蒸餾的方式濃縮。
本發明的液體栓塞劑的配制，包括以下步驟1，白芨多糖純品制備取天然藥物白芨，進行多糖組分初步抽提，并經過除蛋白，離子交換層析與凝膠過濾層析得到白芨多糖提取物純品；2，顯影成分制備將商品碘海醇注射液凍干，得碘海醇白色固體粉末；3，液體栓塞劑配制稱取配比范圍內的白芨多糖提取物與二醋酸纖維素，加熱條件下溶解于有機溶劑二甲亞砜，冷卻后加入顯影成分，溶解后冷藏備用。
本發明的成分優點是十分顯著的白芨多糖在栓塞劑里，一方面利用本身的粘性起到了栓塞作用；另一方面由于具備促凝血的生物特性，加速了血栓的形成；此外白芨多糖還具備促進血管內皮細胞生長的功能，一舉多得。二醋酸纖維素聚合物作為經典的液體栓塞材料，具有良好的栓塞效果。顯影成分經過處理后去除了商品碘海醇注射液里的水，避免了水對栓塞劑穩定性的破壞。
本發明所采取的配比是發明人進行大量實驗摸索總結得出的，各組分用量為在每16毫升二甲亞砜中，含天然藥物白芨的多糖提取物0.1-0.3克與二醋酸纖維素聚合物0.5-0.7克，及造影劑液態碘海醇4毫升或固態碘海醇2.0-2.5克。
優選在30℃-40℃下實施本發明。
本發明通過對栓塞條件的摸索，一方面，很好地解決了在無需球囊、支架等輔助材料情況下阻止遠端漂移，并在瘤腔范圍內形成有效栓塞與誘發血栓形成的技術難題；另一方面，栓塞成分中的天然藥物多糖提取物，具有極好的生物相容性和促血栓形成的作用。本發明滿足一款理想的液體栓塞劑應當具備的條件，達到了更好的栓塞效果和更高的安全性。
四，
圖1(a)為白芨多糖半純品經凝膠過濾層析得單一洗脫糖峰。
圖1(b)為白芨多糖純品紅外光譜圖。
圖2為DSA監視下的體外模型動脈瘤充盈液體的照片。
圖3為DSA監視下對體外模型動脈瘤進行插管栓塞。
圖4(a)和圖4(b)為體外栓塞結束后動脈瘤模型的外觀。
圖5(a)和圖5(b)為DSA監視下動物模型動脈瘤的照片。
圖6為對動物模型動脈瘤插管到位準備進行栓塞的X光照片。
圖7為對動物模型動脈瘤進行栓塞時的X光照片。
圖8(a)和圖8(b)為對動物模型動脈瘤栓塞結束退出導管，瘤腔栓塞充分，載瘤動脈暢通的X光照片。
五，具體實施方式
1液體栓塞劑的制備取市售中藥白芨，充分碾碎后水煮3小時，沸騰8-10次，三層紗布過濾取濾液，加入兩倍體積無水乙醇，沉淀過夜；離心棄去上清，反復三次后取沉淀抽濾，溶于雙蒸水，Sevag法沉淀蛋白雜質[Staub等人，“Carbohydr Chem”，第5卷第5頁(1965年)]，反復多次至考馬斯亮藍法檢測無蛋白；無水乙醚萃取，取水相凍干得白芨多糖粗品；粗品經DE-52離子交換柱(Whatman產品)層析，蒽酮-硫酸法檢測得單一洗脫峰，凍干得白芨多糖半純品；半純品經Sephadex G-200凝膠過濾柱(Pharmacia產品)層析，蒽酮-硫酸法檢測得單一洗脫峰，見圖1(a)。凍干得白芨多糖純品，紅外光譜檢測多糖組成為葡萄糖與甘露糖，見圖1(b)。
將商品碘海醇注射液凍干，得碘海醇白色固體粉末。在無菌操作條件下，稱取白芨多糖純品與二醋酸纖維素，水浴加熱并保持在55℃-65℃下，磁力攪拌使之完全溶解于有機溶劑二甲亞砜。冷卻至室溫，加入顯影成分碘海醇，再次攪拌，至透明均一溶液完全形成。由于液體栓塞劑的栓塞原理是接觸水相后，二甲亞砜迅速彌散，有效栓塞物質在很短時間內凝聚成固體，因此操作的整個過程避免栓塞劑與水或水相溶液接觸。
液體栓塞劑配制完畢后冷藏于4℃冰箱，使用前37℃水浴加熱10-15分鐘。
2液體栓塞劑的體外模型實驗(一)體外模型由三部分組成顱內載瘤動脈，動脈瘤與心臟。載瘤動脈由內徑為3mm的硅膠管模擬，動脈瘤由4mm的硅膠管所制球型腔體模擬，心臟的泵血功能由水泵模擬，“血管”內血液由生理鹽水模擬。載瘤動脈與動脈瘤嵌在薄木板上刻出的曲形溝槽內。
