專利名稱：腫瘤壞死因子－γ的制作方法
技術領域：
本發明涉及新鑒別的多核苷酸，由這種多核苷酸編碼的多肽，此多核苷酸和多肽的應用，以及這種多核苷酸和多肽的生產。具體地，本發明的多肽已鑒別為是腫瘤壞死因子家族的一新成員，在后文稱為“TNF-γ-α”。本發明還涉及由編碼TNF-γ-α的基因的剪切變體編碼的蛋白質，后文稱作“TNF-γ-β”。本發明還涉及抑制這些多肽的功能。
背景技術：
人腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和b(TNF-b或淋巴毒素)是一大類多肽介體的相關成員，這些多肽介體包括干擾素，白細胞介素及生長因子，統稱為細胞因子(Beutler,B.和Cerami,A.,Annu.Rev.Immuno1.,7:625-655(1989))。
腫瘤壞死因子(TNF-a和TNF-b)最初是由其抗腫瘤活性而發現的，然而現證實它是一個具有多種活性的多效細胞因子，在免疫調節及炎癥中起重要作用。目前有8種已知的TNF相關的細胞因子家族的成員，TNF-a,TNF-b(淋巴毒素(LT)-a),LT-b，及Fas、CD30、CD27、CD40和4-1BB受體的配體。除TNF-b之外，這些蛋白質具有保守的C端序列及經常用作膜錨的可變N端序列。TNF-a和TNF-b當與TNF受體結合時，均有同源三聚體功能。
TNF通過許多類型細胞包括單核細胞，成纖維細胞，T細胞，天然殺傷(NK)細胞產生，并主要由活性的巨噬細胞產生。TNF-a已報道在腫瘤迅速壞死，免疫刺激，自身免疫系統疾病，移植排斥，抗寄生蟲，產生抗病毒應答，敗血休克，生長調節，血管內皮作用及代謝作用等方面均有作用。TNF-a還引發內皮細胞分泌各種因子包括PAI-1，IL-1,GM-CSF和IL-6以促進細胞增殖。另外，TNF-a正調節各種細胞粘附分子如E-Selectin,ICAM-1和VCAM-1。TNF-a和Fas配體也已呈現誘導細胞編程性死亡。
誘導由TNF或LT介導的各種細胞應答第一步是其與特異的細胞表面受體結合。已鑒別兩種獨立的TNF受體，TNF-R1大約為55Kda,TNF-R2大約為75Kda(Hohman,H.P.等，生物化學雜志.264:14927-14934(1989))，并分離及定性了相應于此兩種受體的人和鼠cDNAs(Loetscher,H.等.，細胞，61:351(1990)。這二種TNF-R均呈細胞表面受體的典型結構，細胞表面受體包括胞外，轉膜及胞內區。
在生理條件下多數是靜止組織的內皮(Denekamp,J.CancerMetas.Rev.9:267-282(1982))，在保持血管穩態及通透性方面起關鍵作用。內皮細胞在炎癥，細胞粘附，凝聚，血栓生成，纖維蛋白溶解及血管生成中是有活性的。在血管生成期間，內皮細胞增殖侵入基質，遷移至血管生成刺激源如癌癥細胞附近，與血管周圍細胞及基質細胞相互作用，最后，形成連接腫瘤組織至循環系統的毛細管(Folkman,J.Nature Med.1:27-31(1995))。盡管仍不十分清楚調節血管形成的復雜機制，但逐漸明白此過程的開始與結束是正性及負性因子平衡的結果。
在腫瘤組織中明顯被正調節的許多血管生成因子已被闡述。這些包括成纖維細胞生長因子(FGF)家族的一些成員，如FGF-1，FGF-2，及血管內皮細胞生長因子(VEGF)家族的成員，以及所有這些分子的受體(Gimenez-Gallego,G.等，科學230:1385-1388(1985)；Schweigerer,L.等，自然325-257-259(1987)；Leung,D.W.，等，科學246:1306-1309(1989)；Burrus,L.W.和Olwin,B.B.生物化學雜志264:18647-18653(1989)；Wermstorm,S.，等，生長因子4:197-208(1991)；Terman,B.I.等，生物化學，生物物理學研究187:1579-1586(1992)；及Vries,C.等，科學255:989-991(1992))。另外，也已報道了一些血管生成抑制因子，包括血小板反應蛋白，血管抑制素，內皮抑制素及血小板因子-4(Good,D.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6623-6628(1990)；O’Reilly,M.S.等，細胞79:315-328(1994)；O’Reilly,M.S.等，細胞88:277-285(1997)；Maione,T.E.等，科學247:77-79(1990))。現已清楚正常血管生成當需要時迅速激活，當不再需要時迅速中止。然而病理性血管生成一旦開始，則通常持續下去并難以結束。這可表明在病理性血管生成進程中，負性調節機制的正常功能喪失或被抑制。據信內皮細胞可以產生自分泌因子以抑制血管生成進程，或保持成熟血管的穩態。
本發明的多肽基于其結構，氨基酸序列同源性及功能相似性已鑒別為是TNF家族的新成員，例如TNF-γ是促炎蛋白質。另外，本發明的TNF-γ多肽是血管生成及內皮細胞生長的負調節物。由于這種調節的被干擾可存在于與血管生成，止血，腫瘤壞死，細胞遷移及許多系統的癌癥相關的疾病中，因此需要以這種方式作用的多肽。因而需要鑒別及定性在檢測，預防，改進或調節這種疾病中起作用的這種人類多肽。
發明概述根據本發明的一方面，提供了一種新的成熟多肽，其為TNF-γ-α以及一種新的成熟多肽，其為TNF-γ-β，以及其生物學活性d、和有診斷與治療作用的片段、類似物和衍生物。根據本發明的另一方面，提供了編碼人TNF-γ-α或TNF-γ-β的分離的核酸分子，包括mRNAs,DNAs,cDNAs，基因組DNAs及其類似物及其生物學活性的和有診斷與治療作用的片段和衍生物。
本發明提供了包含多核苷酸的分離的核酸分子，此多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的，或具有由以質粒DNA形式于1994年10月26日保藏在ATCC，保藏號75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的至少一部分。ATCC位于美國弗吉尼亞州馬那薩斯大學路10801號，郵編201010-2209。由保藏的TNF-γ-α克隆測序確定的示于圖1A和1B(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，含有編碼174個氨基酸殘基的完整多肽的開放讀框，其包括編碼N端甲硫氨酸的在783-785位核苷酸的起始密碼子，推導的分子量大約為20132Da。
因此，在一實施方案中，本發明提供了含有多核苷酸的分離的核苷酸分子，該多核苷酸具有選自以下一組的核苷序列(a)編碼具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQID NO:2所示除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由包含于ATCC保藏號No.75927中的cDNA克隆HUVEO91編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有由包含于ATCC保藏號NO.75927中的cDNA克隆HUVEO91編碼的除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由包含于ATCC保藏號No.75927中的cDNA克隆HUVEO91編碼的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；及(g)互補于以上(a),(b),(c),(d),(e)或(f)中任一核苷酸序列的核苷酸序列。
在另一實施方案中，本發明提供了含有多核苷酸的分離的核酸分子，該多核苷酸具有選自以下一組的核苷酸序列(a)編碼具有SEQID NO:20中完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1～251位氨基酸)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQID NO:20中除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2～251位氨基酸)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQID NO:20中62～251位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號203055中cDNA克隆HEMCZ56編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有由ATCC保藏號203055中的cDNA克隆HEMCZ56編碼的除N端甲硫氨基酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號203055中cDNA克隆HEMCZ56編碼的氨基酸序列的成熟TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；及(g)互補于以上(a),(b),(c),(d),(e)，或(f)中任一核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的另一實施方案包括含有多核苷酸的分離的核酸分子，該多核苷酸具有至少90％，優選至少95％,96％,97％,98％或99％等同于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中任一核苷酸序列的核苷酸序列，或者該多核苷酸是在嚴格雜交條件下與以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中多核苷酸或其片段(例如本文所述片段)或其互補鏈雜交的多核苷酸。這一雜交的多核苷酸在嚴格條件下與具有只由A殘基或只由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸不雜交。本發明的另一核酸實施方案涉及一種含有多核苷酸的分離核酸分子，該多核苷酸編碼具有以上(a),(b),(c),(d),(e)或(f)中氨基酸序列的TNF-γ多肽攜帶表位部分(即片段)的氨基酸序列。本發明另一實施方案涉及一種含有多核苷酸的分離核酸分子，該多核苷酸編碼具有含至少1個但不超過50個，優選不超過40個，更優選不超過30個，最優選不超過20個氨基酸取代的氨基酸序列的TNF-γ-多肽氨基酸序列。當然，在始終提高的優選性方面，優選的多核苷酸是編碼具有含不超過10,9,8,7,6,5,4,3,2或1個氨基酸取代的氨基酸序列的TNF-γ多肽的氨基酸序列。
本發明還涉及包括本發明分離的核酸分子的重組載體，及含有重組載體的宿主細胞，以及生產這種載體及宿主細胞的方法，以及用它們通過重組技術生產TNF-γ多肽或肽的方法。
根據本發明的另一方面，提供了通過重組技術生產這種多肽的方法，包括在促進所述蛋白質條件下培養含有人TNF-γ核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞隨后回收所述蛋白質。
本發明還提供了包含選自以下一組氨基酸序列的分離的TNF-γ多肽(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列(即SEQID NO:2的-27～147位氨基酸)的全長TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:2所示除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26-147位)的全長TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸序列的推定的成熟TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號75927中所含cDNA克隆HUVEO91編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號75927中所含cDNA克隆HUVEO91編碼的除N端甲硫氨酸外的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏號75927中所含cDNA克隆HUVEO91編碼的推定的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列；和(g)(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的多肽的片段。本發明的多肽還包括具有至少80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％等同于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的多肽，以及具有與以上那些氨基酸序列至少90％，優選至少95％相似的氨基酸序列的多肽。本發明其它實施方案涉及一種包含TNF-γ多肽攜帶表位部分的氨基酸序列的多肽，該TNF-γ多肽具有(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中所述氨基酸序列。具有本發明TNF-γ多肽攜帶表位部分的氨基酸序列的肽或多肽包括這種多肽的具有至少6或7個，優選至少9個，更優選至少大約30～50個氨基酸的部分，當然任何長度直至并包括上述本發明多肽全部氨基酸序列的攜帶表位的多肽也包括在本發明內。
本發明還提供了一種分離的TNF-γ多肽，其包括選自以下一組的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO:20所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1～251位氨基酸)的全長TNF-γ-β多肽氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:20所示除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2-251位的全長TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:20中62～251位氨基酸序列的推定的成熟TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號203055中cDNA克隆HEMCZ56編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號203055中cDNA克隆HEMCZ56編碼的除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏號203055中cDNA克隆編碼的推定的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列；及(g)(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的多肽的片段。本發明的多肽還包括具有至少80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％等同于上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中那些氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，以及具有與上述序列至少90％，優選至少95％相似的氨基酸序列的多肽。本發明其它實施方案涉及一種多肽，其包含具有上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的TNF-γ多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列。具有本發明TNF-γ多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列的肽或多肽包括這種多肽的具有至少6或7個，優選至少9個，更優選至少大約30～50個氨基酸的部分，當然任何長度直至并包括本發明多肽全部氨基酸序列的攜帶表位的多肽也包括在本發明內。
本發明的另一實施方案涉及一種多肽，其包含具有一種氨基酸序列的TNF-γ多肽的氨基酸序列，TNF-γ多肽所具有的氨基酸序列含有至少1個但不超過50個，優選不超過40個，更優選不超過30個，最優選不超過20個氨基酸取代。當然，按始終提高的優選性，肽或多肽優選具有包含TNF-γ多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，其含有至少1個，但不超過10,9,8,7,6,5,4,3,2或1個氨基酸取代。在特異的實施方案中，圖1A和1B，圖20A和20B中氨基酸序列或其片段(例如胞外域和/或其它片段)中添加，取代和/或缺失的數目是1-5,5-10,5-25,5-50,10-50或50-150，優選的是保守氨基酸取代。
在另一實施方案中，本發明提供了與具有上述氨基酸序列的TNF-γ多肽特異結合的分離的抗體。本發明還提供了分離與TNF-γ多肽特異結合的抗體的方法，該TNF-γ多肽具有本文所述氨基酸序列。這種抗體用于如下診斷或治療方面。
根據本發明的另一方面，提供了一種利用本發明的多核苷酸和/或多肽以篩選興奮劑及拮抗劑的方法，以用于治療目的，所述目的包括但非限于傷口愈合，抑制腫瘤增殖，提供抗寄生蟲、細菌及病毒抗性，誘導炎癥活性，誘導內皮細胞及某些造血細胞增殖，以治療再狹窄及預防某些自身免疫系統疾病。
根據本發明的另一方面，還提供了核酸探針，其包含足夠長度的核酸分子以特異地雜交人TNF-γ序列。
根據本發明的另一方面，還提供了TNF-γ多肽興奮劑，其模擬TNF-γ并結合TNF-γ受體以激發TNF-γ型應答。
根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的拮抗劑，其可用于抑制這種多肽的功能，例如預防敗血癥休克，炎癥，腦瘧疾，HIV病毒活化，移植物排斥，骨質疏松及惡病質。
根據本發明的另一方面，提供了檢測與TNF-γ多肽及編碼這種多肽的核酸序列低表達及過表達相關的疾病的診斷分析法。
在本發明的另一方面，TNF-γ可用于治療類風濕性關節炎(RA)，通過抑制通常在RA中觀測到的維持侵入骨及軟骨血管翳所需的血管生成及內皮細胞增殖的增加進行治療。
在另一方面，TNF-γ可結合作為病毒受體或共同受體的細胞表面蛋白。因此，TNF-γ或其興奮劑或拮抗劑，可用于在病毒結合或與TNF-γ受體或共同受體相互作用的水平，或在病毒內在化或進入細胞的過程期間，調節病毒感染性。
根據本發明所有這些方面，術語“TNF-γ”指TNF-γ-α和/或TNF-γ-β。
根據本文教導，本領域技術人員將清楚本發明的這些及其它方面。
附圖簡述下述附圖是舉例說明本發明的實施方案，而非限制本發明權利要求所包括的范圍。
圖1A和1B示出本發明TNF-γ多肽的cDNA(SEQ ID NO:1)及相應推導的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。開始的27個氨基酸(下劃線處)是推定的前導序列。使用標準的單字母縮寫代表氨基酸。在圖1A和圖1B中，潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點在TNF-γ-α氨基酸序列中以黑體字的天冬酰胺符號(N)標記，在TNF-γ-α核苷酸序列中以黑體字的(#)在編碼這個天冬酰胺殘基的第一個核苷酸上標志。潛在的N-連接的糖基化序列發現位于TNF-γ-α氨基酸序列的以下位置N-29～N-32(N-29,Y-30,T-31,N-32)和N-125～D-128(N-125,V-126,S-127,D-128)。在圖1A和1B中，潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點在TNF-γ-α氨基酸序列中以黑體的蘇氨酸符號(T)標記，在TNF-γ-α核苷酸序列中在編碼這個蘇氨酸殘基的第一個核苷酸上用(*)標記。潛在的PKC磷酸化序列發現在TNF-γ-α氨基酸序列中以下位置T-32～K-34(T-32,N-33,K-34)及T-50～R-52(T-50,F-51,R-52)。在圖1A和1B中，潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點在TNF-γ-α氨基酸序列中也以黑體的絲氨酸或蘇氨酸符號(S或T)標記，在TNF-γ-α核苷酸序列中在編碼適當的絲氨酸或蘇氨酸殘基的第一個核苷酸上用(*)標記。潛在的CK2磷酸化序列發現在TNF-γ-α氨基酸序列的以下位置S-83～E-86(S-83,Y-84,P-85,E-86)；S-96～E-99(S-96,V-97,C-98,E-99)；S-115～E-118(S-115,L-116,Q-117,E-118)；S-130～D-133(S-130,L-131,V-132,D-133)；及T-135～D-138(T-135,K-136,E-137,D-138)。在圖1A和1B中，潛在的十四烷基化位點在TNF-γ-α氨基酸序列中以雙下劃線標出，潛在的十四烷基化序列發現在TNF-γ-α氨基酸序列的以下位置G-20～K-25(G-20,L-21,A-22,F-23,T-24,K-25)及G-111～L-116(G-111,A-112,M-113,F-114,S-115,L-116)。
圖2A-C示出TNF-γ-α(SEQ ID NO:2)與其它TNF家族成員包括人TNF-α(GenBank No.Z15026；SEQ ID NO:3)，人TNF-β(GenBank No.Z15026；SEQ ID NO:4)，人淋巴毒素-β(LT-β；GenBank No.L11016；SEQ ID NO:5)及人Fas配體(FASL；GenBank No.U11821；SEQ ID NO:6)之間的氨基酸序列對比。TNF-γ含有TNF家族的保守氨基酸殘基，以有陰影的框示出。此對比的分子以其全部在圖2A,2B和2C中表示。
圖3A是一示出TNF-γ在人組織表達的RNA印跡分析。所示組織的RNA用標記的TNF-γcDNA探查。由于圖3A示出的明顯泳道，TNF-γ-αmRNA主要在腎中存在。其它泳道似乎示出強雜交，然而這些實際是非特異性成片泳道。
圖3B是示出TNF-γ主要在HUVEC細胞(人臍靜脈內皮細胞；泳道9)表達的RNA印跡分析。泳道6和泳道8是非特異成片泳道。所示細胞系的RNA用標記的TNF-γ-αcDNA探查。泳道1是CAMA1(乳腺癌)；泳道2是AN3CA(子宮癌)；泳道3是SK.UT.1(子宮癌)；泳道4是MG63(骨肉瘤)；泳道5是HOS(骨肉瘤)；泳道6是MCF7(乳腺癌)；泳道7是OVCAR-3(卵巢癌)；泳道8是CAOV-3(卵巢癌)；泳道9是HUVEC；泳道10是AOSMIC(平滑肌)；泳道11是包皮成纖維細胞。
圖4示出TNF-γ在增殖或靜止的內皮細胞中的相關表達。在培養的HUVEC細胞中TNF-γmRNA水平通過Northem印跡分析確定。以b-肌動蛋白密度表示的等量的總RNA(15μg)加樣于每個泳道上。相當于TNF-γ的信號稱為“VEGI”。在所示時間點(種植后的天數)制備總RNA。同時確定每個培養燒瓶中細胞數。進行雙份試驗，每個(T-25)燒瓶種植12500個細胞。
圖5是TNF-γ蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析照片。TNF-γ如實施例1所述通過細胞表達生產及純化。
圖6是示出桿狀病毒表達的TNF-γ的相關純度及遷移率的凝膠照片。用桿狀病毒系統表達及純化TNF-γ如實施例2所述。
圖7A由未處理的(圖7Aa)及接觸TNF-α(圖7Ab),TNF-γ(圖7Ac)和TNF-b(圖7Ad)后的WEHI 164細胞的照片組成。具有延長的非圓形形態的細胞已被溶解。各種TNF分子以大約0.5μg/ml濃度加入。加入各種TNF分子72小時后照相。
圖7B示出TNF-γ(圖7Bc)與TNF-α(圖7Ba)和TNF-b(圖7Bb)對比抑制WEHI 164細胞生長的能力。
圖8示出與未處理的L929細胞(圖8A)相比重組TNF-α(圖8B),TNF-b(圖8D)及TNF-γ(圖8C)誘導L929細胞的形態變化的能力。形態學變化以黑色圓形細胞表示。用各種重組TNF分子(在E.coli中產生的)，以大約0.5μg/ml處理細胞。在加入各種TNF分子72小時后照相。形態學變化指示細胞已被殺死。
圖9示出TNF-γ(圖9C),TNF-a(圖9A)和TNF-b(圖9B)對靜脈內皮細胞的作用。在用商購的TNF-a和TNF-b及E.coli產生的TNF-γ處理靜脈內皮細胞后，細胞的增殖用MTS分析定量。
圖10示出TNF-γ對內皮細胞及乳腺癌細胞增殖的作用。以細胞數對所示TNF-γ濃度作圖。(TNF-γ在此圖中稱為“VEGI”)。示出成年牛動脈內皮(ABAE)細胞(黑圓)生長受抑制，而MDA-MB-231(黑色三角)或MDA-MB-435(空心圓)細胞生長不受抑制。細胞以2×103個細胞/孔種植于24孔平板中，重復三份。ABAE細胞培養基含有補加10％FCS和(1ng/ml)FGF-2的IMEM(Life Technoligies,Inc.,Rockville,MD)。將此培養物在37℃,5％CO2中保持6天。然后細胞用胰蛋白酶消化，通過Coulter計數儀確定細胞數。示出回收的ABAE細胞總數的1/50，以校正與MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞的對比。
圖11是HL60細胞的照片；對照(圖11A)示出HL60細胞被涂開；及TNF-a(圖11B)和TNF-γ(圖11C)通過細胞粘附在下部右側示出誘導細胞粘附及細胞與細胞間的接觸。
圖12示出重組TNF-γ(以方形表示)，TNF-a(以圓形表示)，及TNF-b(以三角形表示)誘導WEHI 164細胞死亡的能力。細胞死亡與405nm和490nm的吸光度之比成反比。
圖13示出TNF-γ未有效地結合兩種已知可溶的TNF受體，受體名為sTNF RⅠ(p55；實框)和sTNF RⅡ(p75；虛框)。
圖14表明TNF-γ對ABAE細胞在膠原凝膠上形成類毛細管能力的影響。示出重組TNF-γ(SEQ ID NO:2中所示12-147殘基，在此圖中稱為“VEGI”)抑制ABAE細胞形成類毛細管。通過對比在培養基中含或不含有各種濃度TNF-γ時，ABAE細胞形成類毛細管的程度獲得P值(t-檢驗)。
圖15示出置于雞胚絨毛尿囊膜(CAM)上膠原凝膠中，TNF-γ對血管生成的抑制。用FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)誘導新毛細管生長入CAM上膠原凝膠片中。凝膠中血管生成的程度通過評定注射入CAM循環中FITC-右旋糖酐的熒光密度而確定。重組TNF-γ(在此圖稱為“VEGI”)對毛細管生長的抑制以低于100的數值表示。實驗以三份進行。
圖16示出TNF-γ對無胸腺裸鼠中人乳腺癌異種移植腫瘤的生長抑制。將TNF-γ過表達的或載體轉染的CHO細胞(5×106個細胞/次注射)和人乳腺癌細胞(1×106個細胞/次注射)的混合物注入裸鼠乳房脂肪層中。注射后監測腫瘤大小(范圍)。繪出以接種以后天數為函數的MDA-MB-231異種移植腫瘤大小圖(圖16A)。繪出以接種后天數為函數的MDA-MB-435異種移植腫瘤的大小圖(圖16B)。空心圓表示用載體轉染的CHO細胞共接種的腫瘤值，而實心圓表示用TNF-γ轉染的CHO細胞共接種的腫瘤值。
圖17示出TNF-γ-α氨基酸序列(SEQ ID NO:2)分析。示出α,β，轉角及卷曲區；親水性及疏水性；兩親區；柔性區；抗原性指數及表面概率，這是用所述計算機程序的缺省參數預測的。在“抗原性指數或Jameson-Wolf”圖中，正峰值表示TNF-γ蛋白質高抗原性區的位置，即從中可獲得本發明攜帶表位的肽的區域。