體外模型的搭建方法為首先剪取1.6cm長的內徑為4mm的硅膠管，用內徑5mm的鋼珠燒熱后放入使之膨脹，冷卻后將鋼珠從小段硅膠管的一頭取出，再將另一頭封口，成為瘤腔；在內徑為3mm的硅膠管上剪一小口，將瘤腔開口與之吻合粘連，但要留出導管入口。數分鐘后在管內通水檢漏。水泵提供管內生理鹽水保持流動的壓力，要求流速在280ml/min到320ml/min。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，二醋酸纖維素1.1克，不加白芨多糖提取物。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，注射液體栓塞劑，最初0.2-0.5ml栓塞劑可順利通過導管，之后推動緩慢，栓塞劑膠流動性不佳，有粘連導管的現象。繼續推動栓塞劑，在其接觸“血液”10-15秒后發生導管堵塞。
3液體栓塞劑的體外模型實驗(二)體外模型構建同實施例2。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，二醋酸纖維素0.4克，不加白芨多糖提取物。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，注射液體栓塞劑，可推動性與流動性佳，在其接觸“血液”后立即固化，被“血流”沖走而發生遠端漂移現象。
4液體栓塞劑的體外模型實驗(三)體外模型構建同實施例2。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，白芨多糖提取物0.3克，不加二醋酸纖維素。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，注射液體栓塞劑，可推動性與流動性佳，但在其接觸“血液”后不發生固化，立刻被“血流”沖走而發生遠端漂移現象。
5液體栓塞劑的體外模型實驗(四)體外模型構建同實施例2。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，白芨多糖提取物0.7克，不加二醋酸纖維素。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，注射液體栓塞劑，可推動性與流動性佳，但在其接觸“血液”后不發生固化，立刻被“血流”沖走而發生遠端漂移現象。
6液體栓塞劑的體外模型實驗(五)體外模型構建同實施例2。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，二醋酸纖維素純品0.4克，白芨多糖提取物0.1克。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，注射液體栓塞劑，可推動性與流動性佳，但在其接觸“血液”后立即發生固化，3-5s后被“血流”沖走而發生遠端漂移現象。
7液體栓塞劑的體外模型實驗(六)體外模型構建同實施例2。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，二醋酸纖維素純品0.8克，白芨多糖提取物0.3克。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，注射液體栓塞劑，最初推動緩慢，栓塞劑膠流動性不佳，粘連導管的現象明顯。很快發生導管堵塞。
8液體栓塞劑的體外模型實驗(七)體外模型構建同實施例2。
按照實施例1所述方法配制液體栓塞劑，各組分用量為每16毫升二甲亞砜中含碘海醇白色固體粉末2.4克，二醋酸纖維素純品0.6克，白芨多糖提取物0.1克。
在體外模型中進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，“血流”充盈“瘤腔”。注射液體栓塞劑，栓塞劑膠可推動性與流動性佳，接觸“血液”后于40s-50s時間內完全變白。