圖18A-D示出TNF-γ-α(SEQ ID NO:1)和TNF-γ-β(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列對比，用BESTFIT程序，設定缺省參數。
圖19示出TNF-γ-α(SEQID NO:2)和TNF-γ-β(SEQID NO:20)的氨基酸序列對比，用BESTFIT程序，設定缺省參數。
圖20A和B示出本發明TNF-γ-β多肽的cDNA(SEQ IDNO:19)及相應推導的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。使用標準單字母縮寫代表氨基酸。甲硫氨酸-1～色氨酸-35間的氨基酸是推定的胞內區。丙氨酸-36～丙氨酸-61(下劃線)的氨基酸殘基是推定的跨膜序列。在圖20A和B中，潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點在TNF-γ-β氨基酸序列中用黑體的天冬酰胺符號(N)標記，在TNF-γ-β核苷酸序列中用(#)在編碼這個天冬酰胺的第一個核苷酸上標記。潛在的N-連接的糖基化序列發現在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置N-133～N-136(N-133,Y-134,T-135,N-136)及N-229～D-232(N-229,V-230,S-231,D-232)。在圖20A和B中，在TNF-γ-β核苷酸序列中在編碼適當的位氨酸或蘇氨酸殘基的第一個核苷酸上用(*)標記。潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點在TNF-γ-β氨基酸序列中用黑體的絲氨酸或蘇氨酸符號(S或T)標記，在TNF-γ-β核苷酸序列中用(*)在編碼適當絲氨酸或蘇氨酸殘基的第一個核苷酸上標記。潛在的PKC磷酸化序列發現在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置S-23～R-25(S-23,C-24,R-25)；S-32～R-34(S-32,A-33,R-34)；R-135～K-137(T-135,N-136,K-137)；和T-154～R-156(T-154,F-155,R-156)。在圖20A和20B中,潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點在TNF-γ-β氨基酸序列中也以黑體的位氨酸或蘇氨酸符號(S或T)標記。潛在的CK2磷酸化序列發現在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置S-8～E-11(S-8,F-9,G-10,E-11)；S-187～E-190(S-187,Y-188,P-189,E-190)；S-200～E-203(S-200,V-201,C-202,E-203)；S-219～E-222(S-219,L-220,Q-221,E-222)；S-234～D-237(S-234,L-235,V-236,D-237)；及T-239～D-242(T-239,K-240,E-241,D-242)。在圖20A和B中，潛在的十四烷基化位點在TNF-γ-β氨基酸序列中用雙下劃線標記。潛在的十四烷基化序列發現在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置G-6～E-11(G-6,L-7,S-8,F-9,G-10,E-11)；G-124～G-129(G-124,L-125,A-126,F-127,T-128,K-129)；及G-215～L-220(G-215,A-216,M-217,F-218,S-219,L-220)。
發明詳述本發明提供了包括編碼TNF-γ-α多肽的多核苷酸的分離的核酸分子，該TNF-γ-α多肽具有圖1A和B所示氨基酸序列(SEQID NO:2)，它是通過對克隆的cDNA(HUVEO91)測序而確定的。如圖2A-2C所示，本發明的TNF-γ-α多肽與人TNF-α(SEQID NO:3),TNF-β(SEQ ID NO:4)，人淋巴毒素-β(SEQ IDNO:5)及FAS配體(SEQ ID NO:6)呈序列同源。本發明的TNF-γ-α至少可抑制血管生成，作為抗腫瘤的類細胞因子的分子，通過抑制與侵入骨及軟骨血管翳相關的血管生成及內皮細胞增殖治療關節炎，作為NF-kB和c-Jun激酶(JNK)的誘導劑，細胞粘附的誘導劑，以及細胞程序死亡的誘導劑(參見實施例，尤其實施例12-15)。SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是通過對cDNA克隆(HUVEO91)測序而得，該cDNA克隆于1994年10月26日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，獲得的ATCC保藏號為75927,ATCC位于美國馬里蘭州Rockville,Park Lawn Prive 12301，郵編20852。保藏的質粒包含在pBluescript SK(-)質粒中(Stratagene,LaJolla,CA)。對由克隆HUVEO91編碼的蛋白質的進一步定性在1998年2月9日申請的美國臨時申請60/074047中闡述，在此全部并入參考。
本發明還提供了包括編碼TNF-γ-β多肽的多核苷酸(SEQ IDNO:19)的分離的核酸分子，該TNF-γ-β多肽具有圖20A和B所示氨基酸序列(SEQ ID NO:20)，它是通過對克隆的cDNA(HEMCZ56)進行測序確定的。此TNF-γ-B多肽是本文所公開的TNF-γ-α多肽的剪切變體。SEQ ID NO:19所示核苷酸序列是通過對cDNA克隆(HEMCZ56)測序獲得的，該cDNA克隆于1998年7月9日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)。獲得的保藏號為203055。ATCC位于美國佛吉尼亞州馬那薩斯市大學道10801號，郵編20110-2209。此保藏的質粒包含于pBluescript SK(-)質粒(Stratagene,La Jolla,CA)。
核酸分子除非另外說明，本文中所有通過測序DNA分子而確定的核苷酸序列都是利用自動DNA測序儀(如Applied Biosystems公司的373型)確定的，而本文中所有的由DNA分子所編碼的多肽的氨基酸序列都是通過對上述確定的DNA序列翻譯而預測的。因此，正如本領域對通過自動化方法確定的任何DNA序列所了解的那樣，本文所確定的任何一個核苷酸序列都可能有誤差。自動化確定的核苷酸序列與實際的核苷酸序列典型地具有至少大約90％，更典型地至少大約95％～至少大約99.9％的相同性。實際的序列可以通過本領域所熟知的其它方法包括手工DNA測序方法而更為精確地測定。同樣正如本領域所了解的，相對實際序列，在確定的核苷酸序列中的單個插入或缺失，將會導致該核苷酸序列翻譯上的移框，因而由確定的該核苷酸序列推導出的所編碼的氨基酸序列將會從該插入或缺失點開始，完全不同于該測序DNA分子所編碼的實際氨基酸序列。核酸分子或多核苷酸的“核苷酸”序列對于DNA分子或多核苷酸而言是脫氧核糖核苷酸序列，對RNA分子或多核苷酸而言是相應的核糖核苷酸(A,G,C和U)序列，其中在特異的脫氧核糖核苷酸序列中的每個胸腺嘧啶脫氧核糖核苷(T)被尿嘧啶核糖核苷(U)取代。
用本發明所提供的信息，如圖1A和B中核苷酸序列(SEQ IDNO:1)，或圖20A或B中核苷酸序列(SEQ ID NO:19)；可使用標準克隆篩選方法例如用mRNA作起始物克隆cDNAs的方法獲得本發明編碼TNF-γ-α或TNF-γ-β多肽的核酸分子(即多核苷酸)。例如，編碼TNF-γ-α多肽的多核苷酸可常規得自表達TNF-γ-α的任何細胞或組織，例如人腎及臍靜脈內皮細胞。如本發明的一個例子，圖1A和B所述的核酸分子(SEQ ID NO:1)在衍生自人臍靜脈內皮細胞的cDNA文庫中發現。相當于TNF-γ-α的cDNA克隆(克隆HUVEO91)含有一編碼有174個氨基酸殘基的蛋白質的開放讀框，此蛋白質的大約頭27個氨基酸殘基是推定的前導序列，這樣成熟蛋白質包含147個氨基酸。此蛋白質在C端與兔TNF-a(Ito,H.，等，DNA 5:157-165(1986)；GenBank登錄號M12846；SEQ ID NO:7)具有最高度同源性，在一段111個氨基酸的序列上有38％相同性及58％相似性。在TNF家族成員中保守的序列在TNF-γ中也是保守的(見圖2A-2C)。帶陰影的字母代表保守的氨基酸殘基。如圖3B所示RNA印跡分析所示，TNF-γmRNA在人臍靜脈內皮細胞中特異表達。
另外，編碼TNF-γ-β多肽的多核苷酸可常規得自誘導的及靜息的內皮細胞，臍靜脈，扁桃體，及一些其它類型的細胞和組織。如本發明的一個例子，圖20A和B所述的核酸分子(SEQ ID NO:19)在衍生自誘導的內皮細胞的cDNA文庫中發現。相當于TNF-γ-β的此cDNA克隆(HEMCZ56)含有一編碼有251個氨基酸殘基的蛋白質的開放讀框，此蛋白質的大約頭35個氨基酸殘基是推定的胞內域，且36-61位氨基酸是推定的跨膜域，62-251位氨基酸殘基是推定的胞外域。
構成胞外，跨膜及胞內域的氨基酸殘基已通過計算機分析推測。因此，本領域技術人員將意識到，構成這些區域的氨基酸殘基根據用于定義每個區域的標準可輕微變化(例如有大約1～15個氨基酸發生變化)。
根據本發明的一方面，提供了編碼成熟多肽的一種分離的核酸(多核苷酸)，該成熟多肽具有圖1A和B的推導的氨基酸序列(SEQID NO:2)或是由克隆HUVEO91的cDNA編碼，該克隆HUVEO91在1994年10月26日保藏在ATCC，保藏號75927。
根據本發明的另一方面，提供了編碼成熟多肽的一種分離的核酸(多核苷酸)，該成熟多肽具有圖20A和B的推導的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)，或是由克隆HEMCZ56的cDNA編碼，該克隆HEMCZ56在1998年7月9目保藏在ATCC，保藏號203055。
“分離的”核酸分子或多核苷酸是指已從其天然環境中移出的分子，DNA或RNA。例如，本發明包含在載體中的重組DNA分子(多核苷酸)被認為是分離的。其它分離的DNA分子(多核苷酸)例如包括保存在異源宿主細胞中的重組DNA分子，或溶液中純化(部分或基本純化)的DNA分子。分離的RNA分子(多核苷酸)包括本發明DNA分子(多核苷酸)的體內或體外RNA轉錄物。根據本發明的分離的核酸分子或多核苷酸還包括合成產生的這種分子。本發明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，DNA包括cDNA，基因組DNA及合成的DNA。此DNA可以是雙鏈或單鏈，且如果是單鏈的則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。
本發明的分離的核酸分子包括編碼成熟TNF-γ-α多肽的圖1A和B中所述的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，編碼成熟TNF-γ-β多肽的圖20A和B中所述的多核苷酸序列(SEQ ID NO:19)，包含于編碼成熟TNF-γ-α多肽的保藏的克隆(HUVEO91)中的多核苷酸序列，此保藏的克隆(HUVEO91)保藏在ATCC中，保藏號75927，包含于編碼成熟TNF-γ-β多肽的保藏的克隆(HEMCZ56)中的多核苷酸序列，此保藏的克隆(HEMCZ56)保藏在ATCC中保藏號203055，及包含不同于上述那些序列的序列，但由于遺傳密碼的簡并性，編碼與圖1A和B，圖20A和B的DNA，或保藏的cDNA相同成熟多肽的多核苷酸。當然，本領域熟知遺傳密碼。因此，本領域技術人員將可常規產生這種簡并的變體。
完整的TNF-γ-α蛋白質的氨基酸序列包括一前導序列及一成熟蛋白質，如圖1A和B所示(SEQ ID NO:2)。尤其地，本發明提供了編碼成熟形式TNF-γ-α蛋白質的核酸分子。因此，根據信號假說，一旦生長的蛋白質鏈已開始通過粗面內質網輸出，由哺乳動物細胞分泌的蛋白質具有一信號或前導序列，其切割自完整多肽以產生分泌的“成熟”形式的蛋白質。大多數哺乳動物細胞和甚至昆蟲細胞以相同特異性切割分泌的蛋白質。然而，在一些情況中，分泌的蛋白的切割不是完全一致的，這產生了兩或多種成熟的蛋白質。另外，長期以來已知分泌的蛋白的切割特異性最終是由完整蛋白質的初級結構確定的，即其是多肽氨基酸序列中固有的。因而本發明提供了編碼成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列，該成熟TNF-γ-α多肽具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。“具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽”是指TNF-γ-α蛋白質的成熟形式，其是通過由保藏的克隆的人DNA序列編碼的完整開放讀框在哺乳動物細胞(例如下述COS細胞)中表達而產生的。
編碼圖20A和B的成熟多肽的，或編碼由保藏的cDNA(HEMCZ56)編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括但非限于僅成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列及附加編碼序列如前導或分泌序列，或跨膜序列，或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(及任選地附加編碼序列)及非編碼序列，如內含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’的非編碼序列。
本發明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列以相同的閱讀框與一個有助于多肽從宿主細胞中表達和分泌的多核苷酸相融合，例如，用以控制多肽從細胞中轉運的作為分泌序列的前導序列。具有前導序列的多肽是一前蛋白，且可以由宿主細胞切割前導序列以形成成熟形式的多肽。此多核苷酸還可編碼前蛋白，即成熟多肽加上另外的5’氨基酸殘基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是一蛋白原，且是該蛋白的非活性形式。一旦該原序列被切割，則剩下活性的成熟蛋白。
因此，本發明的多核苷酸例如可編碼成熟蛋白質，或具有原序列的蛋白質，或具有原序列及前序列(前導序列)的蛋白質。
本發明的多核苷酸還可具有融入標記序列讀框中的編碼序列，從而使本發明的多肽純化。在使用細菌宿主的情況下，標記序列可以是pQE-9載體的6組氨酸標簽，以利于純化融合了該標記的成熟多肽，或者，例如，在使用哺乳動物宿主如COS-7細胞的情況下，標記序列可以是血凝集素(HA)標簽。HA標簽相應于來自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson等，細胞，37:767(1984))。
因此，術語“編碼多肽的多核苷酸”涵蓋了只含有該多肽的編碼序列的多核苷酸，以及包括有其它編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明進而還涉及上文所述的多核苷酸的變異體，該多核苷酸變異體編碼具有圖1A和B，圖20A和B中推導的氨基酸序列的多肽及由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物，。此多核苷酸的變異體可以是天然存在的等位基因變異體，也可以是非天然存在的該多核苷酸的變異體。
因此，本發明包括編碼圖1A和B所示相同的成熟多肽，或者編碼由保藏的克隆HUVEO91的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，這些變異體編碼圖1A和B所示多肽或由保藏的克隆HUVEO91的cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物。這種核苷酸變體包括缺失變異，置換變異及添加或插入變異。
另外，本發明包括編碼圖20A和B所示成熟多肽，或由保藏的克隆HEMCZ56的cDNA編碼的多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，這些變異體編碼圖20A和B所示多肽或由保藏的克隆HEMCZ56的cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物。這種核苷酸變異體包括缺失變異，置換變異及添加或插入變異。
如上所述，該多核苷酸序列可以具有圖1A和1B所示編碼序列或保藏的克隆HUVEO91的編碼序列的天然存在等位基因變異體的編碼序列。或者，此多核苷酸序列可以具有圖20A和B所示編碼序列或保藏的克隆HEMCZ56的編碼序列的天然存在等位基因變異體的編碼序列。正如本領域所熟知的，等位基因變異體是一個多核苷酸序列的另一種形式，它含有一個或多個核苷酸的置換，缺失或添加，而不實質地改變所編碼的多肽的功能。
本發明進一步涉及本文所述分離的核酸分子的片段。一個分離的具有保藏的cDNAs(HUVEO91和HEMCZ56)的核苷酸序列或如圖1A和B(SEQ ID NO:1)，圖20A和B(SEQ ID NO:19)所示的核苷酸序列的分離的，或其互補鏈的核酸分子的片段，是指長度至少15nt，優選至少20nt，更優選至少30nt，最優選至少40,50,100,150,200,250,300,400或500nt的片段。這些片段有許多用處，包括但非限于用作本文所述的診斷探針和引物。當然，根據本發明，與保藏的cDNA克隆HUVEO91，保藏的cDNA克隆HEMCZ56的核苷酸序列，或圖1A和B(SEQ ID NO:1)或圖20A和B(SEQ ID NO:20)所示核苷酸序列大多數(即使非全部)相應的50～1500nt長度片段也是有用的。例如，一個長度為至少20nt的片段是指包括來自保藏的cDNA克隆(HUVEO91及HEMCZ56)的核苷酸序列，或如圖1A和B(SEQ ID NO:1)或圖20A和B(SEQID NO:20)所示核苷酸序列的20個或更多個連續堿基的片段。
在一特異實施方案中，本發明的多核苷酸片段編碼具有功能活性的多肽。具有“功能活性”的多肽是指能行使一或多種與完整或成熟TNF-γ多肽相關的已知功能活性的多肽。這種功能活性包括但非限于生物學活性(例如抑制血管生成，抑制內皮細胞增殖，誘導NF-kB及c-Jun激酶(JNK)，誘導細胞粘附，及誘導細胞程序化死亡(見實施例尤其實施例12-15))，抗原性[結合(或與TNF-γ多肽競爭結合)TNF-γ抗體的能力]，免疫原性(產生與TNF-γ多肽結合的抗體的能力)與其它TNF-γ多肽形成聚合物的能力，及結合TNF-γ多肽的受體或配體(例如DR3)的能力。
本發明還提供了具有與SEQ ID NO:1的大量片段相關的核苷酸序列的核酸分子，其已從以下相關cDNA克隆中確定HUVEO91(SEQ ID NO:8),HMPAP05(SEQ ID NO:9),HSXCA44(SEQIDNO:10),HEMFG66(SEQ ID NO:11)，及HELAM93(SEQID NO:12)。
本發明還提供了具有與SEQ ID NO:19的大量片段相關的核苷酸序列的核酸分子，其已從以下相關cDNA克隆中確定HUVEO91P01(SEQ ID NO:21),HMPTI24R(SEQ ID NO:22),HELAM93R(SEQ ID NO:23)，及HEMFG66R(SEQ ID NO:24)。
在特異的實施方案中，本發明的多核苷酸片段包括含有SEQ IDNO:1的1～2442核苷酸殘基的至少30個，優選至少50個核苷酸的任何部分的多核苷酸，或由該多核苷酸組成，優選除外從上面所列cDNA克隆中確定的核苷酸序列。本發明TNF-γ-α多核苷酸片段的代表性實例包括含有以下SEQ ID NO:1，或其互補的多核苷酸鏈，或包含于保藏的克隆HUVEO91中的cDNA的如下核苷酸或由這些核苷酸組成的片段783-1304,800-1300,850-1300,900-1300,950-1300,1000-1300,1050-1300,1100-1300,1150-1300,1200-1300,1250-1300,783-1250,800-1250,850-1250,900-1250,950-1250,1000-1250,1050-1250,1100-1250,1150-1250,1200-1250,783-1200,800-1200,850-1200,900-1200,950-1200,1000-1200,1050-1200,1100-1200,1150-1200,783-1150,800-1150,850-1150,900-1150,950-1150,1000-1150,1050-1150,1100-1150,783-1100,800-1100,850-1100,900-1100,950-1100,1000-1100,1050-1100,783-1050,800-1050,850-1050,900-1050,950-1050,1000-1050,783-1000,800-1000,850-1000,900-1000,950-1000,783-950,800-950,850-950,900-950,783-900,800-900,and 850-900
在另外的特異實施方案中，本發明的多核苷酸片段包括或由含有SEQ ID NO:19的1～1116核苷酸殘基的至少30個，優選至少50個核苷酸的任何部分的多核苷酸組成，優選除外從上面所列cDNA克隆中確定的核苷酸序列。(即列自p.25)。
本發明優選的實施方案包括這樣的多核苷酸，其編碼包含或由SEQ ID NO:2的-1-147(即-1～147),1-147(即+1～147),2-147,3-147,4-147,5-147,6-147,7-147,8-147,9-147,10-147,11-147,12-147及13-147殘基的氨基酸序列組成的多肽。本發明還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的TNF-γ-β多核苷酸片段的代表性實例包括包含或由SEQ ID NO:19或其互補多核苷酸鏈，或包含于保藏的克隆HEMCZ56中的cDNA的以下核苷酸組成的片段
1-1116,50-1116,100-1116,150-1116,200-1116,250-1116,300-1116,350-1116,400-1116,450-1116,500-1116,550-1116,600-1116,650-1116,700-1116,750-1116,800-1116,850-1116,900-1116,950-1116,1000-1116,1050-1116,1-1100,50-1100,100-1100,150-1100,200-1100,250-1100,300-1100,350-1100,400-1100,450-1100,500-1100,550-1100,600-1100,650-1100,700-1100,750-1100,800-1100,850-1100,900-1100,950-1100,1000-1100,1050-1100,1-1050,50-1050,100-1050, 150-1050,200-1050,250-1050,300-1050,350-1050,400-1050,450-1050,500-1050,550-1050,600-1050,650-1050,700-1050,750-1050,800-1050,850-1050,900-1050,950-1050,1000-1050,1-1000,50-1000,100-1000,150-1000,200-1000,250-1000,300-1000,350-1000,400-1000,450-1000,500-1000,550-1000,600-1000,650-1000,700-1000,750-1000,800-1000,850-1000,900-1000,950-1000,1-950,50-950,100-950,1 50-950,200-950,250-950,300-950,350-950,400-950,450-950,500-950,550-950,600-950,650-950,700-950,750-950,800-950,850-950,900-950,1-900,50-900,100-900,150-900,200-900,250-900,300-900,350-900,400-900,450-900,500-900,550-900,600-900,650-900,700-900,750-900,800-900,850-900,1-850,50-850,100-850,150-850,200-850,250-850,300-850,350-850,400-850,450-850,500-850,550-850,600-850,650-850,700-850,750-850,800-850,1-800,50-800,100-800,150-800,200-800,250-800,300-800,350-800,400-800,450-800,500-800,550-800,600-800,650-800,700-800,750-800,1-750,50-750,100-750,150-750,200-750,250-750,300-750,350-750,400-750,450-750,500-750,550-750,600-750,650-750,700-750,1-700,50-700,100-700,1 50-700,200-700,250-700,300-700,350-700,400-700,450-700,500-700,550-700,600-700,650-700,1-650,50-650,100-650,150-650,200-650,250-650,300-650,350-650,400-650,450-650,500-650,550-650,600-650,1-600,50-600,100-600,150-600,200-600,250-600,300-600,350-600,400-600,450-600,500-600,550-600,1-550,50-550,100-550,150-550,200-550,250-550,300-550,350-550,400-550,450-550,500-550,1-500,50-500,100-500,150-500,200-500,250-500,300-500,350-500,400-500,450-500,1-450,50-450,100-450,150-450,200-450,250-450,300-450,350-450,400-450,1-400,50-400,100-400,150-400,200-400,250-400,300-400,350-400,1-350,50-350,100-350,150-350,200-350,250-350,300-350,1-300,50-300,100-300,150-300,200-300,250-300,1-250,50-250,100-250,150-250,200-250,1-200,50-200,100-200,150-200,1-150,50-150,100-150,1-100,50-100,and 1-50
本發明優選的核酸片段還包括編碼TNF-γ-α的一或多個以下區域的核酸分子(例如，如圖1A和1B的


所述)SEQ IDNO:2的潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點N-29～N-32(N-29,Y-30,T-31,N-32)及N-125～D-128(N-125,V-126,S-127,D-128)；潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點T-32～K-34(T-32,N-33,K-34)及T-50～R-52(T-50,F-51,R-52)；潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點S-83～E-86(S-83,Y-84,P-85,E-86)；S-96～E-99(S-96,V-97,C-98,E-99)；S-115～E-118(S-115,L-116,Q-117,E-118)；S-130～D-133(S-130,L-131,V-132,D-133)；及T-135～D-138(T-135,K-136,E-13 7,D-138)；及潛在的十四烷基化位點G-20～K-25(G-20,L-21,A-22,F-23,T-24,K-25)及G-111～L-116(G-111,A-112,M-113,F-114,S-115,L-116)。
本發明尤為優選的多核苷酸是那些特征在于編碼TNF-γ的結構或功能特性的多核苷酸。這些多核苷酸編碼的氨基酸殘基包括TNF-γ的α-螺旋和α-螺旋形成區(“α區”)，β-折疊和β-折疊形成區(“β區”)，轉角及轉角形成區(“轉角區”)，卷曲及卷曲形成區(“卷曲區”)親水區，疏水區，α兩親區，β兩親區，表面形成區，及高抗原指數區(即具有三或多個連續氨基酸殘基的抗原區，每個區的抗原指數均高于或等于1.5)。一些優選的區域是圖17中所述那些，并包括但非限于用所述的計算機程序的缺省參數分析圖1(SEQ ID NO:2)中所述氨基酸序列鑒別的上述類型區域，這種優選的區域包括Garnier-Robson α區，β區，轉角區及卷曲區；Chou-Fasman α區，β區及卷曲區，Kyte-Doolittle親水區及疏水區，Eisenberg α和β兩親區，Karplus-Schulz柔性區，Emini表面形成區及高抗原指數的Jameson-Wolf區。
如上關于TNF-γ-α的闡述(見圖17)，代表TNF-γ-β的數據用圖20A和20B及SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列可易于制備。這樣，上面所列的TNF-γ的結構和功能特征(即Garnier-Robsonα區β區，轉角區及卷曲區，Chou-Fasmanα區，β區及卷曲區，Kyte-Doolittle親水區及疏水區，Eisenbergα和β兩親區，Karplus-Schulz柔性區，Emini表面形成區及高抗原指數的Jameson Wolf區等)相等地適用于TNF-γ-α和TNF-γ-β。
一些優選的區域見于圖17所列，但也可以用圖17中的數據列表加以代表或鑒別。用于產生圖17的DNA*STAR計算機程序(設定為原始缺省參數)將易于以此列表格式表示圖17中的數據。圖17中的數據列表格式可用于方便地確定優選區域的特異邊界。
上述圖17中所示優選的區域包括但非限于通過分析圖1A和1B所示氨基酸序列鑒別的上述類型區域。如圖17所示，這種優選的區域包括Garnier-Robosonα區，β區，轉角區及卷曲區，Chou-Fasmanα區，β區及卷曲區，Kyte-Doolittle親水區及疏水區，Eisenbergα和β兩親區，Karplus-Schulz柔性區，Emini表面形成區及高抗原指數的Jameson-Wolf區。
此間最優選的片段是那些包括TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的組合一些結構特征的區域的片段，如一些上述特征(1,2,3或4)。
本發明另外的優選核酸片段包括的核酸分子編碼一或多個TNF-γ多肽的攜帶表位部分。尤其地，本發明的這種核酸片段包括的核酸分子編碼包含SEQ ID NO:2中Thr-24～Asn-32氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Ile-37～Ile-45氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Met-54～Arg-62氨基酸殘基的多肽；包含SEQID NO:2中Gln-63～Asp-71(氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Glu-57～Gly-65氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Val-80～Thr-88氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Leul16～Val124氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Asp133～Phe141氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中。通過如圖17所示的Jameson-Wolf抗原指數分析，這些多肽片段已確定攜帶TNF-γ蛋白的抗原表位。確定TNF-γ的其它這種攜帶表位部分的方法在下文闡述。
攜帶TNF-γ-β蛋白抗原表位的多核苷酸片段，本領域技術人員用上述如圖17所示的Jameson-Wolf抗原分析可易于確定。TNF-γ-β的其它這種攜帶表位部分的方法在下文闡述。
本發明的另外實施方案涉及一種多核苷酸，其優選在嚴格雜交條件下，與本發明多核苷酸的一部分多核苷酸序列雜交，該多核苷酸例如是保藏在ATCC中保藏號75927的cDNA克隆，ATCC保藏號203055的cDNA克隆，或本文所述的TNF-γ多核苷酸片段。“嚴格雜交條件”是指在42℃在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(PH7.6),5×Denhardt’s溶液10％硫酸葡聚糖和20ug/ml變性剪切鮭精DNA中培養過夜，隨后在大約65℃用0.1×SSC中沖洗濾膜。與“一部分”多核苷酸雜交的多核苷酸是指與參照多核苷酸的至少15個核苷酸(nt)，優選至少20個，更優選至少30個，最優選30-70或80-150個nt，或全長序列雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。上述這些多核苷酸可用作診斷探針及引物，并在下文進一步闡述。當然，只與聚腺苷酸序列(如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:19所示TNF-γcDNA的3’末端序列)，或與T(或U)殘基的一段互補序列雜交的多核苷酸，不包括在本發明用于與本發明的核酸的一部分雜交的多核苷酸中，這是因為這種多核苷酸將與含有聚腺苷酸序列或其互補序列的任何核酸分子(例如任何用寡dT作引物產生的雙鏈cDNA克隆)雜交。
在優選的實施方案中，與本文所揭示的參照多核苷酸雜交的多核苷酸，編碼基本保留了與由圖1A和1B(SEQ ID NO:1)和/或圖20A和B(SEQ ID NO:19)或保藏物中cDNA的多核苷酸序列編碼的成熟多肽相同生物學功能和活性的多肽。
另一實施方案涉及與參照多核苷酸(即本文所揭示的多核苷酸)雜交，但未保留生物活性的多核苷酸。這些未保留生物活性的多核苷酸，它們例如可用作SEQ ID NO:1多核苷酸的探針以回收多核苷酸，用作診斷探針及用作PCR引物。
本發明還涉及本發明核酸分子的變體，其編碼TNF-γ蛋白的部分，類似物和衍生物。變體可以是天然發生的，如天然等位基因變體。“等位基因變體”是指基因的幾種可變形式占據了生物體染色體上一給定基因座(基因Ⅱ,Lewin,B.,ed.John Wiley&Sons，紐約(1985))。非天然發生的變體可用本領域已知突變技術產生。
這種變體包括那些通過本文所述多核苷酸序列(包括片段)中的核苷酸取代，缺失或添加而產生的變體。此取代，缺失或添加可以涉及一或多個核苷酸。變體可以在編碼區或非編碼區，或在二區內。編碼區內的變化可產生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。特別優選的是沉默取代，添加及缺失，其不改變TNF-γ蛋白或其部分的性質及活性。保守取代也是特別優選的。
本發明的另外實施方案涉及包含一多核苷酸序列的分離的核酸分子，該多核苷酸序列至少70％或80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％與具有選自以下一組核苷酸序列的多核苷酸相同；(a)編碼具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO:2中除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO:1～147位氨基酸所示氨基酸序列的TNF-γ-α多肽胞外域的核苷酸序列；(e)編碼具有由包含于ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號74927的cDNA克隆HUVEO91編碼的除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(g)編碼具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(h)編碼具有由ATCC中保藏號No.75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的氨基酸序列的TNF-γ-A多肽胞外域的核苷酸序列；(i)編碼本文所述多肽片段的核苷酸序列；及(j)互補于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)，或(i)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本發明的多肽還包括具有與以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)，或(j)中所述氨基酸序列至少80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％相同氨基酸序列的多肽，以及與上述那些序列至少90％，優選至少95％相似氨基酸序列的多肽。
本發明的另外實施方案涉及包含一多核苷酸序列的分離的核酸分子，該多核苷酸序列至少70％或80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％與具有選自以下一組核苷酸序列的多核苷酸相同；(a)編碼具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO:2中除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQID NO:2的-26～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO:1～147位氨基酸所示氨基酸序列的TNF-γ-α多肽胞外域的核苷酸序列；(e)編碼具有由包含于ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號74927的cDNA克隆HUVEO91編碼的除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(g)編碼具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(h)編碼具有由ATCC中保藏號No.75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的氨基酸序列的TNF-γ-A多肽胞外域的核苷酸序列；(i)編碼本文所述多肽片段的核苷酸序列；及(j)互補于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)，或(i)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本發明的多肽還包括具有與以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)，或(j)中所述氨基酸序列至少80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％相同氨基酸序列的多肽，以及與上述那些序列至少90％，優選至少95％相似氨基酸序列的多肽。
具有至少例如95％與本發明參照核苷酸序列“相同”的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列與參照序列是相同的，只是相對于每100個參照的編碼TNF-γ多肽的核苷酸序列之中該序列最多可包含5個點突變。換言之，為獲得具有與參照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的一個多核苷酸，在參照序列中最多5％核苷酸可缺失或用另外的核苷酸取代，或在參照序列可插入最多5％的核苷酸。參照(參比)序列可以是圖1A和B(SEQ IDNO:1)及圖20A和B(SEQ ID NO:19)中所示全部核苷酸序列，或其任何片段。
事實上，任何特定的核酸分子是否與例如圖1A和B(SEQ IDNO:1)，圖20A和B(SEQ ID NO:19)所示核苷酸序列，或與保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同，可常規應用已知計算機程序確定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。Besfits利用Smith和Waterman的局部同源算法(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)，以發現二序列間最佳同源片段。當利用Bestfit或任何其它序列對比程序確定一特殊序列是否例如95％相同于本發明參照序列，當然要設定參數，由此在全長參照序列之上計算相同性百分比，且允許最高達參照序列總核苷數5％的同源性缺口。
在一特異的實施方案中，參照(參比)序列(本發明的序列)與目標序列間的相同性，也指作總體序列對比，用基于Brutlag等的公式(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的FASTDB計算機程序確定。用于DNA序列的FASTDB公式以計算相同性百分率的優選參數是Matrix-Unitary,k-tuple=4,Mismatch Penalty=1,JoiningPenalty=30,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=1,GapPenalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或目標核苷酸序列的長度，無論哪個較短。根據此實施方案，如果因為5’或3’缺失而非內部缺失導致目標序列比參比序列短，要進行手工校正，因為FASTDB程序當計算相同性百分比時不計算目標序列的5’和3’的短缺。對于目標序列相對于查詢序列5’和3’端的短缺，百分比性的校正是通過計算不匹配的位于目標序列5’或3’端的參比序列的堿基數，以作為參比序列總堿基數的百分比。通過FASTDB序列對比的結果來確定一個核苷酸是否匹配。然后將此百分數從相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比結果。此校正的結果可用于本發明。FASTDB序列對比中所顯示出的，只有在目標序列5’或3’端外側的堿基，它們不與參比序列匹配，才用于計算以手工調節百分比相同性結果。例如，一個90個堿基的目標序列與一個100個堿基的參比序列對比以確定相同性百分比。缺失發生于目標序列的5’末端。因此FASTDB比對不顯示出5’端前10個堿基的匹配。這10個不匹配的堿基相當于序列的10％(5’或3’端不匹配的堿基數/參比序列中的堿基總數)，因而從FASTDB程序計算的相同性百分比中減去這10％。如果剩余的90個堿基都完全匹配，那么最終的相同性百分比就是90％。再例如，一個90個堿基的目標序列與一個100個堿基的參比序列相比較，這時缺的的是內部的核苷酸，因而目標序列的5’或3’端堿基沒有與參比序列不匹配的。在這種情況下，FASTDB程序計算的相同性百分比不需手工校正。再強調一次，只有目的序列的5’或3’端堿基與參比序列不匹配時才需要手工校正。對于本發明不需要進行其它的手工校正。
在另一優施方案中，本發明涉及與編碼SEQ ID NO:2的多肽及其片段的多核苷酸以及該多核苷酸所編碼的多肽具有至少70％，優選至少90％，更優選至少95％相同性，其片段具有至少30個堿基且優選至少50個堿基。
在另一優施方案中，本發明涉及與編碼SEQ ID NO:20的多肽及其片段的多核苷酸以及該多核苷酸所編碼的多肽具有至少70％，優選至少90％，更優選至少95％相同性，其片段具有至少30個堿基且優選至少50個堿基。
本發明還包括與圖1A和B(SEQ ID NO:1)，圖20A和B(SEQIDNO:19)所示多核苷酸序列，或者與保藏的cDNA的核酸序列或它們的片段具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同性的核酸分子，而不考慮它們是否編碼具有TNF-γ功能活性的多肽。這是因為即使某個核酸分子不編碼具有TNF-γ活性的多肽，本領域技術人員也知道如何利用該核酸分子，例如用作雜交探針或聚合酶鏈反應(PCR)引物。本發明不編碼具有TNF-γ活性的多肽的核酸分子的應用包括，尤其是(1)從cDNA文庫中分離TNF-γ基因或其等位基因變體；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如“FISH”)以獲得TNF-γ基因的準確染色體定位，如Verma等，人類染色體基本技術手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)中所述；以及(3)Northern印跡分析以檢測特異組織中TNF-γmRNA的表達。
但是，優選的是與圖1A和B(SEQ ID NO:1)，圖20A和B(SEQID NO:19)所示核苷酸序列或與保藏的cDNA的核酸序列具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同性的核酸分子，同時它們編碼具有TNF-γ活性的多肽。“具有TNF-γ活性的多肽”是指在特定的生物學試驗中顯示出類似于但非必須相同于本發明TNF-γ多肽(全長蛋白質或優選成熟蛋白)的活性。例如，測定TNF-γ活性可用如實施例7所述細胞程序死亡分析，通過確定TNF-γ抑制ABAE細胞培養物中FGF-2誘導的類毛細管結構形成的能力，如實施例9中詳述；或用如實施例10中所述的絨毛尿囊膜(CAM)血管生成分析，通過如實施例12所述其對細胞NF-KB和c-Jun激酶(JNK)的活化的影響，及其它實施例中所述及本領域中一些另外方式進行測定。
當然，根據遺傳密碼簡并性，本領域技術人員將能夠馬上意識到有大量的核酸分子，它們具有的序列與保藏的cDNA的核酸序列或者與圖1A和1B(SEQ ID NO:1)，圖20A和B(SEQ ID NO:19)所示的核苷酸序列或它們的片段具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同性，這些核酸分子編碼具有TNF-γ活性的多肽。事實上，由于這些核苷酸序列的簡并性變異，對于熟練的技術人員來說很顯然甚至不需要進行上述的比較試驗。本領域所能進一步理解的是，對于這些非簡并性變異的核酸分子，也有相當的數量都編碼具有TNF-γ活性的多肽。這是因為熟練技術人員完全了解那些較少或者不可能顯著影響蛋白質功能的氨基酸置換(例如以一種脂肪族氨基酸來替換另一種脂肪族氨基酸)。例如關于如何進行表型沉默的氨基酸置換的指導可參見Bowie,J.U.等，“解讀蛋白質序列中的信息氨基酸置換的耐受性”，科學，247:1306-1310(1990)，其中作者在文中提示蛋白質能驚人地耐受氨基酸置換。
本發明還提供了分離的核酸分子，其所包含的多核苷酸編碼TNF-γ多肽的氨基酸序列(如一個本文所述的TNF-γ多肽片段)，此氨基酸序列含有至少1個但不超過50個，優選不超過40個，更優選不超過30個，最優選不超過20個，10-20個，5-10個，1-5個，3-5個或1-3個保守氨基酸取代。當然最優選的是多核苷酸編碼的TNF-γ多肽的氨基酸序列具有不超過10,9,8,7,6,5,4,3,2或1個保守氨基酸取代。
多核苷酸分析本發明還涵蓋了TNF-γ多核苷酸檢測互補多核苷酸的應用，例如作為診斷試劑檢測與存在突變的TNF-γ-α或TNF-γ-β相關的疾病。這種疾病與TNF-γ-α或TNF-γ-β的低表達相關，例如異常細胞增殖如腫瘤及癌癥。
攜帶人TNF-γ基因突變的個體可通過各種技術在DNA水平檢測。用于診斷的核酸可得自患者的細胞，如得自血液，尿液，唾液，組織活檢及尸檢物。基因組DNA可直接用于檢測或可在分析前經PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324:163-166(1986))。也可使用RNA或cDNA。例如，互補于編碼TNF-γ-α或TNF-γ-β的核酸的PCR引物可用于鑒別及分析TNF-γ突變。例如通過對比擴增的產物與正常基因型的大小變化可檢測缺失與插入。點突變可通過擴增的DNA與放射標記的TNF-γ RNA或標記的TNF-γ反義DNA序列雜交得以鑒別。通過Rnase A酶切或解鏈溫度的不同可區分錯配的雙鏈體和充分匹配的序列。
基于DNA序列差異的遺傳測試可通過檢測在含或不含變性劑的凝膠中DNA片段的電泳遷移率的變化而進行。通過高分辨凝膠電泳可觀測小序列缺失及插入。在變性的甲酰胺梯度凝膠上可識別出不同序列的DNA片段，其中不同DNA片段的遷移率根據它們的特異解鏈或部分解鏈溫度停留在凝膠中不同位置(例如參見Myers等，科學230:1242(1985))。
序列在特殊位置的變化也可通過核酸酶保護分析而揭示，如RNase及S1保護或化學切割法(例如Cotton等，PNAS,USA,85:4397-4401(1985))。
因此，檢測特異的DNA序列可通過如雜交，RNase保護，化學切割，直接DNA測序或使用限制酶(例如限制性片段長度多態性(RFLP))及基因組DNA的Southern印跡進行。
除更常規凝膠電泳及DNA測序之外，也可通過原位分析檢測突變。
保藏物是根據國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約進行保藏。在授予專利權后菌株將不受限制地向公眾發放。保藏物的提供僅是為了本領域技術人員的方便而非是對如根據35U.S.C.§112而為用于實施而索取保藏物的認可。當出現與本文描述的序列的任何沖突時，保藏材料中所含的多核苷酸的序列以及由其編碼的多肽的氨基酸序列是參照物。制造、使用或銷售保藏材料需經許可，本文不授予這種許可。
載體及宿主細胞本發明還涉及包括本發明多核苷酸的載體，用本發明的載體進行遺傳工程加工的宿主細胞和通過重組技術生產本發明多肽。
應用本發明的載體，例如可以是克隆載體或表達載體，通過遺傳學(轉導，轉化，或轉染)方法，可以制備工程化的宿主細胞。例如載體的形式可以是質粒，病毒顆粒，噬菌體，等。工程化宿主細胞可以在為活化啟動子，篩選轉化子，或擴增本發明的TNF-γ基因改進的常規營養培養基上生長，。培養條件，如溫度，pH等，應是前面篩選宿主細胞表達所使用的條件，本領域中的熟練技術人員對此非常清楚。
本發明的多核苷酸，借助于重組技術可用于合成多肽。因此，例如，此多核苷酸序列可包括在多種可以表達多肽的表達載體中。這些載體包括染色體，非染色體和合成的DNA序列，如SV40的衍生物，細菌質粒，噬菌體DNA，酵母質粒，質粒和噬菌體DNA共同構建的載體，病毒DNA，如牛痘病毒，腺病毒，禽類痘病毒和假狂犬病毒。但是，只要可以在宿主體內復制、存活，任何質粒和載體均可使用。
有許多方法可以把適當的DNA序列插入到表達載體中。本領域通常采用的方法是把DNA序列插入在一個合適的限制性內切酶的酶切位點。該過程和其他步驟是本領域的熟練的技術人員所熟知的。
表達載體中的DNA序列與一個合適的表達調控序列(啟動子)相連，以指導mRNA的合成。推薦可以使用的啟動子是LTR或SV40的啟動子，大腸桿菌的乳糖操縱子(1ac)或色氨酸操縱子(trp)，λ噬菌體PL啟動子和其他已知的可以調控原核或真核細胞或它們的病毒基因表達的啟動子。表達載體還含一個翻譯起始的核糖體結合位點和一個轉錄終止子。載體還含有提高表達的合適的序列。
另外，表達載體應該優選含有至少一個選擇標記基因，生成特異的表型特征，用來篩選轉化的宿主細胞。這些標記基因有用于真核細胞培養的二氫葉酸還原酶(DHFR)或新霉素抗性基因，以及用于大腸桿菌或其他細菌培養的四環素或氨芐青霉素抗性基因。
含有如本文上述所列出的適當DNA序列和啟動子或調控序列的載體，可用于轉化合適的宿主，使宿主表達蛋白。
推薦使用的適當宿主的實例包括，但不僅限于這些細菌細胞，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和鏈霉菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動物細胞如CHO、COS和Bowes黑素瘤以及；腺病毒；植物細胞等。合適宿主的選擇對本領域熟練的技術人員而言是不成問題的。
更為特殊的是，本發明還包括含有一個或多個上面已充分描述的DNA序列的重組構建體。重組構建體含有一個載體，如質粒或病毒載體，并插入本發明的序列，該序列在載體中可以為正向，也可以為反向。在一個優選的實施方案中，重組構建體還含有調節序列，例如包括啟動子，可操縱與基因序列相連。有大量合適的載體和啟動子為本領域熟練技術人員所熟知，并且已有商業化的產品供應。以下順便列舉常使用的載體；細菌pHE4-5(ATCC登錄號209311及其變體)，pQE70,pQE60,pQE-9，從Qiagen公司可以獲得；pBS,pD10,Phagescript,psiX174,Bluescript SK,pbsks,pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A，可以從Stratagene公司獲得；ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5，可從Pharmacia公司獲得；真核載體pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1和pSG，可從Stratagene公司獲得；pSVK3,pBPV,pMSG和pSVL，可以從Pharmacia公司獲得。其他合適的質粒載體也可使用，只要其在宿主中可復制和存活。
借助CAT(氯聚素轉移酶)載體或其他帶有選擇標記載體，可以從任何所需基因中選擇啟動子區。兩個合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提及的細菌啟動子包括lacI,lacZ,T3,T7,gpt,λ噬菌體的PR、PL和trp。真核的啟動子包括CMV的立刻早期啟動子，HSV-tk，早期和晚期SV40，逆轉錄病毒的LTR，和小鼠的金屬硫蛋白-Ⅰ。選擇合適的啟動子和載體對本領域的專業技術人員而言已是一常規技術。
在另一個實施方案中，本發明涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高等的真核細胞，例如哺乳動物的細胞，或者是低等的真核細胞，如酵母細胞，或者也可以是原核細胞，例如細菌細胞。應用下列方法可以把重組體導入宿主細胞中，如磷酸鈣轉染法，DEAE-纖維素介導的轉染法，電穿孔法，轉導，感染，或者其他方法(Davis,L，等，分子生物學的基本方法，1986)。