打開DSA數字減影造影監視，進行體外栓塞實驗。將1.5F導管插入瘤腔，開啟水流，測試速度為300ml/min，“血流”充盈“瘤腔”，見圖2。開始注射液體栓塞劑，顯影效果清晰，栓塞劑膠可推動性與流動性佳，接觸“血液”后于17s-24s時間內完全變白。見圖3。
總共栓塞二十例動脈瘤模型，每一例都在栓塞80％腔體后選擇退出微導管，退出過程迅速，均未發生導管口粘連、栓塞劑載瘤動脈遠端漂移或栓塞劑溢出至血管內的現象。栓塞完畢后關閉造影監視，觀察“瘤腔”充盈白色膠體，觸摸硬度適中，“瘤腔”口無絲狀殘留，見圖4(a)和圖4(b)。此結果表明，體外模型中本發明的栓塞效果是理想的。
9液體栓塞劑的動物體內血管瘤模型實驗實驗動物選取成年健康家兔兩只，體重分別為2.6，3.0kg，均為雄性。
方法采用靜脈移植法構建動物血管瘤模型，步驟如下取禁食6小時的家兔，耳緣靜脈注射1％的戊巴比妥(25mg/kg)使其全麻，采用自甲狀軟骨下緣到胸骨上緣的正中切口，顯露左側頸總靜脈，分離并截取一段1-2cm的靜脈，浸泡于肝素鹽水中備用。正中切開頸闊肌，顯露并分離兩側頸總動脈約3-4cm。左側頸總動脈遠端以臨時阻斷夾阻斷，近端結扎后切斷。在氣管后方形成隧道，將左側頸總動脈的近端的斷端通過隧道置于右側。右側頸總動脈近端和遠端暫時阻斷。放置手術顯微鏡，以無創縫合針線進行血管重建，進一步將靜脈袋吻合成直徑約7-9mm，瘤頸約4-6mm的頂端動脈瘤和側方動脈瘤兩種不同類型的動脈瘤模型。5-7天后進行造影評價。兩只兔共形成動脈瘤4個，其中頂端動脈瘤與側方動脈瘤各兩個，均形成良好。
為探索體內適用配方的最大范圍，按照實施例6方案配制栓塞劑。
栓塞手術前家兔禁食6小時，用氯胺酮15mg/ml和阿托品0.04mg/ml作為全麻前用藥，動物仰臥固定于手術臺，耳緣靜脈滴注1％的戊巴比妥(25mg/kg)保持全麻。進行造影，再次觀察動脈瘤模型，情況良好。一側腹股溝剪毛，消毒，分離皮下組織和肌肉后，暴露分離股動脈，穿刺股動脈前壁，將導絲與導管送入血管腔內。再次進行造影監視，將導絲導管沿動脈血管送至頸總動脈，尋找模型瘤腔入口并進入。拔出導絲，將微導管口穩定在瘤腔靠里3/4位置。開始以每分鐘0.2ml/min的推進速度注射液體栓塞劑。其中一只的頂端動脈瘤與側方動脈瘤在栓塞劑進入瘤腔后4-5秒鐘后，均發生栓塞膠被血流帶出瘤腔口并隨血流沖走的遠端飄溢現象，不宜繼續注射；另一只動物的側方動脈瘤也發生類似現象，但頂端動脈瘤栓塞良好，待瘤腔栓塞80％后選擇退出微導管，瘤腔開口處無殘留。隨后結扎，縫合。縫合完畢對后一只動物作影象觀察，發現其頂端動脈瘤仍然存在，其內充盈血液，并沒有栓塞膠存在。推測在微導管退出后，注射的膠也發生被血流沖走的現象。
10液體栓塞劑的動物體內血管瘤模型實驗實驗動物；選取成年健康家兔12只，體重2.5-3.5kg，均為雄性。隨機分為甲，乙，丙三組，每組均為4只，分別對應為栓塞后24小時，栓塞后1周與栓塞后2周。
方法按照實施例9的方法構建血管瘤模型，12只兔共形成動脈瘤30個，其中頂端動脈瘤11個，側方動脈瘤19個，均形成良好。
按照實施例8方案配制栓塞劑。
栓塞手術前家兔禁食6小時，用氯胺酮15mg/ml和阿托品0.04mg/ml作為全麻前用藥，動物仰臥固定于手術臺，耳緣靜脈滴注1％的戊巴比妥(25mg/kg)保持全麻。進行造影，再次觀察血管瘤模型，情況良好。見圖5(a)和圖5(b)。一側腹股溝剪毛，消毒，分離皮下組織和肌肉后，暴露分離股動脈，穿刺股動脈前壁，將導絲與導管送入血管腔內。再次進行造影監視，將導絲導管沿動脈血管送至頸總動脈，尋找模型瘤腔入口并進入。拔出導絲，將微導管口穩定在瘤腔靠里3/4位置，見圖6。開始以每分鐘0.2ml/min的推進速度注射液體栓塞劑，見圖7。待瘤腔栓塞80％后選擇退出微導管，瘤腔開口處無殘留，見圖8(a)和圖8(b)。隨后結扎，縫合，歸籠飼養。