除包括本文所討論的攜帶載體構建體的宿主細胞外，本發明還包括來自脊椎動物的原代，第二代和永生化的宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞，這些細胞已經工程化，并已刪除或取代內源性的遺傳物質(如TNF-γ編碼序列)和/或包括與本發明的TNF-γ序列有關的具有調控功能的遺傳物質(異源性啟動子)，它可以激活，改變和/或增加內源性TNF-γ多核苷酸。例如，本領域所熟悉的技術方法，可以用于經同源重組可操縱地結合異源性調控區(如啟動子和/或增強子)和內源性TNF-γ多核苷酸序列(見，如美國專利第5641670號，1997年6月24日授權；國際公開WO96/29411,1996年9月26日出版；國際公開WO94/12650,1994年8月4日出版；Koller等，美國科學院研究進展，1989,86:8923-8935和Zijlstra等，自然，1989,342:435-438；每篇文章引入本文作參考)。
宿主細胞中的構建體可以很方便的用來合成由重組序列編碼的基因產物。另外，本發明的多肽可以用普通的多肽合成儀進行人工合成。
成熟蛋白質在合適啟動子調控下，可以在哺乳細胞，酵母，細菌，或其他細胞中表達。用不含細胞的翻譯體系，借助于本發明所構建的DNA構建體的RNA，合成所需要的蛋白質。根據所使用的原核與真核宿主的不同，選擇合適的克隆和表達載體，這一點，Sambrook，等已在其編著的“分子克隆實驗指南”(第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989年)，其引入本文作參考文獻。
高等真核生物對編碼本發明多肽的DNA的轉錄可通過在載體中插入一個增強子后而增強。增強子為DNA的順式激活元件，通常長為10-300bp(堿基對)，可以作用于啟動子以增強其轉錄。例子包括在復制起點晚期一側100-270bp的SV40增強子，巨細胞病毒的早期啟動子增強子，位于復制起始位點晚期側的多瘤增強子，腺病毒增強子。
通常，重組表達載體包括復制起點和允許宿主細胞轉化的選擇標記如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因，啤酒酵母TRP1基因和來自高效表達基因的啟動子，指導下游結構基因的轉錄。這些啟動子可以是編碼糖原分解酶的操縱子，如3-磷酸甘油激酶(PGK),α-因子，酸性磷酸酶，或者熱休克蛋白等。異源的結構序列在合適的時期與翻譯起始位點和終止序列以及前導序列進行裝配，前導序列具有指導翻譯蛋白分泌到周質空間或胞外培養基中。任選地，異源序列可以編碼一種融合蛋白，包括具有所需特征的N端識別肽，如穩定重組蛋白或易于純化。
細菌用表達載體的構建是將一個編碼所需蛋白的結構DNA序列插入載體，與帶有合適的翻譯起始和終止信號，功能啟動子可以調控序列的讀碼。載體將含有一個或多個表型選擇標記和一個復制起始位點，以確保載體在宿主中擴增，維持載體。適合轉化的原核宿主包括大腸桿菌，枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和各種假單胞菌屬，鏈霉菌和葡萄球菌屬的菌種，當然其它菌也可以使用。
作為推薦用表達載體，并不僅限于這些實例，較常用的細菌表達載體含有一個選擇性標記和細菌的復制起始位點，后者可以從商業化質粒的遺傳元件中獲得，該質粒包括廣為熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)。此類商業化的載體包括，例如pKK223-3(Pharmacia精細化學試劑公司，阿普薩拉，瑞典)和GEM1(Promega生物技術公司，麥迪遜，威斯康星，美國)。這些pBR322的“骨架”部分是由一個合適的啟動子和表達的結構基因序列共同構成。
先進行合適宿主株的轉化，并使宿主株長到合適的細胞密度，接著使用適當的方法(如改變溫度或化學物質誘導)，誘導所選啟動子，再將細胞培養一段時間。細胞的收獲通常采用離心的方法，用物理或化學的方法進行破壞，這樣所得到粗提物以備進一步純化。
用于表達蛋白質的微生物細胞可以使用任何常用的方法進行破壞，這一點本領域里的熟練技術人員非常清楚，包括反復凍融，超聲波，機械性破壞，或使用細胞裂解劑。
各種哺乳細胞培養體系也可用于表達重組蛋白。哺乳表達體系的實例包括猴腎成纖維細胞的COS一7細胞系，由Gluzman報道，細胞，1981,23:175，以及其它能表達相應載體的細胞系，如C127,3T3,CHO,Hela和BHK等細胞系。哺乳類的表達載體將含有一個復制起始位點，一個合適的啟動子和增強子和任何必需的核糖體結合位點，多聚腺苷化位點，剪接“供體和受體”點，轉錄終止序列和5’側區非轉錄序列。來自SV40剪接體的DNA序列和多聚腺苷化位點可以提供所需非轉錄的遺傳元件。
采用如下方法，可以從重組細胞的培養物中獲得和純化多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和疑集素層析。在純化過程中，最好含有低濃度(約0.1-5mM)鈣離子(Price等，生物化學雜志，1969,244:917)。必要時，可以對蛋白質進行重新折疊，以獲得天然蛋白質的完整構象。最后用高效液相色譜(HPLC)進行最后的純化。
本發明中的多肽可以是天然的純化產物，或化學法人工合成的產物，或通過重組技術由原核或真核宿主產生(如，培養的細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞)。根據在重組生產過程中所使用的宿主，本發明的多肽可以糖基化的或不發生糖基化。本發明的多肽還可以含有一個起始的甲硫氨酸殘基。
另外，應用本領域中已知的技術，本發明的多肽可以化學合成例如，相應于本發明的多肽TNF-γ-α和TNF-γ-β的中段的肽可以用肽合成儀進行合成。再者，必需時，可以把非典型氨基酸或氨基酸的化學類似物作為替代物或附加物，引入TNF-γ多核苷酸序列。不典型氨基酸包括，但不僅限于普通氨基酸的D型同分異構體，2,4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基異丁酸，Abu,2-氨基丁酸，g-Abu,e-Ahx,6-氨基己酸，Aib,2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環己丙氨酸，b-丙氨酸，氟代氨基酸，含修飾基團的氨基酸，如b-甲基氨基酸，鈣-甲基氨基酸，鈉-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸的類似物。再者，氨基酸可以為D型(右旋)亦可以為L型(左旋)。
本發明人已產生了至少15種TNF-γ-α表達構建體，以促進各種大小的TNF-γ多肽產生及在一些系統中產生。其中4個被構建為編碼全長TNF-γ多肽。此全長構建體是(ⅰ)pQE9TNFg-27/147,(ⅱ)pQE70TNFg,(ⅲ)pC1TNFg，和pcDNA3TNFg。在所列的第一種表達構建體(pQE9TNFg-27/147)中，此構建體根據實施例1的方法，用于生產具有N末端6個組氨酸標記的全長TNF-γ-α多肽。缺失組氨酸標記的全長TNF-γ-α多肽可基本如實施例1中所進行的，通過用pQE70TNFg構建體在細菌中生產。另外，根據實施例3的方法，通用pC1TNFg或pcDNA3TNFg構建體，在哺乳動物細胞中生產缺失組氨酸標記的全長TNF-γ-α多肽。進一步地，成熟TNF-γ-α多肽在稱為pcDNA3/IL6TNFg-1/149的構建體中在白細胞介素(IL)-6信號肽的引導下，從哺乳動物細胞中產生及分泌(見實施例11)。
所剩其它TNF-γ-α表達構建體用于從細菌，桿狀病毒，及哺乳動物系統中表達各種TNF-γ突變蛋白。用pQE60細菌表達載體已產生4個N-末端缺失突變體。這些N末端缺失突變構建體是(ⅰ)pQE60TNFg-3/147(代表可能的成熟TNF-γ多肽；由此構建體表達的多肽與SEQ ID NO:20的TNF-γ-β的107-251位氨基酸殘基相同)，(ⅱ)pQE60TNFg12/147(代表SEQID NO:2的12-147氨基酸殘基，和SEQ ID NO:20的116-251氨基酸殘基)，(ⅲ)pQE60TNFg22/147(代表SEQ ID NO:20的22-147氨基酸殘基及126-251氨基酸殘基)，及(ⅳ)pQE60TNFg28/147(代表SEQ ID NO:20的28-147氨基酸殘基及132-251殘基)。每個這些表達構建體可用于在細菌中生產這樣的TNF-γ多肽，其相對于全長TNF-γ-α多肽分別呈N末端缺失25,39,49及55個氨基酸，相對于全長TNF-γ-β多肽，分別呈N末端缺失106,115,125及131個氨基酸。
其它N末端缺失突變細菌表達構建體已經產生。一個稱為pHE4VEGI T30-L174的構建體用細菌表達載體pHE4已經產生，其表達圖1A和1B所示TNF-γ-α序列的蘇氨酸-30至亮氨酸174的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的蘇氨酸3至亮氨酸-147的氨基酸殘基)，此序列精確地相應于圖20A和20B所示TNF-γ-β序列的蘇氨酸107至亮氨酸-251的氨基酸殘基(SEQ ID NO:20的蘇氨酸-107至亮氨酸-251)。另外的產生的細菌表達構建體包括pQE9.VEGI.his.T28-L174,pHE4.VEGI.T28-L174,pHE4.VEGI.T51-L174，及pHE4.VEGI.T58-1174。這些構建體基于pQE9或pHE4細菌表達載體。此構建體的名稱表示表達載體，基因名，及由此構建體表達的氨基酸殘基(例如pQE9.VEGI.T28-174表示pQE9細菌表達載體用于表達TNF-γ-α多肽的蘇氨酸(T)-28至亮氨酸(L)-174的氨基酸(VEGI是TNF-γ-α的實驗名稱))。
可用于從哺乳動物系中生產分泌的成熟TNF-γ多肽的TNF-γ表達構建體已經產生。此構建體稱為pC1/IL6 TNFg-3/147。其編碼從人IL-6基因而來的信號肽與成熟TNF-γ序列的融合。一個相似的構建體已經產生，其表達與TNF-γ-α的12-149氨基酸的氨基末端(SEQ ID NO:2，即TNF-γ-β的116-251氨基酸(SEQ ID NO:20))融合的CK-b8信號肽，(該信號肽含有1995年6月23日申請的PCT申請PCT/US95/09058中揭示的CK-b8序列的-21至-1氨基酸)，其是基于pC4哺乳動物表達載體。此構建體稱為pC4/CK-b8 TNFg12/147。此構建體的變體已產生，其能表達在TNF-γ羧基端融合有人IgG Fc區的TNF-γ的12-147氨基酸。此融合蛋白也在CK-b8信號肽的引導下分泌，并被稱為pC4/CK-b8 TNFg12/147/Fc。此融合分子的人Fc部分的序列示于SEQID NO:18。本領域技術人員已知其它可使用的序列。
TNF-γ-α的-3至147氨基酸(SEQ ID NO:2)；其相應于TNF-γ-β的102-251氨基酸殘基(SEQ ID NO:20))，通過用稱為pA2GP TNFg-3/147的構建體可從桿狀病毒系統中表達和分泌。此表達構建體編碼在其氨基末端融合有桿狀病毒GP信號肽的成熟TNF-γ編碼序列。
兩個逆轉錄病毒TNF-γ表達構建體也已經產生。第一個稱為pG1SamEN/TNFg-3/149。此表達構建體用于從哺乳動物系統中生產全長TNF-γ蛋白。一個相關的構建體pG1Sam EN/CK-b8TNFg12/149已經產生，其可用于在CK-b8信號肽的引導下從哺乳動物系統中生產及分泌成熟TNF-γ蛋白。
本發明的其它多肽包括與上述多肽具有至少90％，優選至少95％，更優選至少96％,97％,98％或99％相似性的多肽。本發明的多肽還包括那些與保藏的cDNA編碼的多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％，優選至少90％或95％，更優選至少96％,97％,98％，或99％相同性的多肽，并還包括這種多肽的至少30個優選至少50個氨基酸的一部分。
多肽及片段本發明進一步涉及了具有圖1A和1B(SEQ ID NO:2)推導出的氨基酸序列的，或由保藏的cDNA HUVEO91所編碼的氨基酸序列的多肽，以及這些多肽的片段，類似物和衍生物。
本發明還涉及具有圖20A和20B(SEQ ID NO:20)推導出的氨基酸序列的，或由保藏的cDNAHEMCZ56所編碼的氨基酸序列的多肽，以及這些多肽的片段，類似物和衍生物。
本發明的多肽和多核苷酸優選地以分離的形式提供，并且優選地純化至同質程度。術語“分離的”是指材料是從其原始環境(例如，天然環境，如果它是天然產生的)中分離的。例如，存在于活動物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分離的，但是從一些或者全部共同存在于天然體系的物質中分離出來的同樣的多核苷酸或DNA或多肽就是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是一種組合物的一部分，而在這種載體或組合物之中它仍然是分離的而非其天然環境中的一部分。分離的多肽也指已部分或基本從重組宿主細胞中純化的多肽。例如，通過由Smith和Tohnson所述的一步法(基因6:31-40(1988))可基本純化TNF-γ多肽的重組生產的形式。根據本發明的分離的多肽和多核苷酸也包括天然或合成產生的這種分子。本發明的多肽和多核苷酸利用本發明的抗TNF-γ抗體，通過本領域熟知的蛋白質純化法可從天然或重組源料中純化。
術語“片段”，“衍生物”及“類似物”當指圖1A和1B或圖20A和20B的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時，是指保留了TNF-γ的功能活性即具有與圖1A和1B(SEQID NO:2)，圖20A和20B(SEQ ID NO:20)所示的和/或由一或二個保藏的cDNA克隆(HUVEO91和HEMCZ56)編碼的全部和/或成熟TNF-γ多肽相同的一或多種功能活性的多肽。例如，這種具有所需免疫原性或抗原性的片段，衍生物或類似物可以用于免疫分析，用于免疫接種，用于抑制TNF-γ活性等。因此，本發明一個特異實施方案涉及一種TNF-γ片段，其可被特異結合圖1A和B(SEQ ID NO:2)，圖20A和20B(SEQ ID NO:20)所示的，和/或由一或兩個保藏的克隆(HUVEO91和HEMCZ56)編碼的TNF-γ多肽序列的抗體結合。
另外，本發明提供了具有TNF-γ生物學活性的TNF-γ的片段，衍生物或類似物(例如TNF-γ-β多肽的胞外域或成熟TNF-γ-α多肽)。保留或另外缺失了所需相應的TNF-γ性質的TNF-γ的片段，衍生物及類似物可分別用作這種性質及生理相關性的誘導劑或抑制劑，所需相應的TNF-γ性質例如是抑制細胞增殖，腫瘤抑制，抑制血管生成，通過抑制與破壞骨及軟骨血管翳相關的血管生成和/或內皮細胞增殖而抗關節炎，NF-kB和c-Jun激酶(JNK)的誘導劑，細胞粘附的誘導劑，及細胞程序死亡的誘導劑(見實施例，尤其實施例12-15)。
本發明的多肽可以具有跨膜區及胞內和胞外域的膜結合受體的方式存在，或者它們以溶解方式存在，其中沒有跨膜區。這種形式的TNF-γ例如是圖20A和20B(SEQ ID NO:20)所示TNF-γ-β多肽序列，其含有一跨膜區，胞內區和胞外域。
在本領域中能夠認識到的是，TNF-γ的一些氨基酸序列可以改變而不顯著地影響該蛋白的結構或功能。如果要考慮序列上這類差異，那么應當記住的是該蛋白上有決定活性的重要區域。因此，本發明進一步包括TNF-γ多肽的變異體，它們可表現出基本的TNF-γ活性的，或者含有TNF-γ蛋白區域諸如本文中描述的多肽片段。這種突變包括缺失、插入、倒置、重復和類型置換。如上所述，關于如何進行表型沉默的氨基酸置換的指導可以參見Bowiem,J.U.等“解讀蛋白質序列中的信息氨基酸置換的耐受性”科學，247:1306-131(1990)，其中作者指出有二種主要方法研究氨基酸序列對變化的耐受性。第一種方法依賴于進化過程，其中突變體通過天然選擇被接受或排斥。第二種方法用遺傳工程在克隆的基因的特定位置導入變化的氨基酸，并進行選擇或篩選以鑒別保持功能的序列。如作者所示，這些研究表明蛋白質對氨基酸取代有令人驚奇的耐受性。作者還指出在蛋白質的某一位置氨基酸改變似乎是允許的。例如，大多數隱蔽的氨基酸殘基要求非極性側鏈，而只有少數表面側鏈通常是保守的。其它這種表型沉默取代如Bowie所述，在此并入參考。典型的保守取代是脂肪族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile之間的彼此置換；羥基殘基Ser和Thr間的互換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln間的取代，堿性殘基Lys和Arg間的交換，及芳香族殘基Phe和Thr間的置換。
因此，圖1或2的或由保藏的cDNA所編碼的氨基酸序列的多肽的片段、類似物和衍生物可以是(Ⅰ)其中的一個或多個氨基酸殘基被保守型或非保守型氨基酸殘基(優選的為保守型氨基酸殘基)所取代，而且這種取代氨基酸殘基可以是也可以不是遺傳密碼所編碼的；或者(Ⅱ)其中的一個或多個氨基酸殘基含有取代基團；或者(Ⅲ)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，諸如能夠增強多肽半衰期化合物(例如，聚乙二醇)；或者(Ⅳ)其中添加的氨基酸與上述形式多肽相融合，諸如IgG Fc融合區肽或前導或分泌序列或用于上述形式多肽或蛋白原序列的純化的序列。從本文的敘述中本領域的熟練技術人員應當能夠了解這些片段、類似物和衍生物。
因此，本發明的TNF-γ可包括來自天然的突變或者人工操作的一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加。正如所表明的，優選的改變是非本質性的，諸如不會顯著地影響蛋白質的折疊或活性的保守型氨基酸取代(見表1)。表1保守型氨基酸取代
本發明涉及的多肽包含所述TNF-γ多肽的氨基酸序列，但與所述TNF-γ多肽序列相比，其具有含有至少1個但不超過50個，優選不超過40個，更優選不超過30個，最優選不超過20個保守氨基酸取代的氨基酸序列。當然，最優選的肽或多肽具有TNF-γ多肽的氨基酸序列，該TNF-γ多肽的氨基酸序列含有至少1個但不超過10,9,8,7,6,5,4,3,2或1個保守氨基酸取代。
在另一特異實施方案中，圖1A和B(SEQ ID NO:2)，圖20A和B(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列，由保藏的克隆編碼的多肽序列，和/或本文所述任何多肽片段(例如胞外域或胞內區)中取代，添加或缺失的數目是75、70、60,50,40,35,30,25,20,15,10,9,8,7,6,5,4,3,2,1或150-50,100-50,50-20,30-20,20-15,20-10,15-10,10-1,5-10,1-5,1-3或1-2。
為改良或改變TNF-γ多肽的性質，可利用蛋白質工程。本領域技術人員已知的重組DNA技術可用于產生新的突變體蛋白或突變蛋白或融合蛋白，此突變蛋白包括一或多個氨基酸取代，缺失，添加。這種修飾的蛋白質可示出例如增強的活性或提高的穩定性。另外，它們可以高產量純化并至少在一定的純化及貯藏條件下比相應天然多肽呈現較好的溶解性。
因此本發明也涵蓋了具有一或多個氨基酸殘基缺失、添加或取代的TNF-γ的衍生物和類似物，以產生更適于在選擇的宿主細胞中的表達的TNF-γ多肽。例如，半胱氨酸殘基可缺失或用另一氨基酸殘基取代以消除二硫鍵；N連接的糖基化位點可改變或消除以獲得均一產物的表達，該均一產物更易于從酵母宿主已知高糖基化N端連接的位點中回收及純化。至此，本發明TNF-γ多肽中任何一個或多個糖基化識別序列上第1個或第3個或這兩個氨基酸位上的各種氨基酸取代，和/或任何一個或多個這種識別序列的第二個氨基酸位的氨基酸缺失，將防止TNF-γ多肽在修飾的三肽序列糖基化(例如見Miyajimo等，EMBOJ 5(6):1193-1197)。
本發明TNF-γ蛋白質中為功能所必需的氨基酸可通過本領域已知方法鑒別，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學244:1081-1085(1989))。后一方法在分子中任一殘基上引入單一丙氨酸突變。然后將獲得的突變分子進行生物學活性測驗如受體結合或體外增殖活性。
所特別感興趣的取代是將帶電荷氨基酸用另一個帶電荷的氨基酸或用中性的氨基酸取代，可產生具有較高所需改良性質的蛋白質，如低凝聚性。蛋白質凝聚不僅降低活性而且還會在制備藥學配方中產生問題，因為凝聚能產生免疫原性(Pinckard等，臨床實驗免疫學，2:331-334(1967)；Robbins等，糖尿病，36:838-845(1987)；Cleland等，治療性藥物載體系統評論，10:307-377(1993))。
由于TNF-γ是TNF相關的蛋白質家族的成員，為調整而不是完全消除TNF-γ的生物活性，優選在編碼保守的類TNF區即SEQID NO:2的17-147位或SEQ ID NO:20的121-251位的氨基酸中，更優選在該區域中的所有的TNF相關蛋白持家族的成員中都不是保守的殘基中進行添加，取代或缺失(見圖2A-2C)。也是本發明一部分的是包含編碼以上TNF-γ變體的核酸序列的分離的多核苷酸。
TNF-γ多肽的一些氨基酸在TNF相關的蛋白質家族的已知成員中是高度保守的。在TNF-γ的以下這些殘基中進行特異突變，將觀測到對生物活性的可查影響，這些殘基是酪氨酸-15(在SEQ IDNO:2中的位置數)，亮氨酸-35，甘氨酸-41，酪氨酸-43，酪氨酸-46，谷氨酰胺-48，亮氨酸-90，亮氨酸-116，甘氨酸-119，天冬氨酸-120，苯丙氨酸-141，苯丙氨酸-142，及亮氨酸-147。這些相同的氨基酸殘基當然存在于SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β的相應位置。
本發明還包括上述TNF-γ多肽的片段。本發明的多肽片段包含有SEQ ID NO:2中氨基酸序列的多肽，由保藏的克隆(HUVEO91)中cDNA編碼的多肽，或由與保藏的克隆中核苷酸序列，如圖1A和B(SEQ ID NO:1)和/或圖20A和20B(SEQ ID NO:19)所示核苷酸序列，或其互補鏈雜交(如在嚴格雜交條件下)的核酸編碼的多肽。
多肽片段可以是“自立的”或者包含在一個較大的多肽之內，而該片段構成其中的一部分或一個區域，優選的作為一個單獨的連續的區域。本發明的多肽片段的代表性實例包括例如以下片段SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:20的大約第1至20位氨基酸，21-40,41-60,61-83,84-100,101-120,121-140,141-160,160-167,161-174,161-180,181-200,201-220,221-240,241-251位氨基酸。而且，多肽片段的長度可以大約為20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140或150個氨基酸。文中“大約”包括了所特別提及的范圍，在上和/或下限增加或減少幾個(5,4,3,2或1)氨基酸。
在其它實施方案中，本發明多肽的片段(即在此所述的那些)的長度不超過250,225,200,185,175,170,165,160,155,150,145,140,135,130,125,120,115,110,105,100,90,80,75,60,50,40,30，或25個氨基酸。
另外優選的實施方案涵蓋的多肽片段包括或由TNF-γ-α的成熟區(SEQ IDNO:2的1-147殘基)，TNF-γ-β的胞內區(SEQID NO:20的1-35氨基酸殘基)，TNF-γ-β的跨膜區(SEQ IDNO:20的36-61氨基酸殘基)，和/或TNF-γ-β的胞外域(SEQID NO:20的62-251氨基酸殘基)組成。
本發明的多肽片段包括或由SEQ ID NO:2的亮氨酸-35～纈氨酸-49，色氨酸-104～亮氨酸-116，甘氨酸-119～絲氨酸-127，賴氨酸-139～亮氨酸-147的氨基酸殘基組成。這些區域通過與圖2A,2B和2C所示TNF家族成員多肽相對比，鑒別為是高度相同的區域。
優選的是具有結構或功能特征的TNF-γ的片段。這種片段包括的氨基酸殘基含有TNF-γ的α螺旋和α螺旋形成區(“α區”)，β折疊和β折疊形成區(“β區”)，轉角和轉角形成區(“轉角區”)，卷曲和卷曲形成區(“卷曲區”)，親水區，疏水區，α兩親性區，β兩親性區，表面形成區及高抗原性指數區(即由具有抗原指數等于或高于1.5的氨基酸殘基組成的多肽區域，抗原指數用Jameson-Wolf程序的缺省參數鑒定)。一些優選的區域是圖17中揭示的那些，并包括但非限于通過分析圖1A和B推導的氨基酸序列鑒別的上述類型的區域，這種優選的區域包括Garnier-Robson推測的α區，β區，轉角區及卷曲區；Chou-Fasman推測的α區，β區，轉角區及卷曲區；Kyte-Doolittle推測的親水區及疏水區；Eisenberg的α和β兩親性區；Emini的表面形成區；及Jameson-Wolf的高抗原性指數區，這是用這些計算機程序的缺省參數推測的。本發明還包括編碼這些多肽的多核苷酸。
另外，本發明的類似物包括一種蛋白原，其能通過切割蛋白原部分被活化，以產生活性的成熟多肽。
在另一實施方案中，本發明提供了包括或由本發明多肽攜帶表位部分組成的TNF-γ多肽(例如片段)。此多肽部分的表位是本發明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指蛋白質的一部分，當本發明的全蛋白是免疫原時，該蛋白質的部分在體內可產生抗體應答。另一方面，多肽的一個可以結合抗體的功能區被稱為“抗原性表位”。一個蛋白在體內的免疫原性表位數通常少于抗原性表位數(見如，Geysen等，美國科學院研究進展，1983,81:3998-4002。
為選擇攜帶抗原性表位的肽或多肽(即含有抗體可結合的蛋白質分子的區域的肽或多肽)，本領域熟知模擬蛋白質一部分的相對短的合成肽能引發與部分模擬的蛋白質反應的抗血清(見如Sutcliffe,J.G.等，科學219:660-666(1983))。能引發蛋白質反應性血清的肽經常以蛋白質初級序列表示，該肽可通過一系列簡單化學規則定性，并限定為即不是完整蛋白質的免疫優勢區(即免疫原性表位)，也不是氨基或羧基端。本發明的攜帶抗原性表位的肽和多肽因而用于產生抗體包括與本發明多肽特異結合的單克隆抗體(見如，Wilson等，細胞3,7:767-778(1984))。
本發明的攜帶抗原性表位的肽和多肽優選含有本發明多肽氨基酸序列內的至少7個，優選至少9個，更優選至少大約15-30個氨基酸。可用于產生TNF-γ特異性抗體的抗原性多肽或肽的非限制性實例包括含有SEQ ID NO:2中大約Thr-24～Asn-2氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大約Ile-37～Ile-45氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大約Met-54～Arg-62氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大約Gln-63～Asp-71氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大約Glu-57～Gly-65氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大約Val-80～Thr-88氨基酸殘基的多肽；含有SEQID NO:2中大約Leu-116～Val-124氨基酸殘基的多肽；含有SEQ IDNO:2中大約Asp-133～Phe-141氨基酸殘基的多肽；這些多肽通過如圖17中所示Jameson-Wolf抗原性指數分析，已確定為攜帶TNF-γ蛋白的抗原性表位。
本領域熟練技術人員通過使用缺省參數對TNF-γ-β多肽序列(SEQ ID NO:20)進行DNA*STAR分析制備的數據并選擇高抗原指數區，可容易地確認TNF-γ-β多肽的抗原區。
另一方面，本發明提供了包含本發明多肽攜帶表位部分的肽和多肽。這些表位是本發明多肽的免疫原性或抗原性多肽。“免疫原性表位”是指當本發明的多肽的全部或其片段是免疫原時，引發體內抗體應答的蛋白質一部分。另一方面，多肽的一個可以結合抗體的功能區被稱為“抗原決定簇”或“抗原性表位”。一個蛋白在體內的免疫原性表位數通常少于抗原表位數。見如Geysen等，美國科學院研究進展，1983,81:2998-4001。但是，不管它是否為免疫原性表位，可以應用噬菌體展示等方法，制備任何抗原表位的抗體。見如Petersen,G.等，分子普通遺傳學，1995,249:425-431。因此，本發明中所涉及的既是免疫原性表位，也是抗原性表位。
包含免疫原性表位的氨基酸序列已列表在上文舉例說明。所列出的免疫原性表位只列出含有推測有最高抗原性的表位的氨基酸殘基，是用Jameson和Wolf,(1988)Comp.Appl.Biosvi 4:181-186的程序推測的(在此全部并入參考)。Jameson-Wolf抗原性分析用PROTEAN計算機程序，用缺省參數進行(Version 3.11 forthe PowerMacIntosh,PNASTAR,Inc.1228 South Park Street Medison,WI)。未列于以上免疫原性表位表中的多肽的一部分未被認為是非免疫原性的。上文列出的免疫原性表位是舉例列出而非完全列出，因為其它免疫原性表位通過所用的特殊程序未被識別。含有其它免疫原性表位的氨基酸用類似于Jameson-Wolf的程序或用本領域已知方法體內測試抗原性應答可常規確定。見如Geysen等所述；美國專利4708781；5,92；及5480971。(所述參考文獻在此全部并入參考)。
特別要指出的是，免疫原性表位包括根據Jameson-Wolf分析預計的關鍵氨基酸殘基。因此，在N末端，C末端或N,C兩端的附加的旁側殘基可以添加到這些序列上，合成本發明表位的多肽。因此，免疫原性表位可以包括附加的N末端或C末端的氨基酸殘基。附加的旁側氨基酸殘基可以是來自本發明的多肽的連續旁側N-末端和/或C-末端序列，異源性多肽序列，或可包括本發明的多肽的連續旁側序列和異源性多肽序列。
含有免疫原性或抗原性表位的本發明多肽至少有7個氨基酸殘基長。“至少”意思是含有免疫原性或抗原性表位的本發明多肽，長度至少有7個氨基酸殘基或者在7個氨基酸與本發明多肽的全長氨基酸數之間任何整數。優選含有免疫原性或抗原性表位的多肽至少有10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95，或100個氨基酸殘基長。但是，需要指出的是，每個和每次在7個氨基酸和全長多肽的氨基酸殘基數之間的每個整數，也包括在本發明中。
攜帶免疫原性和抗原性表位的片段可通過上述的連續氨基酸數目進行說明，或通過這些片段的N末端和C末端在SEQ ID NO:2中的位置進一步說明。本發明還包括每一種的N末端和C末端位置的組合，例如該片段長度至少為7個或至少15個連續的氨基酸殘基的片段，可以占據SEQ DI NO:2的氨基酸序列。再者，“至少7個連續的氨基酸殘基長”意思是長度為7個氨基酸殘基，或在7個氨基酸與本發明全長多肽的氨基酸數之間的任何整數。尤其是7個氨基酸和全長多肽的氨基酸殘基數之間的每個整數，也包括在本發明中。
例如，具有免疫原性和抗原性表位的本發明多肽可用于制備可特異結合本發明多肽的抗體，借助免疫方法檢測本發明的多肽。例如，抗體對本發明的多肽進行親和純化時非常有用。抗體還可以常規地用于多種定性或定量免疫方法中，尤其在應用本領域中所熟知的方法，可以對本發明的多肽進行檢測。見，如Harlow，等，抗體實驗指南，冷泉港實驗室出版社，第二版，1988。
本發明的含有表位的多肽可以通過本領域所熟知的化學合成法和重組方法產生。例如，帶有表位的多肽可以用已知的化學合成法進行合成。例如，Houghten已經描述了一種簡單的用于合成大量多肽的方法，例如10-20毫克的248種不同的長度為13個氨基酸殘基的多肽，這些多肽分別代表HA1多肽的片段的單個氨基酸變異，所有這些多肽的制備和鑒定(利用ELISA結合法進行研究)耗時不到4周的時間(Houghten,R.A.，美國科學院研究進展，1985,82:5131-5135)。這種“同時多個肽合成(SMPS)”方法在Houghten及其同事的美國專利4,631,211中進一步描述。在該方法中，固相合成各種多肽所用的不同的樹脂存在于各個溶劑可透過的袋子中，保證固相法中的許多相同的重復步驟得以最優化利用。完全的手工操作過程可以同時進行500-1000種或更多的肽合成(Houghten，等，美國科學院研究進展，1985,82:5131-5135中的第5134頁)。
根據本領域所熟知的方法，包括但不僅限于，直接體內免疫，體外免疫和噬菌體展示等方法，本發明的含有表位的多肽可用于誘導抗體的產生。見，例如Sutcliffe，等，見上述；Wilson，等，見上述，和Bittle，等，普通病毒學雜志，1985,66:2347-2354。如果動物直接進行體內免疫，可以應用游離的肽；但是，抗肽抗體的滴度通過肽與一種大分子載體，如匙孔嘁血蘭蛋白(KLH)或破傷風類毒素的偶聯可得以加強。例如，含有半胱氨酸殘基的肽可以應用連接子如馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)與載體偶聯，而其他肽可以應用更常見的連接試劑如戊二醛與載體偶聯。兔子、大鼠和小鼠等動物既可以用游離的肽，也可以用與載體偶聯的肽進行免疫，例如，通過向腹腔注射和/或皮內注射含有約100微克的肽或載體蛋白和弗氏(Freund)佐劑。需要幾次加強注射，如間隔為兩周，以獲得高滴度的抗肽抗體，例如可以應用吸附在固相上的游離肽，借助于ELISA法進行檢測。免疫動物血清中抗肽抗體的滴度通過抗肽抗體的篩選而增加，例如，根據本領域中所熟知的方法，可以通過與結合在固相上的肽的吸附和所選抗體的洗脫進行選擇。
本領域技術人員應理解的是，含有免疫原性或抗原性表位的本發明多肽可以與異源多肽序列融合。例如，本發明的多肽可以與免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定區，或其中的一部分(CH1,CH2,CH3，及其任何組合，包括整個的結構域和部分結構域)，結果均能形成嵌合型的多肽。這些融合多肽有利于純化，并在體內表現出較長的半衰期。這一點在例如由人CD4多肽的前兩個結構域和哺乳動物的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區的各個結構域組成的融合蛋白示出。見，例如，EPA0394827；Traunecker，等，自然331:84-86。由于IgG部分而具有二硫鍵二聚結構的融合蛋白也可比單體多肽或其片段具有更有效的結合和中和其他分子的能力。見，例如，Fountoulakis，等，生物化學雜志，1995,270:3958-3964。編碼上述表位的核酸還可與一條感興趣的基因進行重組，所述基因作為一表位標記，有助于表達多肽的檢測和純化。
攜帶表位的肽和多肽通過任何常規方法生產(見如Houghten,RA.，等，美國科學院研究進展82:5131-5135(1985)；及Houghten等的美國專利No.4631211(1986)所述)。
本發明攜帶表位的肽和多肽的應用包括但非限于根據本領域熟知方法誘導抗體(見如Sutcliffe等；Wilson等；Chow,M.等，美國科學院研究進展82:910-914；及Bittle,F.J等，普通病毒學66:2347-2354(1985))。本發明的攜帶免疫原性表位的肽，即當整個蛋白質是免疫原時引發抗體應答的那部分蛋白質，根據本領域已知方法鑒別(見如Geysen等所述，文獻同上)。進而，Geysen(1990)的美國專利5,194,392描述了一種通用的方法，檢測或確定為表位的拓撲等價物的單體(氨基酸或其它化合物)的序列，它與特定的抗體的互補位(抗原結合位點)相互補。更為通用的，Geysen(1989)的美國專利4,433,092描述了一種方法，檢測或確定為配體的拓撲等價物的單體的序列，它與特定受體的配體結合位點相互補。類似地，Houghten,R.A等(1996)的美國專利5,480,971，(發明名稱過烷基化寡肽混合物)，公開了線性的C1-C7-烷基過烷基化寡肽及其系列和文庫，以及用這種寡肽系列和文庫確定優選地結合于所需的受體分子的過烷基化寡肽的方法。因此，本發明的帶有表位的肽的非肽類類似物也可以通過這些方法常規地制備。
本領域技術人員應意識到，本發明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽及其攜帶表位的片段可與免疫球蛋白(IgG)的C區的一部分組合，產生嵌合多肽。這些融合蛋白利于純化并在體內表現出較長的半衰期。這一點在例如，由人CD4多肽的前兩個結構域和哺乳動物免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的C區的各個結構域組成的嵌合蛋白中示出(EPA394,827；Traunecker等，自然331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵連接的二聚結構的融合蛋白比單體TNF-γ蛋白或蛋白片段更有效地結合和中和其它分子(Fountoulakis，等，生化雜志270:3958-3964(1995))。例如，一種這樣的TNF-γ-Fc融合體在此已如上述生產。
本發明TNF-γ多肽的片段(即一部分)的應用包括但非限于作為生產全長多肽的中間物。
對許多蛋白質而言，包括膜相關蛋白質的胞外結構域或分泌的蛋白的成熟形式，本領域已知從N末端或C末端缺失一或多個氨基酸基本不喪失生物功能。例如，Ron等(生物化學雜志，268:2984-2988(1993))報道了修飾的KGF蛋白，其即使缺失3,8或27個N末端氨基酸殘基也具有肝素結合活性。另外，一些研究人員報道其中2,4或7個N末端氨基酸已除去的TNF-α突變蛋白，當與天然發生的TNF-α多肽相比時，表現出功能活性提高2-3倍(CREASY,A.A.等，癌癥研究47:145-149(1987)；Sidhu,R.S和Bouon,A.P.抗癌研究9:1569-1576(1989)；Kamijo,R.等，生物化學，生物物理學研究160:820-827(1989))。另外，即使一或多個氨基酸從蛋白質的N末端或C-末端缺失導致蛋白質的一或多種生物功能變化或喪失，但其它TNF-γ功能活性仍可保留。
在本發明中，由于本發明的蛋白質是TNF多肽家族成員，從N末端氨基酸直至SEQIDNO:2的35位亮氨酸(相應于SEQIDNO:20的134位亮氨酸)的缺失可保留一些生物活性，如調節許多類型的造血細胞和內皮細胞的生長與分化。具有從N末端至SEQ ID NO:2的亮氨酸-36(相當于SEQ ID NO:20的亮氨酸-135)在內的缺失的多肽預期不保留這種生物活性，因為已知TNF相關多肽中的此殘基是為生物活性所需的保守的功能域的起端。
然而，即使一或多個氨基酸從全長TNF-γ的多肽的N末端缺失導致此多肽的一或多種生物功能喪失，但其它生物活性仍可保留。因此，當全長或成熟多肽的少部分殘基從N末端除去時，縮短的多肽誘導和/或結合抗體的能力仍被保留，該抗體識別全長或成熟形式的多肽。缺失完整多肽N端殘基的特定多肽是否保留這種免疫學活性，可通過本文所述及本領域其它已知常規方法而確定。
由此，本發明還提供了具有缺失自SEQ ID NO:2所示TNF-γ氨基酸序列的氨基端直至35位亮氨酸的一或多個殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。尤其地，本發明提供了含有SEQ ID NO:2的n1-149殘基的氨基酸序列的多肽，其中n1是-27至35之間的整數，且第35位被認為是調節各種造血及內皮細胞生長及分化所需的完整的TNF-γ多肽(SEQ ID NO:2所示)N端的第一個殘基位。
本發明提供的多核苷酸編碼包含或由以下SEQ ID NO:2的殘基組成的氨基酸序列的多肽，本發明還涵蓋了編碼這些多肽的多核苷酸-27 to 147,-26 to 147,-25 to 147,-24 to 147,-23 to 147,-22 to 147,-21to 147,-20 to 147,-19 to 147,-18 to 147,-17 to 147,-16 to 147,-15 to 147,-14 to147,-13 to 147,-12 to 147,-11 to 147,-10 to 147,-9 to 147,-8to 147,-7 to 147,-6 to 147,-5 to 147,-4 to 147,-3 to 147,-2 to 147,-1 to 147,1 to 147,2 to 147,3to 147,4 to 147,5 to 147,6 to 147,7 to 147,8 to 147,9 to 147,10 to 147,11 to147,12 to 147,13 to 147,14 to 147,15 to 147,16 to 147,17 to 147,18 to 147,19to 147,20 to 147,21 to 147,22 to 147,23 to 147,24 to 147,27 to 147,26 to 147,27 to 147,28 to 147,29 to 147,30 to 147,31 to 147,32 to 147,33 to 147,34 to147,and 35 to 147由此，本發明還提供了具有缺失自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β氨基酸序列的氨基端直至134位亮氨酸的一或多個殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。尤其地，本發明提供了含有SEQ IDNO:20的n2-251殘基的氨基酸序列的多肽，其中n2是1-134之間的整數，且第135位被認為是調節各類造血細胞和內皮細胞生長與分化所需的完整TNF-γ-β多肽(SEQ ID NO:20所示)N端的第一個殘基位。
本發明提供的多核苷酸編碼包含或由以下SEQ ID NO:20的殘基組成的氨基酸序列的多肽，本發明還涵蓋了編碼這些多肽的多核苷酸1 to 251,2 to 251,3 to 251,4 to 251,5 to 251,6to 251,7 to 251,8 to251,9to 251,10to 251,11 to 251,12 to 251,13 to 251,14to 251,15 to 251,16 to251,17 to 251,18 to 251,19 to 251,20 to 251,21 to 251,22 to 251,23 to 251,24to 251,25 to 251,26 to 251,27 to 251,28 to 251,29 to 251,30 to 251,31to 251,32 to 251,33 to 251,34 to 251,35 to 251,36 to 251,37 to 251,38 to 251,39 to251,40 to 251,41 to 251,41 to 251,42 to 251,43 to 251,44 to 251,45 to 251,46to 251,47 to 251,48 to 251,49 to 251,50 to 251,51 to 251,52 to 251,53 to 251,54 to 251,55 to 251,56 to 251,57 to 251,58 to 251,59 to 251,60 to 251,61 to251,62 to 251,63 to 251,64 to 251,65 to 251,66 to 251,67 to 251,68 to 251,69to 251,70 to 251,71 to 251,72 to 251,73 to 251,74 to 251,75 to 251,76 to 251,77 to 251,78 to 251,79 to 251, 80 to 251,81 to 251,82 to 251,83 to 251,84 to251,85 to 251,86 to 251,87 to 251,88 to 251,89 to 251,90 to 251,91 to 251,92to 251,93 to 251,94 to 251,95 to 251,96 to 251,97 to 251,98to 251,99 to 251,100 to 251,101 to 251,102 to 251,103 to 251,104 to 251,105 to 251,106 to 251,107 to 251,108 to 251,109 to 251,110 to 251,111 to 251,112 to 251,113 to 251,114 to 251,115 to 251,116 to 251,117 to 251,118 to 251,119 to 251,120 to 251,121 to 251,122 to 251,123 to 251,124 to 251,125 to 251,126 to 251,127 to 251,128 to 251,129 to 251,130 to 251,131 to 251,133 to 251,134 to 251,and 134 to251如上所述，即使一或多個氨基酸從多肽的N端缺失導致多肽的一或多種生物功能喪失，其它生物活性仍將保留。因此，當少于半數的全長或成熟多肽的殘基從N端除去時，縮短的TNF-γ-α突變蛋白誘導和/或結合識別全長或成熟多肽的抗體的能力仍將保留。缺失完整蛋白N端殘基的特定多肽是否保留這種免疫活性，可通過本文所述的及本領域已知其它方法確定。缺失大量N端殘基的TNF-γ-α突變蛋白仍可保留一些生物或免疫原性活性不是不可能的。事實上，由少至6個TNF-γ-α的氨基酸殘基組成的肽經常可引起免疫應答。
由此，本發明還提供了具有缺失自圖1A和1B(SEQ ID NO:2)所示TNF-γ-α氨基酸序列的氨基端直至圖1A和1B所示序列第169位苯丙氨酸(相當于SEQ ID NO:2的142位)的一或多個殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發明特別提供了包含圖1A和1B的n3-174殘基(SEQ ID NO:2的n3-147殘基)的氨基酸序列的多肽，其中n3是1-169之間的整數，且170位被認為是至少是為TNF-γ-α多肽免疫原性活性所需的完整TNF-γ-α多肽N端的第一個殘基位。
更特別地，本發明提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含或由圖1A和1B中所示TNF-γ-α序列的以下殘基的氨基酸序列組成(圖1A和1B所示TNF-γ-α氨基酸序列與SEQ ID NO:2中所示序列相同，但二序列間計數方式不同；以下氨基酸殘基位數在此指圖1A和1B中的位數)，所述殘基為
R-2 to L-174；R-3 to L-174；F-4 to L-174；L-5to L-174；S-6 to L-174；K-7 to L-174；V-8 to L-174；Y-9 to L-174；S-10 to L-174；F-11 to L-174；P-12 toL-174；M-13 to L-174；R-14 to L-174；K-15 to L-174；L-16 to L-174；I-17to L-174；L-18 to L-174；F-19 to L-174；L-20 to L-174；V-21 to L-174；F-22 to L-174；P-23 toL-174；V-24 to L-174；V-25 to L-174；R-26 to L-174；Q-27 to L-174；T-28 to L-174；P-29 to L-174；T-30 to L-174；Q-31 to L-174；H-32 to L-174；F-33 to L-174；K-34 toL-174；N-35 to L-174；Q-36 to L-174；F-37 to L-174；P-38 to L-174；A-39 to L-174；L-40 to L-174；H-41 to L-174；W-42 to L-174；E-43 to L-174；H-44 to L-174；E-45 toL-174；L-46 to L-174；G-47 to L-174；L-48 to L-174；A-49 to L-174；F-50 to L-174；T-51 to L-174；K-52to L-174；N-53 to L-174；R-54 to L-174；M-55 to L-174；N-56to L-174；Y-57 to L-174；T-58 to L-174；N-59to L-174；K-60to L-174；F-61 toL-174；L-62 to L-174；L-63 to L-174；I-64 to L-174；P-65 to L-174；E-66 to L-174；S-67 to L-174；G-68 to L-174；D-69 to L-174；Y-70 to L-174；F-71 to L-174；I-72 toL-174；Y-73 to L-174；S-74 to L-174；Q-75 to L-174；V-76 to L-174；T-77 to L-174；F-78 to L-174；R-79 to L-174；G-80 to L-174；M-81 to L-174；T-82 to L-174；S-83 toL-174；E-84 to L-174；C-85 to L-174；S-86 to L-174；E-87 to L-174；I-88 to L-174；R-89 to L-174；Q-90 to L-174；A-91 to L-174；G-92 to L-174；R-93to L-174；P-94 toL-174；N-95 to L-174；K-96 to L-174；P-97 to L-174；D-98 to L-174；S-99 to L-174；I-100 to L-174；T-101 to L-174；V-102 to L-174；V-103 to L-174；I-104 to L-174；T-105 to L-174；K-106 to L-174；V-107 to L-174；T-108 to L-174；D-109 to L-174；S-110 to L-174；Y-111 to L-174；P-112 to L-174；E-113 to L-174；P-114 to L-174；T-115 to L-174；Q-116 to L-174；L-117 to L-174；L-118 to L-174；M-119 to L-174；G-120 to L-174；T-121 to L-174；K-122 to L-174；S-123 to L-174；V-124 to L-174；C-125 to L-174；E-126 to L-174；V-127 to L-174；G-128 to L-174；S-129 to L-174；N-130 to L-174；W-131 to L-174；F-132 to L-174；Q-133 to L-174；P-134 to L-174；I-135 to L-174；Y-136 to L-174；L-137 to L-174；G-138 to L-174；A-139 to L-174；M-140 to L-174；F-141 to L-174；S-142 to L-174；L-143 to L-174；Q-144 to L-174；E-145 to L-174；G-146 to L-174；D-147 to L-174；K-148 to L-174；L-149 to L-174；M-150 to L-174；V-151 to L-174；N-152 to L-174；V-153 to L-174；S-154 to L-174；D-155 to L-174；I-156 to L-174；S-157 to L-174；L-158 to L-174；V-159 to L-174；D-160 to L-174；Y-161 to L-174；T-162 to L-174；K-163 to L-174；E-164 to L-174；D-165 to L-174；K-166 to L-174；T-167 to L-174；F-168 to L-174；and F-169 toL-174
因此，本發明還提供了具有缺失自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β的預測的成熟氨基酸序列的氨基酸端，直至第246位苯丙氨酸殘基的一或多個殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發明特別提供了含有SEQ ID NO:20的n4-251殘基的氨基酸序列的多肽，其中n4是2-246間的一個整數，且247位被認為是為至少TNF-γ-β蛋白的免疫原性活性所需的完整TNF-γ-β多肽N端的第一個殘基位。
本發明尤其提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含或由SEQID NO:20所示TNF-γ-β序列的以下殘基的氨基酸序列組成本發明還涵蓋了編碼這些多肽的多核苷酸。