結果
1，動物一般情況無異常改變。
2，影象學觀察X光片顯示，所有家兔頸動脈瘤腔模型均被完全閉塞，瘤腔開口處未見絲狀殘留，載瘤動脈遠端未見栓塞劑漂移。
3，大體標本觀察所有瘤腔均被固體物質牢固填塞，呈乳白色，略帶淡黃色。甲組見栓塞劑表面光滑，占據瘤腔體積80％以上，接近瘤腔開口處有血栓形成，硬度比海綿較硬；乙組見栓塞劑與瘤腔結合緊密，占據瘤腔體積90％或充滿整個瘤腔，硬度明顯增大；丙組見栓塞劑充滿整個瘤腔，無間隙，栓塞劑硬度高，瘤腔開口端血栓形成情況明顯，但完全沒有凸出到載瘤動脈。
4，病理觀察光鏡下甲組見栓塞劑與瘤腔內部融合良好，與瘤腔頸部之間還有空隙，其內有血栓；乙組栓塞劑與瘤腔內部融合緊密，與瘤腔頸部僅有局部小空隙，并被血栓充滿，血栓中可見棱形細胞，同時可見萎縮的內皮細胞；丙組見栓塞劑與瘤腔完全融合，瘤腔頸部可見內皮細胞不連續，有少量炎性細胞浸潤，且有膠原纖維細胞。載瘤動脈周圍組織無炎性細胞浸潤。
結果表明，本發明的液體栓塞劑對于動物體內血管瘤模型栓塞完全，未出現栓塞劑的遠端漂移或血管內殘留，瘤頸處血栓形成良好，動物無一例死亡或出現異常。液體栓塞劑的動物體內試驗安全而有效。
權利要求
1，一種顱內動脈瘤液體栓塞劑，其特征是由天然藥物白芨的多糖提取物與二醋酸纖維素聚合物按一定比例混合而成，顯影成分為碘海醇，溶劑成分為二甲亞砜。
2，一種權利要求1所述顱內動脈瘤栓塞劑的制備方法，其特征是按以下步驟進行(1)白芨多糖純品制備取天然藥物白芨，進行多糖組分初步抽提，并經過除蛋白，離子交換層析與凝膠過濾層析得到白芨多糖提取物純品；(2)顯影成分制備將商品碘海醇注射液凍干，得碘海醇白色固體粉末；(3)液體栓塞劑配制稱取配比范圍內的白芨多糖提取物與二醋酸纖維素，加熱條件下溶解于有機溶劑二甲亞砜，冷卻后加入顯影成分，溶解后冷藏備用。
3，一種權利要求2所述白芨多糖提取物的制備方法，其特征是按以下步驟進行取市售中藥白芨，充分碾碎后水煮3小時，沸騰8-10次，三層紗布過濾取濾液，加入兩倍體積無水乙醇，沉淀過夜；離心棄去上清，反復三次后取沉淀抽濾，溶于雙蒸水，Sevag法沉淀蛋白雜質，反復多次至考馬斯亮藍法檢測無蛋白；無水乙醚萃取，取水相凍干得白芨多糖粗品；粗品經DE-52離子交換柱(Whatman產品)層析，蒽酮—硫酸法檢測得單一洗脫峰，凍干得白芨多糖半純品；半純品經Sephadex G-200凝膠過濾柱(Pharmacia產品)層析，蒽酮—硫酸法檢測得單一洗脫峰；凍干得白芨多糖純品備用。
全文摘要
本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種顱內動脈瘤液體栓塞劑，其特征是由天然藥物白芨的多糖提取物與二醋酸纖維素聚合物按一定比例混合而成，顯影成分為碘海醇，溶劑成分為有機溶劑二甲亞砜。本發明還涉及該液體栓塞劑的制備方法，其特征是包含白芨多糖純品制備，顯影成分制備與液體栓塞劑配制三個步驟。該液體栓塞劑用于顱內動脈瘤的介入治療，解決了在無需球囊、支架等輔助材料情況下阻止遠端漂移的技術難題，同時具有優良的生物相容性和促血栓形成作用，達到了更好的栓塞效果和更高的安全性。
文檔編號A61P35/00GK1634119SQ20041006573
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月16日 優先權日2004年11月16日
發明者孫劍濤, 張峻峰, 王春明, 羅熠 申請人:南京大學, 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院