A-2 to L-251；E-3 to L-251；D-4 to L-251；L-5 to L-251；G-6 to L-251；L-7 to L-251；S-8 to L-251；F-9 to L-251；G-10 to L-251；E-11to L-251；T-12 toL-251；A-13 to L-251；S-14 to L-251；V-15 to L-251；E-16 to L-251；M-17 to L-251；L-18 to L-251；P-19to L-251；E-20 to L-251；H-21 to L-251；G-22 to L-251；S-23 toL-251；C-24 to L-251；R-25 to L-251；P-26 to L-251；K-27to L-251；A-28 to L-251；R-29 to L-251；S-30 to L-251；S-31 to L-251；S-32 to L-251；A-33 to L-251；R-34 toL-251；W-35 to L-251；A-36 to L-251；L-37 to L-251；T-38 to L-251；C-39 to L-251；C-40 to L-251；L-41 to L-251；V-42 to L-251；L-43 to L-251；L44 to L-251；P-45 toL-251；F-46 to L-251；L-47 to L-251；A-48 to L-251；G-49 to L-251；L-50 to L-251；T-51 to L-251；T-52 to L-251；Y-53 to L-251；L-54 to L-251；L-55 to L-251；V-56 toL-251；S-57 to L-251；Q-58 to L-251；L-59 to L-251；R-60 to L-251；A-61 to L-251；Q-62 to L-251；G-63 to L-251；E-64 to L-251；A-65 to L-251；C-66to L-251；V-67 toL-251；Q-68 to L-251；F-69to L-251；Q-70 to L-251；A-71 to L-251；L-72 to L-251；K-73 to L-251；G-74 to L-251；Q-75 to L-251；E-76 to L-251；F-77 to L-251；A-78 toL-251；P-79 to L-251；S-80 to L-251；H-81 to L-251；Q-82 to L-251；Q-83 to L-251；V-84 to L-251；Y-85 to L-251；A-86 to L-251；P-87 to L-251；L-88 to L-251；R-89 toL-251；A-90 to L-251；D-91 to L-251；G-92 to L-251；D-93 to L-251；K-94 to L-251；P-95 to L-251；R-96 to L-251；A-97 to L-251；H-98 to L-251；L-99 to L-251；T-100to L-251；V-101 to L-251；V-102 to L-251；R-103 to L-251；Q-104to L-251；T-105 toL-251；P-106 to L-251；T-107 to L-251；Q-108 to L-251；H-109 to L-251；F-110 toL-251；K-111 to L-251；N-112 to L-251；Q-113 to L-251；F-114 to L-251；P-115 toL-251；A-116 to L-251；L-117 to L-251；H-118 to L-251；W-119 to L-251；E-120 toL-251；H-121 to L-251；E-122 to L-251；L-123 to L-251；G-124 to L-251；L-125 toL-251；A-126 to L-251；F-127 to L-251；T-128 to L-251；K-129 to L-251；N-130 toL-251；R-131 to L-251；M-132 to L-251；N-133 to L-251；Y-134 to L-251；T-135 toL-251；N-136 to L-251；K-137 to L-251；F-138 to L-251；L-139 to L-251；L-140 toL-251；I-141 to L-251；P-142 to L-251；E-143 to L-251；S-144 to L-251；G-145 toL-251；D-146 to L-251；Y-147 to L-251；F-148 to L-251；I-149 to L-251；Y-150 toL-251；S-151 to L-251；Q-152 to L-251；V-153 to L-251；T-154 to L-251；F-155 toL-251；R-156 to L-251；G-157 to L-251；M-158 to L-251；T-159 to L-251；S-160 toL-251；E-161 to L-251；C-162 to L-251；S-163 to L-251；E-164 to L-251；I-165 toL-251；R-166 to L-251；Q-167 to L-251；A-168 to L-251；G-169 to L-251；R-170 toL-251；P-171 to L-251；N-172 to L-251；K-173 to L-251；P-174 to L-251；D-175 toL-251；S-176 to L-251；I-177 to L-251；T-178 to L-251；V-179 to L-251；V-180 toL-251；I-181 to L-251；T-182 to L-251；K-183 to L-251；V-184 to L-251；T-185 toL-251；D-186 to L-251；S-187 to L-251；Y-188 to L-251；P-189 to L-251；E-190 toL-251；P-191 to L-251；T-192 to L-251；Q-193 to L-251；L-194 to L-251；L-195 toL-251；M-196 to L-251；G-197 to L-251；T-198 to L-251；K-199 to L-251；S-200 toL-251；V-201 to L-251；C-202 to L-251；E-203 to L-251；V-204 to L-251；G-205 toL-251；S-206 to L-251；N-207 to L-251；W-208 to L-251；F-209 to L-251；Q-210 toL-251；P-211 to L-251；I-212 to L-251；Y-213 to L-251；L-214 to L-251；G-215 toL-251；A-216 to L-251；M-217 to L-251；F-218 to L-251；S-219 to L-251；L-220 toL-251；Q-221 to L-251；E-222 to L-251；G-223 to L-251；D-224 to L-251；K-225 toL-251；L-226 to L-251；M-227 to L-251；V-228 to L-251；N-229 to L-251；V-230 toL-251；S-231 to L-251；D-232 to L-251；I-233 to L-251；S-234 to L-251；L-235 toL-251；V-236 to L-251；D-237 to L-251；Y-238 to L-251；T-239 to L-251；K-240 toL-251；E-241 to L-251；D-242 to L-251；K-243 to L-251；T-244 to L-251；F-245 toL-251；and F-246 to L-251
相似地，已知許多C端缺失的突變蛋白的生物功能。例如，干擾素γ通過蛋白質羧基端缺失8-10個氨基酸而表現出活性提高10倍(Dobeli等，生物技術學雜志7:199-216(1988))。另外，一些研究人員已報道生物學活性失活的TNF-a突變蛋白，其中只有少至2個氨基酸從C端除去(Carlino,J.A.等，生物化學雜志262:958-961(1987)；Crensey,A-A等.癌癥研究47:145-149(1987)；Sidhu,R.S.和Bollin,A.P.抗癌研究9:1569-1576(1989)；Gase,K等，免疫學71:368-371(1990))。
由于本發明的蛋白質是TNF多肽家族的成員，缺失SEQ ID NO:2的C端氨基酸直至146位亮氨酸(相當于SEQ ID NO:20的250位亮氨酸)，仍可保留一些生物活性，如調節多種類型造血細胞和內皮細胞的生長與分化。缺失SEQ ID NO:2的C端氨基酸直至包括146位亮氨酸(相應于SEQ ID NO:20的250位亮氨酸)在內的氨基酸的多肽，預期不保留這種生物活性，因為已知TNF相關多肽中的此殘基是生物活性所需保守結構域的起端。
然而，即使蛋白質C端缺失一或多個氨基酸導致蛋白質的一或多種生物學活性喪失，其它生物活性仍可保留。因此，當成熟或完整蛋白少于半數的殘基從C端除去時，縮短的蛋白質誘導和/或結合識別完整或成熟蛋白的抗體的能力仍保留。缺失完整蛋白C端殘基的一特定多肽是否保留這種免疫原性活性，通過本文所述的及本領域已知其它方法可確定。
在另一實施方案中，本發明進一步提供了具有去除自SEQ IDNO:2所示TNF-γ-α所示氨基酸序列羧基端直至SEQ ID NO:2的146位亮氨酸的一或多個殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發明特別提供了具有SEQ ID NO:2的-27～m1殘基的氨基酸序列的多肽，其中m1是146～147間任一整數，且146位被認為是TNF-γ-α多肽調節各類造血和內皮細胞生長與分化所需的完整TNF-γ-α多肽(SEQ ID NO:2所示)C端的第一個殘基位。
本發明特別提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽具有SEQ IDNO:2的-27～146及-27～147殘基的氨基酸序列。也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明還提供了具有去除自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β氨基酸序列羧基端直至SEQ ID NO:20的250位亮氨酸的一或多個氨基酸殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發明特別提供了具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列中1～m2殘基的氨基酸序列的多肽，其中m2是250～251間的任一整數，且249位是調節各類造血及內皮細胞生長與分化所需的完整TNF-γ-β多肽(SEQ IDNO:20所示)C端的第一個殘基位。
本發明特別提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽具有SEQ IDNO:20的1-250及1-251殘基的氨基酸序列。也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明還提供了多肽片段，其包含或由TNF-γ-α的氨基及羧基端缺失的一或多個氨基酸組成，該片段一般可描述為具有SEQID NO:2的n1-m1殘基，其中n和m是如上述的整數。本發明還提供了一種多肽，其具有缺失自TNF-γ-β的氨基和羧基端的一或多個氨基酸，一般可描述為具有SEQ ID NO:20的n2-m2殘基，其中n2和m2是如上述的整數。
如上所述，即使多肽C端失一或多個氨基酸導致其一或多種生物活性喪失，其它生物活性仍可保留。因此，當少于完整或成熟多肽半數的殘基從C端除去時，縮短的TNF-γ-α突變蛋白保留誘導和/或結合識別全長或成熟多肽的抗體的能力。喪失全長多肽C端殘基的特定多肽，是否具有這種免疫原性活性，可通過本文所述及本領域已知方法確定。缺失大量C端氨基酸殘基的TNF-γ-α突變蛋白可保留一些生物或免疫原性活性不是不可能的。事實上，由少至6個TNF-γ-α氨基酸殘基組成的肽可經常引起免疫應答。
由此，本發明還提供了具有缺失自圖1A和1B所示(或SEQ IDNO:2所示)TNF-γ-α氨基酸序列羧基端直至圖1A和1B所示序列第6位絲氨酸(或SEQ ID NO:2中-22位)的一或多個氨基酸殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發明特別提供了含有SEQIDNO:2的1-m3殘基的氨基酸序列的多肽，其中m3是6～174之間的一個整數，且6位是至少為TNF-γ-α的免疫原性活性所需的完整TNF-γ-α多肽C端的第一個殘基位。
本發明尤其提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽含有或由圖1A和1B所示TNF-γ-α序列的以下殘基的氨基酸序列組成(圖1A和1B所示TNF-γ-α氨基酸序列與SEQ ID NO:2中所示相同，但二序列間計數方式不同；以下氨基酸殘基位數為圖1A和1B中位數)，所述殘基是
M-1 to L-173；M-1 to F-172；M-1 to A-171；M-1 to G-170；M-1 to F-169；M-1 to F-168；M-1 to T-167；M-1 to K-166；M-1 to D-165；M-1 to F-164；M-1 toK-163；M-1 to T-162；M-1 to Y-161；M-1 to D-160；M-1 to V-159；M-1 to L-158；M-1 to S-157；M-1 to I-156；M-1 to D-155；M-1 to S-154；M-1 to V-153；M-1 toN-152；M-1 to V-151；M-1 to M-150；M-1 to L-149；M-1 to K-148；M-1 to D-147；M-1 to G-146；M-1 to E-145；M-1 to Q-144；M-1 to L-143；M-1 to S-142；M-1 toF-141；M-1 to M-140；M-1 to A-139；M-1 to G-138；M-1 to L-137；M-1 to Y-136；M-1 to I-135；M-1 to P-134；M-1 to Q-133；M-1 to F-132；M-1 to W-131；M-1 toN-130；M-1 to S-129；M-1 to G-128；M-1 to V-127；M-1 to E-126；M-1 to C-125；M-1 to V-124；M-1 to S-123；M-1 to K-122；M-1 to T-121；M-1 to G-120；M-1 toM-119；M-1 to L-118；M-1 to L-117；M-1 to Q-116；M-1 to T-115；M-1 to P-114；M-1 to E-113；M-1 to P-112；M-1 to Y-111；M-1 to S-110；M-1 to D-109；M-1 toT-108；M-1 to V-107；M-1 to K-106；M-1 to T-105；M-1 toI-104；M-1 to V-103；M-1to V-102；M-1 to T-101；M-1 toI-100；M-1 to S-99；M-1 to D-98；M-1 to P-97；M-1to K-96；M-1 to N-95；M-1 to P-94；M-1 to R-93；M-1 to G-92；M-1 to A-91；M-1 toQ-90；M-1 to R-89；M-1 to I-88；M-1 to E-87；M-1 to S-86；M-1 to C-85；M-1 toE-84；M-1 to S-83；M-1 to T-82；M-1 to M-81；M-1 to G-80；M-1 to R-79；M-1 toF-78；M-1 to T-77；M-1 to V-76；M-1 to Q-75；M-1 to S-74；M-1 to Y-73；M-1 toI-72；M-1 to F-71；M-1 to Y-70；M-1 to D-69；M-1 to G-68；M-1 to S-67；M-1 toE-66；M-1 to P-65；M-1 to I-64；M-1 to L-63；M-1 to L-62；M-1 to F-61；M-1 toK-60；M-1 to N-59；M-1 to T-58；M-1 to Y-57；M-1 to N-56；M-1 to M-55；M-1 toR-54；M-1 to N-53；M-1 to K-52；M-1 to T-51；M-1 to F-50；M-1 to A-49；M-1 toL-48；M-1 to G-47；M-1 to L-46；M-1 to E-45；M-1 to H-44；M-1 to E-43；M-1 toW-42；M-1 to H-41；M-1 to L-40；M-1 to A-39；M-1 to P-38；M-1 to F-37；M-1 toQ-36；M-1 to N-35；M-1 to K-34；M-1 to F-33；M-1 to H-32；M-1 to Q-31；M-1 toT-30；M-1 to P-29；M-1 to T-28；M-1 to Q-27；M-1 to R-26；M-1 to V-25；M-1 toV-24；M-1 to P-23；M-1 to F-22；M-1 to V-21；M-1 to L-20；M-1 to F-19；M-1 toL-18；M-1 to I-17；M-1 to L-16；M-1 to K-15；M-1 to R-14；M-1 to M-13；M-1 toP-12；M-1 to F-11；M-1to S-10；M-1 to Y-9；M-1 to V-8；M-1 to K-7；and M-1 to S-6
編碼這些多肽的多核苷酸也被提供。
本發明還提供了具有自TNF-γ-α多肽的氨基端和羧基端缺失一或多個氨基酸的多肽，其可被描述為具有SEQ ID NO:2的n3-m3殘基，其中n3和m3是如上述的整數。本發明也涵蓋了編碼這種多肽的多核苷酸。
本發明還提供了具有缺失自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β氨基酸序列的羧基端直至第6位甘氨酸一或多個氨基酸的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發明特別提供了含有SEQ ID NO:20的1-m4氨基酸序列的多肽，其中m4是6-250之間的一個整數，且6位是至少為TNF-γ-β蛋白的免疫原性活性所需的完整TNF-γ-β多肽C端的第一殘基位。
本發明更特別地提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽含有或由SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β序列的以下殘基序列組成M-1 to L-250；M-1 to F-249；M-1 to A-248；M-1 to G-247；M-1 to F-246；M-1 to F-245；M-1 to T-244；M-1 to K-243；M-1 to D-242；M-1 to E-241；M-1 toK-240；M-1 to T-239；M-1 to Y-238；M-1 to D-237；M-1 to V-236；M-1 to L-235；M-1 to S-234；M-1 to I-233；M-1 to D-232；M-1 to S-231；M-1 to V-230；M-1 toN-229；M-1 to V-228；M-1 to M-227；M-1 to L-226；M-1 to K-225；M-1 to D-224；M-1 to G-223；M-1 to E-222；M-1 to Q-221；M-1 to L-220；M-1 to S-219；M-1 toF-218；M-1 to M-217；M-1 to A-216；M-1 to G-215；M-1 to L-214；M-1 to Y-213；M-1 to I-212；M-1 to P-211；M-1 to Q-210；M-1 to F-209；M-1 to W-208；M-1 toN-207；M-1 to S-206；M-1 to G-205；M-1 to V-204；M-1 to E-203；M-1 to C-202；M-1 to V-201；M-1 to S-200；M-1 to K-199；M-1 to T-198；M-1 to G-197；M-1 toM-196；M-1 to L-195；M-1 to L-t94；M-1 to Q-193；M-1 to T-192；M-1 to P-191；M-1 to E-190；M-1 to P-189；M-1 to Y-188；M-1 to S-187；M-1 to D-186；M-1 toT-185；M-1 to V-184；M-1 to K-183；M-1 to T-182；M-1 to I-181；M-1 to V-180；M-1to V-179；M-1 to T-178；M-1 to I-177；M-1 to S-176；M-1 to D-175；M-1 to P-174；M-1 to K-173；M-1 to N-172；M-1 to P-171；M-1 to R-170；M-1 to G-169；M-1 toA-168；M-1 to Q-167；M-1 to R-166；M-1 toI-165；M-1 to E-164；M-1 to S-163；M-1to C-162；M-1 to E-161；M-1 to S-160；M-1 to T-159；M-1 to M-158；M-1 to G-157；M-1 to R-156；M-1 to F-155；M-1 to T-154；M-1 to V-153；M-1to Q152；M-1 toS-151；M-1 to Y-150；M-1 to I-149；M-1 to F-148；M-1 to Y-147；M-1 to D-146；M-1to G-145；M-1 to S-144；M-1 to E-143；M-1 to P-142；M-1 to I-141；M-1 to L-140；M-1 to L-139；M-1 to F-138；M-1 to K-137；M-1 to N-136；M-1 to T-135；M-1 toY-134；M-1 to N-133；M-1 to M-132；M-1 to R-131；M-1 to N-130；M-1 to K-129；M-1 to T-128；M-1 to F-127；M-1 to A-126；M-1 to L-125；M-1 to G-124；M-1 toL-123；M-1 to E-122；M-1 to H-121；M-1 to E-120；M-1 to W-119；M-1 to H-118；M-1 to L-117；M-1 to A-116；M-1 to P-115；M-1 to F-114；M-1 to Q-113；M-1 toN-112；M-1 to K-111；M-1 to F-110；M-1 to H-109；M-1 to Q-108；M-1 to T-107；M-1 to P-106；M-1 to T-105；M-1 to Q-104；M-1 to R-103；M-1 to V-102；M-1 toV-101；M-1 to T-100；M-1 to L-99；M-1 to H-98；M-1 to A-97；M-1 to R-96；M-1 toP-95；M-1 to K-94；M-1 to D-93；M-1 to G-92；M-1 to D-91；M-1 to A-90；M-1 toR-89；M-1 to L-88；M-1 to P-87；M-1 to A-86；M-1 to Y-85；M-1 to V-84；M-1 toQ-83；M-1 to Q-82；M-1 to H-81；M-1 to S-80；M-1 to P-79；M-1 to A-78；M-1 toF-77；M-1 to E-76；M-1 to Q-75；M-1 to G-74；M-1 to K-73；M-1 to L-72；M-1 toA-71；M-1 to Q-70；M-1 to F-69；M-1 to Q-68；M-1 to V-67；M-1 to C-66；M-1 toA-65；M-1 to E-64；M-1 to G-63；M-1 to Q-62；M-1 to A-61；M-1 to R-60；M-1 toL-59；M-1 to Q-58；M-1 to S-57；M-1 to V-56；M-1 to L-55；M-1 to L-54；M-1 toY-53；M-1 to T-52；M-1 to T-51；M-1 to L-50；M-1 to G-49；M-1 to A-48；M-1 toL-47；M-1 to F-46；M-1 to P-45；M-1 to L-44；M-1 to L-43；M-1 to V-42；M-1 toL-41；M-1 to C-40；M-1 to C-39；M-1 to T-38；M-1 to L-37；M-1 to A-36；M-1 toW-35；M-1 to R-34；M-1 to A-33；M-1 to S-32；M-1 to S-31；M-1 to S-30；M-1 toR-29；M-1 to A-28；M-1 to K-27；M-1 to P-26；M-1 to R-25；M-1 to C-24；M-1 toS-23；M-1 to G-22；M-1 to H-21；M-1 to E-20；M-1 to P-19；M-1 to L-18；M-1 toM-17；M-1 to E-16；M-1 to V-15；M-1 to S-14；M-1 to A-13；M-1 to T-12；M-1 toE-11；M-1 to G-10；M-1 to F-9；M-1 to S-8；M-1 to L-7；and M-1 to G-6
本發明也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明還提供了具有TNF-γ-β多肽的氨基及羧基端均缺失一或多個氨基酸的多肽，其可具有SEQ ID NO:20的n4-m4殘基，其中n4-m4是如上述的整數。本發明也涵蓋了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明另一實施方案涉及多肽片段，其含有或由以公式mx-nx所述的氨基酸組成，其中m和n分別相當于上述這些符號代表的任一個氨基酸，x代表任一整數。本發明也涵蓋了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的特異的實施方案涉及編碼多肽的核苷酸序列，該多肽由包含于ATCC保藏號75927的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ-α氨基酸序列的一部分組成，其中此部分不包括由ATCC保藏號75927的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列氨基端的1～62位氨基酸，或羧基端1個氨基酸，或缺失以上任何氨基端和羧基端氨基酸的組合。本發明還提供了編碼所有以上缺失突變體形式的多肽的多核苷酸。
在另一實施方案中，本發明涉及編碼多肽的核苷酸序列，該多肽由包含于ATCC保藏號203055的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分組成，其中此部分不包括由ATCC保藏號203055的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列的1～134位氨基酸，或一些數目的氨基端氨基酸(其中所述的數選自1～134)，或羧基端大約1個氨基酸，或任何氨基端和羧基端缺失的氨基酸。本發明還涵蓋了編碼所有以上多肽的多核苷酸。
本發明還提供了分離的TNF-γ多肽，其所含的氨基酸序列選自以下一組(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全長TNF-γ-α多肽的氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位)；(b)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全長TNF-γ-α多肽的氨基酸序列，但無N端甲硫氨酸(即SEQ ID NO:2的26～147位)；(c)具有SEQ ID NO:2中1-147位氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(d)由保藏在ATCC保藏號No.75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC中保藏號No.75927的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列，但無N端甲硫氨酸；(f)由ATCC保藏號No.75927的cDNA克隆HUVEO91編碼的預測的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列。本發明的多肽還包括具有與上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)序列至少70％,80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，及其片段。
本發明還提供了分離的TNF-γ多肽，其所含的氨基酸序列選自以下一組(a)具有SEQ ID NO:20所示完整氨基酸序列的全長TNF-γ-β多肽的氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1～251位)；(b)具有SEQ ID NO:20所示完整氨基酸序列的全長TNF-γ-β多肽的氨基酸序列，但無N端甲硫氨酸(即SEQ ID NO:20的2～251位)；(c)具有SEQ ID NO:20的62-251位氨基酸序列的成熟TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號No.203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號No.203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的完整氨基酸序列，但無N端甲硫氨酸；(f)由ATCC保藏號No.203055的cDNA克隆編碼的預測的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列。本發明的多肽還包括具有與上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)序列存在至少70％,80％，優選至少90％，更優選至少95％,96％,97％,98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，及其片段。這些多肽長度至少為10個，15個，20個，25個，30個，優選至少50個氨基酸。
對于一個多肽，其所含的氨基酸序列與參照的TNF-γ多肽的氨基酸序列具有例如至少95％的“相同性”是指，除了相對于每100個參照的TNF-γ多肽的氨基酸序列之中該序列最多包含5個氨基酸變化之外，該多肽的氨基酸序列與參照序列是相同的。換言之，為了獲得與參照序列95％相同性的一個多肽，在參照序列上最多5％的氨基酸可以缺失或用其它氨基酸取代，或者在參照序列上可以插入最多5％的氨基酸。這些在參照序列上的突變可以發生在參照的氨基酸序列的氨基端或羧基端，或位于兩末端之間的任何位置，可以是在參照序列的氨基酸間各自分散的，或者在參照序列上呈連續的一組或多組。
在實際當中，任一特定的多肽與例如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或保藏的cDNA克隆HUVEO91編碼的氨基酸序列是否具有至少95％,96％,97％,98％或99％的相同性，可以方便地利用已知的計算機程序來確定，如Bestfit程序，(Wisconsin序列分析包，Unix系統第8版，遺傳學計算機小組，University Resarch Park,575Science Drive,Madison,WI53711)。Bestfit或者其他任何序列比對程序來確定某一序列是否與本發明的參照序列具有至少，例如95％的相同性，需要設置好參數，從而在全長的參照氨基酸序列上計算相同性的百分比，并允許最高達參照序列的氨基酸總數5％的同源性缺口。
確定參照(查詢)序列(本發明的序列)和一個目的序列之間的最佳全局匹配，也稱全局序列比對，的一個優選的方法可以利用基于Brutlag等(計算機應用生物科學，6:237-2451(1990))的算法FASTDB計算機程序。序列比對中查詢序列和目的序列都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所說的全局序列比對的結果以相同性百分比表示。進行氨基酸序列的FASTDB比對以計算相同性百分比時優選的參數為Matrix=PAM0,k-tuple=2,Mismatch Penalty=1,Joining Penalty=20,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=1,Window Size=序列長度，Gap Penalty=5,Gap Size Penalty=0.05,WindowSize=500或者目標核苷酸序列的長度，取較短的。根據這一實施方案如果目的序列因N-或者C-端缺失而非由于內部缺失而比查詢序列短，那么必須對結果作手工修正。這是因為FASTDB程序在計算全局相同性百分比時不計算目的序列N-或C-端的短缺。對于目的序列相對于查詢序列在N-或C-端的短缺，百分比相同性的修正是通過計算不匹配的位于目的序列N-或C-端的查詢序列的殘基數，以作為查詢序列總數的百分比。一個殘基是否匹配通過FASTDB序列比對的結果來確定。然后將此百分數從FASTDB序列比對中所顯示出的相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比結果。此修正的結果才可用于本發明。只有在目的序列N-或C-端不與查詢序列相匹配的殘基，才被計算用以手工調節相同性百分比結果。就是說，只有目的序列的最外端的N-或C-端殘基之外的查詢殘基才需要調節。例如，一個90個氨基酸殘基的目的序列與一個100個氨基酸殘基的查詢序列比對以確定查分比相同性。缺失發生于目的序列的N末端，因此，FASTDB比對不顯示出N端前10個殘基的匹配。這10個不匹配的殘基相當于序列的10％(N-或C-端不匹配的殘基數/查詢序列中的殘基總數)，因而從FASTDB程序計算的百分比相同性中減去這10％。如果剩余的90個殘基都完全匹配，那么最終的百分比相同性就是90％。再例如，一個90個殘基的目的序列與一個100個殘基的查詢序列相比較。這時的缺失是內部缺失，因而目的序列的N-或C-端殘基沒有與查詢序列不匹配的。在這種情況下，FASTDB程序計算的百分比相同性不需要手工修正。再強調一次，只有目的序列的N-或C-端殘基與查詢序列不匹配的才需手工修正。對比本發明不需要進行其他的手工修正。
本發明的多肽包括SEQ ID NO:20的多肽(尤其成熟多肽)，以及與SEQ ID NO:2的多肽具有至少70％，優選至少90％，更優選至少95％相似性(更優選相同性)的多肽，也包括這種多肽的一部分，這部分一般含有至少30個優選至少50個氨基酸。
本發明的多肽還包括SEQ ID NO:20的多肽(尤其該肽的胞外結構域)，以及與SEQ ID NO:20的多肽具有至少70％，優選至少90％，更優選至少95％相似性(更優選相同性)的多肽，也包括這種多肽的一部分，這部分一般含有至少30個優選至少50個氨基酸。
本發明的其它多肽包括與本文所述多肽具有至少70％,90％，優選至少95％相似性，更優選至少96％,97％,98％或99％相似性的多肽。本發明的多肽還包括與本文所述多肽具有至少70％,80％，優選至少90％或95％，更優選至少96％,97％,98％或99％相同性的多肽。在特異的實施方案中，這種多肽包含至少30個優選至少50個氨基酸。
如本領域已知兩多肽間的“相似性”通過對比氨基酸序列及一個多肽對另一個多肽序列的保守氨基酸置換來確定。兩個序列的“相似性百分比”是指用Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer,Group,University ResearchPark,575 Science Drive,Madison,WI 53711)及確定相似性設定的缺省參數，對比兩個多肽的氨基酸序列而產生的相似性范圍。Bestfits用Smith和Waterman的局部同源程序以發現兩序列間最相似的節段。
本發明的TNF-γ-α和TNF-γ-β多肽可以是單體或多聚體(即二聚體，三聚體，四聚體及更大的多聚體)。在另外的實施方案中，本發明的多聚體至少是二聚體、三聚體或四聚體。
本發明所涉及的多聚體可以是同聚體或異聚體。本文這里所使用的“同聚體”術語，是指僅含有本發明的TNF-γ多肽(包括本文這里所述的TNF-γ片段，變異體，不同的剪接產物和融合蛋白)。這里同聚體為含有相同或不同的氨基酸序列的TNF-γ多肽。在一個特殊的實例中，本發明的一個同聚體為一個僅含有TNF-γ多肽的多聚休，后者含有相同的氨基酸序列。在另一個特殊的實例中，本發明的一個同聚體為一個含有TNF-γ多肽的多聚體，而后者含有不同的氨基酸序列。在特殊的實例中，本發明的多聚體為一同源二聚體(例如，含有相同或不同的氨基酸序列的TNF-γ多肽)或一同源三聚體(如，含有相同或不同的氨基酸序列的TNF-γ多肽)。在另外的實例中，本發明的同聚多聚體至少應是一個同源二聚體，同源三聚體或同源四聚體。
“異聚體”這一術語，在本文是指一個除含有本發明的TNF-γ多肽外，還含有一個或多個異源性多肽的多聚體(即不同的蛋白多肽)。在一個特殊的實例中，本發明的多聚體為異源二聚體，異源三聚體，或異源四聚體。在另外的實例中，本發明的同源多聚體至少為一個同源二聚體，同源三聚體，或同源四聚體。
本發明的多聚體是由親水、疏水、離子和/或共價連接和/或間接連接，例如通過脂質體的形成。因此，在一個實施例中，本發明的多聚體，如，同源多聚體或異源多聚體在本發明的多肽在溶液中與另一個分子接觸時，就可以形成多聚體。在另一個實施例中，本發明的異源多聚體，例如，在溶液中，本發明的多肽與此肽的抗體接觸(包括針對本發明的融合蛋白中的異源多肽序列的抗體)就可以形成異源三聚體或四聚體。在另外一些實施例中，本發明的多聚體可以通過與和/或在本發明的TNF-γ-α和TNF-γ-β多肽之間的共價相互作用形成。這些共價相互作用包括一個或多個存在于該多肽內的氨基酸殘基(如，引自SEQ IDNO:_或SEQ IDNO:_，或相應于由保藏克隆所編碼一或多個氨基酸殘基)。涉及一個或多個存在于TNF-γ-α和TNF-γ-β融合蛋白的異源多肽序列中的氨基酸殘基，例如本發明的一個TNF-γ-α-Fc融合蛋白所含的異源序列，以及與來自另一個TNF家族的配體/受體家族成員的異源多肽序列融合體所含的異源序列，其能夠形成共價連接的多聚體，例如osteroprotegetin。
本發明還涉及融合蛋白，其中全長TNF-γ多肽或其片段、變體，衍生物或類似物與不相關的蛋白質融合。本發明的融合蛋白可直接將TNF-γ多肽(或其片段、變體、衍生物或類似物)與一同源序列融合而構建，或可用具有一或多個氨基酸的間隔區或銜接子區插入蛋白質的兩部分之間而構建。任選地，此間隔區可編碼蛋白酶切割位點。融合物的精確位點不是關鍵的并可常規改變，以使同源和/或異源序列的結合性和/或生物活性最大化。本發明的融合蛋白基于本文所述TNF-γ核苷酸及多肽序列可常規設計。例如，本領域技術人員將意味到，本文所述的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽及其片段(包括具有表位的片段)可與免疫球蛋白(IgG)的恒定區的一部分組合，產生嵌合(融合)多肽。這些融合蛋白質有利于純化，并在體內表現出半衰期延長。現已示出例如嵌合蛋白由人CD4-多肽的前兩個區域和哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈上恒定區的不同結構域組成(EPA394827,Traunecker等，自然331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵連接的二聚體結構的融合蛋白還可在結合及中和其它分子的過程中比單體的TNF-γ蛋白或其片段更為有效(Fountoulakis等，生物化學雜志270:3958-3964(1995))。例如，如上所述已產生了這種TNF-γ-Fc融合物。在另一實施方案中，全長TNF-γ多肽或其片段，變體、衍生物或類似物融合有一或多個其它異源多肽序列，該序列能形成多聚體結構例如Osteoprotegrin的二聚體結構域(見如EP0721983，美國專利No.5478925，及國際公開WO98/49305，均并入參考)。本發明涉及的其它TNF-γ融合蛋白例如包括但非限于TNF-γ多肽序列與使融合蛋白在細胞表面展示的任何氨基酸序列的融合體；或與提供標記功能的酶，熒光蛋白或發光蛋白融合的融合體。
本發明還涉及嵌合OPG多肽的修飾，并包括翻譯后修飾，例如包括N-連接或O-連接的糖鏈，N末端或C末端的加工處理，化學小分子粘附于氨基酸的骨架上，N-或O-連接糖鏈的化學修飾，以及原核生物宿主細胞表達后，添加或去除N末端的甲硫氨酸殘基。多肽還可以用檢測標記進行修飾，例如酶，熒光，同位素或親和標記，用于蛋白質的檢測和分離。
本發明還提供了化學修飾的OPG的衍生物，它具有其他優點，如多肽的溶解性、穩定性和循環時間均增高，或免疫原性降低(見美國專利第4179337號)。用于衍生的化學基元可以選自水溶性的聚合物，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯乙醇等。多肽可以在分子內任何位點進行隨機修飾，或在分子內預定的位點進行修飾，多肽分子可包括一個、兩個、三個或多個粘附的化學基元。
聚合物可以有任何大小的分子量，并且可以有側鏈，也可以沒有側鏈。對聚乙二醇而言，優選的分子量在約1kD到100kD之間(“大約”一詞表明在聚乙二醇制劑中，有些分子比所說的分子量重，有些則輕些)，以易于處理和制備。也可使用其他大小的分子，要根據治療方案而定(如要求持續釋放的時程，效應，如果有的話，取決于生物學活性，易于操作，抗原性的大小或缺失，以及其他已知的聚乙二醇對某種治療性蛋白或蛋白類似物的效應)。
聚乙二醇分子(或其他化學基元)應當與蛋白質結合，應當考慮到對蛋白質的功能或抗原性結構域的影響。對本領域熟練的技術人員而言，有許多結合方法，如EP0401384，本文引入作參考(PEG與G-CSF偶聯)，還可以參見Malik等，實驗血液學，1992,20:1028-1035(用tresyl chloride對GM-CSF的pegylation)。例如，聚乙二醇可以與氨基酸殘基上的反應基團共價結合，例如游離的氨基或羧基。反應基團是那些活化的聚乙二醇可與結合的分子。帶有游離的氨基的氨基酸殘基，包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基；帶有游離羧基的氨基酸包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C-末端氨基酸殘基。硫氫基團也可以作為附著聚乙二醇分子的反應基團。治療應用時優選的是附著在氨基，如附著在N末端或賴氨酸基團上。
人們特別希望在蛋白質N末端進行化學修飾。聚乙二醇作為本發明組合物的實例，可以從各種不同的聚乙二醇分子中進行挑選(根據分子量，側鏈，等)，反應混合物中，聚乙二醇與蛋白質(或多肽)分子的比例，所進行的pegylation反應類型，以及獲得選擇的N端pegylated蛋白質分子的方法。獲得N端pegylated制備物的方法(即必要時，就將這種基元與其他monopegylated基元分離開)為通過把N末端pegylated材料從大量的.pegylated分子中純化出來。那些在N端發生化學修飾的選擇性蛋白質是通過還原烷基化實現的，還原烷基化為檢測不同原始氨基基團的類型(賴氨酸比N末端)的差異反應性，其用于特異蛋白質的衍化。在適當的反應條件下，可以有選擇性的獲得蛋白質的衍生物，這類蛋白質為N末端攜帶含羰基的聚合物。
本發明多肽的用途包括非限于根據本領域技術人員熟知的方法用作SDS-DAGE凝膠上或分子篩凝膠過濾柱上的分子量標記。
功能活性TNF-γ多肽及其片段、變體、衍生物及類似物的功能活性可通過各種方法分析。
例如，在一個實施方案中分析其結合或與全長TNF-γ多肽競爭結合抗TNF-γ抗體的能力，可使用各種已知免疫分析，包括但非限于用如放射免疫分析，ELISA(酶聯免疫吸附測定)，“夾心”免疫分析，免疫放射分析，凝膠擴散沉淀反應，免疫擴散分析，原位免疫分析(例如用膠體金，酶或放射性同位素)，western印跡，沉淀反應，凝集分析(如凝膠凝集分析，血凝分析)，補體固定分析，免疫熒光分析，A蛋白分析及免疫電泳分析等技術的競爭及非競爭分析。在一實施方案中，通過檢測一級抗體上的標記檢測抗體結合。在另一實施方案中，通過檢測二級抗體或試劑與一級抗體的結合而檢測一級抗體。在另一實施方案中二級抗體是標記的。本領域已知許多檢測免疫分析中結合的方法，并包含在本發明范圍內。
在另一實施方案中，其中TNF-配體被鑒別，例如可通過本領域熟知方法分析結合。在另一實施方案中，可分析TNF-γ結合其底物的生理相關性(信號轉導)。
另外，本文所述的分析(見實施例5,6和9～15)及其它本領域已知方法可常規用于測定TNF-γ多肽及其片段，變體和衍生物引發TNF-γ相關的生物活性(如體外或體內抑制或促進細胞增殖，腫瘤形成，血管生成，NF-kB激活及細胞粘附)的能力。
本領域技術人員已知其它方法，并也包含于本發明內。
抗體本發明還進一步與抗體和T細胞抗原受體(TCR)有關，它們可特異地與本發明的多肽結合。本發明的抗體包括IgG(包括IgG1,IgG2,IgG4),IgA(包括IgA1和IgA2),IgD,IgE，或IgM和IgY。本文這里所使用的“抗體”(Ab)這一術語包括所有抗體，包括單鏈的完整抗體，及其可以結合抗原的片段。本發明中最優選的抗體是結合人抗原的抗體片段，包括，但不僅限于，Fab、Fab’和F(ab’)2、、Fd、單鏈Fvs(scFV)，單鏈抗體，二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH的結構域的片段。抗體可來自任何動物，包括鳥類和哺乳動物。最常見的抗體是人，鼠，免子，山羊，鼠，駱駝，馬或雞來源的。
結合抗原的抗體片段，包括單鏈抗體，可以僅含有可變區或可以與以下全部或部分成分結合:鉸鏈區，CH1、CH2和CH3結構域。本發明還包括可變區與鉸鏈區，CH1,CH2,CH3結構域的任何組合。本發明還包括嵌合的，人源化的和人單克隆抗體和多克隆抗體，它們可以特異地結合本發明的多肽。本發明還包括抗本發明抗體的獨特型抗體。
本發明的抗體可以是單特異的，雙特異的，三特異的或具有更多的特異性。多特異性的抗體可以是對本發明多肽的不同的表位具有特異性，或可以對本發明的多肽和異源性組合物如異源性多肽或固相物質均特異。見，如WO93/17715；WO92/08802:WO91/00360；WO92/05793；Tutt.A等，免疫學雜志，1991,147:60-69；美國專利5573920,4474893,5601819,4714681。4925648；Kostelny,S.A.等，免疫學雜志1992,48:547-1553。
本發明的抗體可以根據本發明的多肽的表位或部分進行描述或分類，這些表位或部分可被抗體特異性地結合或識別。表位或多肽的部分可按本文所述進行分類，如通過N末端和C末端的位置，連續的按基酸殘基的大小，或圖表中所列出的。可以特異地結合任何表位或本發明多肽的抗體也可被排除。因此，本發明包括可特異結本發明多肽的抗體，并且進行同樣的排除。
本發明的抗體還可以根據它們的交叉活性進行描述或分類。還包括那些不與本發明多肽的其他任何類似物，同源物(ortholog)或同源物結合的抗體。不與與本發明多肽的同源性分別低于95％、90％85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％(根據本領域所熟知的方法和本文所述的方法進行計算)的多肽結合的抗體也包含在本發明中。本發明還包含的抗體是那些只結合由這樣多核苷酸序列編碼的多肽，該多核苷酸序列在嚴格的雜交條件下(如本文所述)，與本發明的多核苷酸序列發生雜交。本發明的抗體還可以根據它們的結合的親和性進行描述或分類。優選的親和性包括那些解離常數或Kd小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M。
本發明的抗體具有以下用途，包括但不僅限于，本領域所熟知的對本發明多肽進行純化，檢測和定位的方法，包括體內和體外的診斷和治療方法。例如，抗體可用于免疫分析，用于定量和定性地檢測生物樣本中本發明的多肽的水平。見，例如，Harlow，等，抗體實驗指南，冷泉港實驗室出版社，第二版，1988(引入本文作參考文獻)。
本發明的抗體可單獨應用或與其他組合物聯用。抗體還可與一異源多肽在N-或C-末端重組融合，或與肽或其他組合物化學綴合(包括共價和非共價綴合)。例如，本發明的抗體可與在診斷分析中用作標記的分子和效應分子如異源多肽、藥物或毒素重組融合或綴合。例如見WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；US專利5314995和EP 0396387。
本發明的抗體可用本領域已知的任何合適方法制備，例如本發明的多肽或其抗原性片段可給予一動物以誘導產生含多克隆抗體的血清。單克隆抗體可用本領域已知的各種技術如雜交瘤和重組技術制備。例如見Harlow等，抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，2版，1988)；Hammerling等，單克隆抗體和T細胞雜交瘤563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(所述文獻引入本文作參考)。
Fab和F(ab′)2可通過用酶如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或菠蘿蛋白酶(產生F(ab′)2片段)經蛋白酶裂解而產生。
或者，本發明的抗體可經重組DNA技術或本領域已知的方法經合成化學產生。例如，本發明的抗體可用本領域已知的各種噬菌體展示技術產生。在噬菌體展示方法中，有功能的抗體結構域在攜帶編碼其的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面展示。從組合抗體文庫(如人或小鼠)經用抗原、典型地與固體表面或珠結合或被捕獲的抗原直接選擇而選擇具有所需結合性的噬菌體。用于這些方法中的噬菌體典型地是絲狀噬菌體包括fd和M13,Fab,Fv或二硫鍵穩定的Fv抗體結構域與噬菌體基因Ⅲ或基因Ⅷ蛋白重組融合。可用于制備本發明的抗體的噬菌體展示方法的例子包括如下文獻所述的那些方法，Brinkman U.等(1995)，免疫學方法182:41-50；Ames,R.S.等(1995)，免疫學方法184:177-186；Kettleborough,C.A.等(1994)歐洲免疫學雜志24:952-958；Persic,L.等(1997)基因187:9-18；Burton,D.R.等(1994)免疫學進展57:191-280；PCT/GB91/01134；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401和美國專利5,698,426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908,5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637,5,780,225,5,658,727和5,733,743(所有文獻引入本文作參考)。
如上述參考文獻所述，在噬菌體選擇后，可分離來自噬菌體的抗體編碼區并用于產生全抗體，包括人抗體，或任何其他所需的抗原結合片段，并在任何希望的宿主中表達，如哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，酵母和細菌。例如，用本領域已知的方法，如WO92/22324；Mullinax,R.L等(1992)生物技術12(6):864-869；和Sawai,H.等(1995)AJRI34:26-34和Better,M.等(1988)科學240:1041-1043(所有文獻均引入本文作參考)所述的方法，也可采用重組產生Fab,Fab′和F(ab′)2片段的技術。
用于合成單鏈Fvs的抗體的技術的例子包括以下文獻中所述美國專利4946778和5258498；Huston，等，酶學方法，1991,203:46-88；Shu,L，等，美國科學院研究進展，1993,90:7995-7999；和Skerrra,A，等，科學，1988,240:1038-1040。為了某些用途，包括在人的體內使用抗體和用于體外的檢測，優先使用嵌合，人源化的或人的抗體。用于合成嵌合抗體的方法，本領域的技術人員非常熟悉。見，如Morrison，科學，1985,229:1202；Oi等，生物技術，1986,4:214；Gillies,D.D.，等，免疫學方法雜志，1989,125:191-202；和美國專利5807715。可應用各種技術對抗體進行人源化，包括CDR移植(EP0239400；WO91/09967；美國專利5530101；和5585089)，鑲面技術或重新布置技術(EP0592106,EP0519596；PadlanE.A.，分子免疫學，1991,28(4/5):489-498；StudnickaG.M.等，蛋白質工程，1994,7(6):805-814；RouguskaM.A.等，美國科學院研究進展，1994,91:969-973和鏈重排技術(美國專利5565332)。人類的抗體可以通過本領域所知的許多方法進行合成，包括上述的噬菌體展示技術。還可見美國專利4444887,4716111,5545806和5814318；98/46645(以其全文作為參考文獻)。
本發明還包括重組融合或化學綴合(包括共價和非共價連接)的本發明的多肽的抗體。抗體可對非本發明多肽的抗原是特異的。例如，通過本發明的多肽與可以特異結合細胞表面的受體的抗體進行融合或綴合的方法，抗體可用以與體內或體外的特異類型細胞中的本發明的多肽靶向性地結合。與本發明多肽的融合或綴合的抗體還可以用于本領域所熟知的體外的免疫檢測方法和純化技術。見，例如Harbor，等，同上述和WO93/21232；EP0439095；Naramura,M，等，免疫學通信，1994,39:91-99；美國專利，5475981；Gillies,S.O.等，美國科學院研究進展，1991,89:1428-1432,Fell,H.P.等，免疫學雜志，1991,146:2446-2454(以其全文作為參考文獻)。
本發明還包括含有與不是可變區的抗體的結構域重組融合或化學綴合的本發明多肽的組合物。例如，本發明的多肽可以與抗體的Fc區或Fc區的部分進行融合或綴合。與本發明的多肽融合的抗體部分含有絞鏈區，CH1,CH2,CH3結構域或所有結構域或其部分的任何組合。本發明的多肽還可以與上述的抗體部分進行融合或綴合，以提高多肽在體內的半衰期或用于本領域所熟知的免疫檢測方法。多肽還可以與上述的抗體部分進行融合或綴合形成聚合物。例如，與本發明的多肽進行融合的Fc片段，應用Fc的片段之間的二硫鍵形成二聚體。通過多肽與IgA和IgM中的部分融合，形成高級的多聚體。用于本發明的多肽與抗體的部分進行融合或綴合的方法，為本領域所熟知的。見，例如，美國專利，5336603,56229229,5359046,5349053,5447851,5112946；EP367166；WO96、04388,WO91/06570；Ashkenazi,A，等，美國科學院研究進展，1991,88:10535-10569；Zheng,X.X.，等，免疫學雜志，1995,154:5590-5600；和Vil,H，等，美國科學院研究進展有，1992,89:11337-11341(上述參考文獻附此供參考)。
本發明還與作為本發明多肽興奮劑或拮抗劑的抗體有關。例如，本發明包括完全或部分抑制受體/配體與本發明多肽相互作用抗體。包括受體特異的抗體和配體特異的抗體。還包括不能抑制配體結合但可抑制受體激活的受體的特異抗體。受體的激活(即信號轉導)可以通過本文所述的方法或本領域所熟知的其他方法來確定。還包括既可抑制結合配體又可以抑制受體激活的受體特異的抗體。同樣地，還包括可以結合配體，并能抑制配體與受體的的結合的中和性抗體，以及結合配體的抗體，因此，可以抑制受體的活化，但是不能抑制配體與受體的結合。還包括可以激活受體的抗體。這些抗體可以作為興奮劑，在配體-受體的活化過程中，完全發揮或部分發揮其生物學活性。作為具有生物學活性(包括本文所闡述的特異的活性)的興奮劑或拮抗劑的抗體可以是特異的。上述抗體的興奮劑應用本領域所熟知的方法進行合成。見，例如，WO96/40281；美國專利5811097；Deng,B，等，血液，1998,92(2):1981-1988；Chen,Z，等，癌癥研究，1998,58(16)；3668-3578；Harrop,J.A.，等，免疫學雜志，1998,161(4):1786-1794；Zhu,Z，等，癌癥研究，1998,58(15):3209-3214；Yoon,D.Y.等，免疫學雜志，1998,160(7):3170-3179；Prat,M，等，細胞科學雜志，1998,111(pt2):237-247；Pitard,V，等，免疫學方法雜志，1997,205(2):177-190；Liautard,J，等，細胞因子，1997,9(4):233-241；Carlson,N.C.，等，生物化學雜志，272(17):11295-11307；Taryman,R.E.，等，神經元，199514(4):755-762；Muller,Y.A.，等，結構，1988,6(9):1153-1167；Bartunek,P，等，細胞因子，1996,8(6):14-20(上述參考文獻附此供參考)。
轉基因本發明多肽也可在轉基因動物中被表達。任何一種動物，包括但不僅限于，小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、鼠、豬、微型豬、山羊、綿羊、母牛及非人的靈長類如狒狒、猴子和黑猩猩可用于構建轉基因動物。在特殊的實施例中，作為一個基因治療方案的一部分，本文所描述的或其它本領域中熟知的技術被用于在人體中表達本發明的多肽。
任何本領域中熟知的技術均可用于將轉基因(例如，本發明中的多核苷酸)引入動物體內以產生轉基因動物的始祖系。這些技術包括但不僅限于，前核微注射(Patersoil et al.，應用微生物技術，40:691-698(1994)；Carver et al.，生物技術(紐約，NY)11:1263-1270(1993):Wright et al.，生物技術(紐約，NY)9:830-834(1991):Hoppe et al.，美國專利第4873191號(1989))逆轉錄病毒介導的將基因轉移至干細胞系(Van der Putten et al.，美國科學院研究進展，82:6164-6152(1985))胚囊或胚胎；基因靶向至胚胎于細胞中(Thompson et al.，細胞，56:313～321(1989))細胞或胚胎的電穿孔(Lo,1983，分子細胞生物學，3:1803～1814(1983))用基因槍將本發明中的多核苷酸導入法(見例，Ulmeretal.，科學，259:1745(1993))；將核酸構建產物導入胚胎多能干細胞并將干細胞轉回至胚囊中；精子介導的基因轉移(Lavitrano et al.，細胞，57:717～723(1989))等等。對這類技術的回顧，參見Gordon，“轉基岡動物”國際細胞學綜述115:171～229(1989)，附此可供參考。
任何本領域中熟知的技術均可用于產生含有本發明的多核苷酸的轉基因克隆，例如，將來自于被培養誘導至靜止期的胚胎，胎兒，或成熟細胞的細胞核移植入去核的卵母細胞中(Canlpell et al.，自然，380:64～66(1996)；Wilmut et al.，自然385:810～813(1997))。
本發明提供了所有細胞均攜帶有轉基因的轉基因動物，也有部分而不是全部細胞攜帶有轉基因的動物，例如鑲嵌型和嵌合體動物。轉基因可以以單個轉基因的形式也可以多拷貝的形式如在多聯體中頭-頭串聯或頭-尾串聯形式被整合。轉基因也可按下面的方法被選擇性地引入特定的細胞類型中并被激活，例如Lasko等的講義(Lasko et al.，美國科學院研究進展89:6232～6236(1992))。這種細胞類型特異性激活所需的調控序列視目的特定細胞類型而定并可見于本領域的常用技術中。當希望該多核苷酸轉基因被整合入染色體的內源基因位點時，推薦采用基因導向技術。簡單地說，當這種技術被應用時，為通過與染色體序列的同源重組而整合入并破壞內源基因核苷酸序列的功能，設計了含有與內源基因同源的核苷酸序列的載體。轉基因可按照下面的方法被選擇性地引入一種特定的細胞類型，從而僅在該類型細胞中使內源性基因失活，例如Gu的講義(Gu et al.，科學，265:103-106(1994))，這種細胞類型特異性的失活所需的調控序列視目的特定細胞類型而定并可見于本領域的常用技術中。
一旦產生出轉基因動物，可用標準技術來測定重組基因的表達。起始檢測可通過Southern印跡斑點雜交分析和PCR技術來分析動物組織以確定發生了轉基因的整合。轉基因動物組織中轉基因的mRNA表達水平可用下列技術確定，這些技術包括但不僅限于，對來自于動物的組織樣品的Northern印跡雜交分析，原位雜交分析，逆轉錄-PCR(rt-PCR)。轉基因的基因表達組織樣品也可用特異性的轉基因產物的抗體進行免疫細胞化學或免疫組化分析。
一旦產生了原始的動物模型，即可進行繁殖、自交，遠系繁殖或雜交以產生特定動物的克隆系，類似的繁殖策略包括但不僅限于，將原始動物模型同超過一種整合位點的動物進行遠系雜交以建立不同的種系；不同種系的自交以產生復合的轉基因動物，由于每個轉基因表達的添加效應可更高水平地表達轉基因；雜合轉基因動物之間的雜交以產生給定位點上的雜種動物不但可以增加表達也可以避免進行DNA分析來篩選動物，不同種系之間的雜交以產生復合的雜合系和純合系；繁殖動物以將轉基因置于一個獨特的適用于感興趣的實驗模型的背景中。
本發明的轉基因和“敲除”動物的應用包括但不僅限于，用于闡述TNF-γ多肽生物功能的動物模型系統，研究與TNF-γ表達異常相關的病情和/或病癥，以及篩查能有效改善這些病情和/或病癥的化合物。
也可以通過利用靶向同源重組的方法失活或“敲除”TNF-γ基因和/或其啟動子以降低內源性基因的表達(例如，見Smithies etal.，自然，217:230～234(1985)；Thomas&Capecchi，細胞，51:503～512(1987)；Thompson et al.，細胞，5:313-321(1989)；各文獻附此可供參考)，例如，可采用本發明中的一個突變，無功能的多核苷酸(或一個完全無關的DNA序列)其兩側同與內源性多核苷酸序列同源的DNA相連(可以是基因的編碼區或調控區域)，帶有或不帶有選擇性標記和/或陰性選擇標記，來轉染可體內表達本發明多肽的細胞。在另一個實施例中，采用本領域熟知的技術產生含有但不表達目的基因的敲除細胞。通過靶向同源重組的DNA構建產物插入導致靶基因的失活。這些方法特別適用于研究及農業領域，在這些領域中胚胎干細胞可被用于產生帶有失活靶基因的動物后代(例如，見Thomas&Capecchi 1987以及Thompson 1989,supra)。然而，如果利用適當的本領域技術中所常見的病毒載體將重組DNA構建體在體內引導或導向至所需位點，可將此方法進行常規改進以用于人體。
在本發明的其它實施方案中，將經遺傳改造以表達本發明的多肽的細胞或經遺傳改造后不表達本發明多肽的細胞(例如，敲除)經體內法導入患者。這類細胞可來源于患者(如，動物，包括人)或一個MHC相容的供體且包括但不僅限于成纖維細胞，骨髓細胞，血細胞(例如，淋巴細胞)，脂肪細胞、肌肉細胞、內皮細胞等。采用重組DNA技術將本發明多肽的編碼序列引入細胞內，也可以破壞編碼序列和/或內源的與本發明多肽相關的調控序列對細胞進行遺傳改造，例如，通過轉導(用病毒載體，最好是將轉基因整合至細胞基因組的載體)或轉染過程，包括但不僅限于，利用質粒，粘粒，酵母人工染色體(YACs)、裸露的DNA，電穿孔，脂質體等。本發明多肽可被置于強的組成性或可誘導啟動子或啟動子/增強子的控制之下以進行表達，最好是分泌本發明多肽。表達且最好能分泌本發明多肽的經改造的細胞可被系統地引入病人體內，例如，在循環系統中或腹膜內。另一種選擇是，可將細胞混入基質中并移植到機體內，例如，經遺傳改造的成纖維細胞能作為皮膚移植物的一部分被移植到體內，經遺傳改造的內皮細胞可作為淋巴管或血管移被移植到體內，經遺傳改造的內皮細胞可作為淋巴管或血管移植物的-部分被移植。(見，例如，Anderson et al.，美國專利第5399349號；及Mulligan&Wilson，美國專利第5460959號；各文獻附此可供參考)當被引入細胞為非自體型或非MHC相容細胞時，可用熟知的能防止宿主發展對導入細胞的免疫反應的技術將其引入。例如，可將細胞以膠囊化形式引入，該形式可允許同直接接觸的胞外環境進行成分交換，但不會使被引入的細胞被宿主的免疫系統所識別。
免疫及循環系統相關疾病診斷本發明人已揭示TNF-γ在人臍靜脈內皮細胞、誘導的內皮細胞、巨噬細胞及substantia nigra組織中表達。對許多免疫及循環系統相關疾病而言，可以檢測在取自這種疾病患者的免疫及循環系統組織或其它細胞或體液(如血清，血漿，尿液，滑液或腦脊液)中，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表達水平與“標準”TNF-γ-α和/或TNF-γ一β基因表達水平相比照是增高還是降低，“標準”水平是TNF-γ-α或TNF-γ-β在沒有免疫及循環系統疾病的個體的免疫及循環系統組織或體液中的基因表達水平。因此，本發明提供了一種用于診斷免疫及循環系統疾病的方法，包括測定編碼TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的基因在個體免疫及循環系統組織或其它細胞或體液中的表達水平，并將其與標準TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表達水平相對比，此基因表達水平的增高或降低表示患有免疫及循環系統疾病。
尤其地，據信，患有免疫及循環系統癌癥的哺乳動物的一些組織中，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白及編碼TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的mRNA的表達水平與相應的“標準”水平相比時明顯降低。另外，據信在患有這種癌癥的哺乳動物的體液(如血清，血漿，尿液及腦脊液)中檢測中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的表達水平，比在相同種類未患癌癥的哺乳動物的血清中表達水平要增強。
因此，本發明提供了用于診斷免疫及循環系統疾病，包括這些系統的癌癥的一種診斷方法，包括測定編碼TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的的基因在個體免疫及循環系統組織或其它細胞或體液中的表達水平，并將之與標準TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表達水平相對比，此基因表達水平的增高或降低表示患有免疫及循環系統疾病。
當診斷免疫及循環系統疾病包括腫瘤的方法已根據常規方法制定時，本發明是用作預測指示劑，從而呈現TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表達降低的患者比基因表達水平接近正常水平的患者臨床后果更嚴重。
“分析編碼TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的基因的表達水平”是指對TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白或編碼TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的mRNA在第一個生物樣本中的表達水平，進行直接(如通過確定或估計絕對蛋白質水平或mRNA水平)或間接(如通過與在第二個生物樣本中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白或mRNA水平相對比)地定性或定量測定或估計。優選地，在第一個生物樣本中測定或估計TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白水平或mRNA水平，并與標準水平相對比，標準水平是在取自在未患免疫及循環系統疾病的個體的生物樣本中確定的平均水平。本領域人員應意識到，一旦已知標準TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的水平或mRNA水平，其可重復地用作對照標準。
“生物樣本”是指得自含有TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白或mRNA的個體，體液，細胞系，組織培養物或其它源料的生物樣本。如所示的，生物樣本包括含有游離TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的體液(如血清、血漿、尿液、滑液及腦脊液)，表達完整或成熟TNF-γ-α和/或TNF-γ-β或TNF-γ-α和/或TNF-γ-β受體的免疫及循環系統組織及其它組織源料。本領域熟知從哺乳動物獲取活組織及體液的方法。如果生物樣本包括mRNA，則活檢組織是優選的。
總細胞RNA可用任何適當技術從生物樣本中分離，如Chomczynski及Sacchi所述一步硫氰酸胍-苯酚-氯仿法(生物化學分析162:156-159(1987))。編碼TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的mRNA水平然后用任何適當方法分析。這些方法包括Northern印跡分析，S1核酸酶作圖，聚合酶鏈反應(PCR)，逆轉錄聚合酶鏈反應，及逆轉錄連接酶鏈反應。
分析TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白在生物樣本中的水平可用基于抗體的技術進行。例如，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白在組織中表達可用分類免疫組織學方法進行研究(Jalkanen,M.等，細胞生物學雜志101:976-985(1985)；Jalkanen,M.等，細胞生物學雜志105:3087-3096(1987))。其它基于抗體的用于檢測TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白基因表達的方法包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。本領域已知適當的抗體分析，并包括酶標記如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素如碘(125I,121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(112In)及(99mTc)，以及熒光標記如熒光素和羅丹明及生物素。
除分析得自個體的生物樣本中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的水平之外，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白也可經成象而體內檢測。體內成象的抗體標記包括通過X-放射顯影，NMR或ESR可檢測的那些標記。對X-放射顯影而言，適當標記包括放射性同位素如鋇或銫，其發射可檢測的輻射但對患者沒有明顯的損害。適當的用于NMR和ESR標記包括具有可檢測的特有自旋如氚的標記，其可通過標記相應雜交瘤的養分而摻入抗體。
已用適當的可檢測成象組分如放射性同位素(例如131I,112In,99mTc)，不透射線的物質，或通過核磁共振可檢測物標記的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白特異抗體或抗體片段，導入(例如非腸道地，皮下或腹膜內)檢測患有免疫系統疾病的哺乳動物中。本領域應知所用的樣本大小及成象系統將確定需要產生診斷性圖象的成象組分的量。在放射性同位素情況中，對人而言，注射的放射活性量一般為大約5～20毫居里的99mTc。標記的抗體或抗體片段然后將在含有TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的細胞位置優先積累。體內腫瘤成象見于Burchiel等所述(腫瘤成象第十三章癌癥的放射化學檢測，Burchiel,S.W.及Rhoodes,B.A.,eds.,Masson PublishingInc.(1982))。
治療如上所述，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多核苷酸及多肽用于診斷體內TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的表達異常增高或降低的疾病。給定的細胞及組織中若TNF-γ-α和/或TNF-γ-β是表達的且活性由TNF-γ-α和/或TNF-γ-β調節，則將很容易地意識到個體中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的表達水平與標準水平相比的實際變化(提高或降低)，產生與其中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β是表達的和/或是活性的機體系統相關的病理變化。
本領域熟知，除了特異的細胞功能之外，細胞受體分子也通常被病毒用作開始進入潛在宿主細胞的工具。例如，Wu等近來發現(J.Exp.Med.185:1681-1691(1997))細胞趨化因子受體CCR5不僅作為細胞趨化因子受體，也作為嗜巨噬細胞人免疫缺陷病毒(HIV)-1的受體。另外，是細胞趨化因子受體CCR5興奮劑的RANTES,MIP-1a和MIP-1b抑制各種HIV-1毒株進入易感細胞系(Cocchi,F.等，科學270:1811-1815(1995))。因此，本發明還提供了一種治療病毒感染的方法，通過預防性或治療性地施用TNF-γ-α和/或TNF-γ-β或其興奮劑或拮抗劑，以破壞或阻斷病毒顆粒與TNF-γ-α和/或TNF-γ-β受體的相互作用，從而阻止病毒開始感染或持續感染。
本發明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β與它們的受體結合，這樣能阻止嗜免疫及內皮細胞病毒感染。編碼本發明多肽的cDNA克隆的表達模式提示此分子主要在內皮細胞及選擇性造血組織中表達。這些觀測結果結合在一起可推測，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的興奮劑及拮抗劑包括受體可用于阻止或另外調節嗜免疫細胞病毒的感染。能感染人且能感染造血系統細胞的病毒包括但非限于逆轉錄病毒如HIV-1,HIV-2，人嗜T細胞淋巴細胞病毒(HTLV)-Ⅰ和HTLV-Ⅱ，以及其它DNA和RNA病毒如單純皰疹病毒(HSV)-1,HSV-2,HSV-6，巨細胞病毒(CMV),EB病毒(EBV),herpes samirii，腺病毒，鼻病毒，流感病毒，呼腸病毒等。
本發明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β或其興奮劑或拮抗劑預防性或治療性地阻止病毒感染的能力，本領域技術人員可輕易測試。例如，Simmons等(科學276:276-279(1997))及Arenzana-Seisdedos等(自然383:400(1996))均提出了一種方法，觀測在培養的周圍血單核細胞中，CCR5趨化因子受體和CC趨化因子RANTES的拮抗劑分別對HIV-1感染的抑制。在上述兩種情況中細胞是培養的且然后用病毒HIV-1感染的。CC趨化因子或其受體的興奮劑或拮抗劑然后立即加入培養基中。通過在感染后第3,6及9天估計病毒感染的相對成功率，確認趨化因子或細胞受體的興奮劑或拮抗劑的能力。
如下述對感染病毒或有感染病毒風險的個體施用一種藥物組合物，該組合物含有一定量的本發明分離的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β，或它們的興奮劑或拮抗劑。
本發明還用于診斷或治療哺乳動物優選人體中各種免疫及循環系統相關的疾病。這種疾病包括腫瘤(不完全性地包括乳腺癌，結腸癌，心臟腫瘤，胰腺癌，黑色素瘤，視網膜，成膠質細胞瘤，肺癌，小腸癌，睪丸癌，胃癌，成神經細胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，內皮瘤，成骨細胞瘤。破骨細胞瘤，腺瘤等)及腫瘤轉移，細菌、病毒及其它寄生蟲感染，免疫缺陷，感染性疾病，淋巴腺炎，自身免疫疾病，移植物及宿主間疾病及任何免疫及循環系統細胞功能失調包括但非限于自身免疫性，關節炎，白血病，淋巴瘤，免疫抑制，免疫性，體液免疫性，感染性腸道疾病，骨髓抑制等。
由于TNF-γ已表現出可誘導細胞NF-Kb和C-jun N端激酶(JNK)活化，因此其還可用于治療性調節這種細胞及免疫系統疾病如腫瘤及腫瘤轉移，細菌、病毒及其它寄生蟲感染，免疫缺陷，感染性疾病，淋巴腺炎、自身免疫疾病，移植物與宿主間排斥，自身免疫性，關節炎，淋巴瘤，免疫抑制，感染性腸道疾病，骨髓抑制等相關疾病。
由于TNF-γ-α和/或TNF-γ-β屬于TNF超家族，因此它們還可調節血管生成。另外，由于TNF-γ-α和/或TNF-γ-β抑制免疫細胞功能，因此其具有廣泛的抗感染活性。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β可用作抗新血管生成劑，通過刺激宿主防御細胞如細胞毒性T細胞和巨噬細胞的侵染及活化，并抑制腫瘤的血管生成以治療實體腫瘤。本領域技術人員將意識到其中血管增殖是非所需的其它非癌疾病。TNF-γ還可用于增強宿主對慢性和急性感染的防御性，例如通過殺微生物的淋巴細胞的吸附及活化防御肌細菌感染。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β還可通過抑制IL-2生物合成用于抑制T細胞增殖，以治療T細胞相關的自身免疫疾病及淋巴細胞性白血病。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β還可用于促進傷口愈合，均是通過募集清除碎片及結締組織活動炎癥細胞而進行。以此方式，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β還可用于治療其它纖維化疾病包括肝硬化，骨關節炎及肺纖維化。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β還提高嗜伊紅性粒細胞的數量，該細胞具有殺死大量侵入組織的寄生蟲如血吸蟲、毛線蟲及蛔蟲的獨特功能。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β還可用于調節造血功能，通過調節各種造血原細胞的活化及分化，例如在化療后從骨髓中釋放成熟白細胞，即干細胞轉移。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β還可用于治療敗血癥。
以相似方式，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β可用于治療類風濕性關節炎(RA)，其是通過抑制在RA中經常見到的侵入骨與軟骨血管翳所需的血管生成或內皮細胞增殖的提高而進行。RA患者滑膜中內皮細胞增殖高于骨關節炎(OA)或正常個體中內皮細胞增殖。新血管生成需要維持侵入骨和軟骨的血管翳的增加量。血管生成的抑制與動物模型中早期和慢性關節炎的嚴重性明顯降低相關。
本領域技術人員也應意識到，由于本發明TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白是TNF家族成員，因此成熟分泌形式的蛋白質可以溶解形式通過蛋白酶解從表達TNF-γ的細胞中釋出。因而，當TNF-γ-α和/或TNF-γ-β成熟形式或溶解的胞外結構域從外源來源加至個體細胞、組織或機體時，此蛋白質將對其個體的靶細胞呈現生理活性。表達此類跨膜蛋白Ⅱ的細胞可加入個體的細胞組織或機體，且這些加入的細胞將結合表達TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的受體的細胞，從而表達TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的細胞可導致對攜帶受體的靶細胞的作用(如調節內皮細胞生長)。
因而應意識到，由于個體TNF-γ-α和/或TNF-γ-β活性水平的降低引起的疾病，尤其免疫和循環系統疾病，可通過施用TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽(成熟蛋白質形式)而治療。因此，本發明還提供了治療需要提高TNF-γ-α和/或TNF-γ-β活性水平的個體的方法，包括對這種個體施用一種藥物組合物，該藥物組合物包含一定量的本發明的分離的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β，所述的量足以有效地提高這種個體中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的活性水平。
本發明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽可用于抑制腫瘤細胞生長或瘤形成。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β可通過細胞程序死亡破壞腫瘤，細胞程序死亡特征在于膜皰疹樣變(zeiosis)，細胞質凝聚及內源性內切核酸酶活性(圖12)。如表1所示，TNF-γ對測試的具有異常細胞增殖和調節的細胞系列例如纖維肉瘤和癌細胞系有強毒性。如圖7A,7B和8所示，TNF-γ通過胞毒活性具有抑制L929和WEHI 164細胞生長的能力。WEHI164細胞是鼠纖維肉瘤細胞。一種優選的施用TNF-γ的方法是直接注射入腫瘤。
TNF-γ的細胞吸附活性可用于傷口愈合。如表1和圖9所示，TNF-γ具有強內皮細胞增殖作用，這表明TNF-γ在傷口愈合中起作用。TNF-γ細胞粘附作用也可在傷口愈合中起作用。
TNF-γ也可用于治療需要生長促進活性的疾病，例如再狹窄。如上所示，TNF-γ表現出對內皮細胞生長具有強增殖作用。因此，TNF-γ也可用于調節造血及內皮細胞生長。
TNF-γ多肽通過其刺激T細胞活化是免疫應答的重要介體。由此，此多肽可用于刺激抗各種寄生蟲、細菌和病毒感染的免疫應答。TNF-γ可裂解病毒感染的細胞，并因而用于抑制HIV感染的細胞。
TNF-γ多肽還可用于治療自身免疫疾病，如通過增強T細胞增殖應答而治療Ⅰ型糖尿病。表2TNF-γ活性概況來源及細胞系類型細胞毒性增殖分化粘附小鼠L929 成纖維細胞 + - - -小鼠WEHI164 纖維瘤 +++- - -大鼠腎NRK-54E 內皮樣 + - - -人THP-1 單核細胞 + - ++ ++白血病人HL-60 早幼粒細胞 - - - ++白血病人RajiBurkitt - - --淋巴瘤人Jurkat T細胞++ - --淋巴瘤原代 HUVEC- ++ -？人動脈原代 內皮+*++ -？人A-431 表皮樣 ++ - --癌人293 胎 - ++ --腎注*僅在高劑量。“+”表示活性相對水平。
“-”表示在所測濃度范圍無可檢測活性
TNF-γ可用于抑制內皮細胞增殖，例如動脈內皮細胞。如圖10所示，在近于10μg/ml濃度，TNF-γ可接近完全地抑制內皮細胞生長，而對人乳腺癌細胞的生長無明顯影響。因此，TNF-γ可用于治療抑制內皮細胞增長是有利的疾病。在治療由于新血管產生而支持腫瘤生長的癌癥中，需要抑制內皮細胞生長。TNF-γ可通過抑制是血管主要細胞組分的內皮細胞的生長而抑制這種腫瘤的生長。TNF-γ在此方面的應用效果見圖16A和16B所示。這些試驗將在以下詳細闡述。
尤其地，TNF-γ可在內皮細胞已經開始增殖時調節細胞生長。這種情況如上述在當血管生成是作為腫瘤支持機制而發生時。內源性TNF-γ表達在內皮細胞的增殖培養物中是降低的，而在靜止內皮細胞培養物中是增強的(圖4)。因此，優選使用本發明的TNF-γ降低增殖內皮細胞培養物中細胞生長的速度，例如在癌癥狀態中腫瘤大小增大期間。
本發明的TNF-γ已用于在體外降低由內皮細胞形成的類毛細管結構的形成。如圖14所示，本發明的TNF-γ可用于抑制由于應答抗原因子如FGF-2，內皮細胞器官化形成類毛細管結構。另外，本發明分離的TNF-γ也可用于抑制修飾的雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中內皮細胞的生長及器官化為毛細管，如圖15所示。因此，本發明的TNF-γ可用于抑制體外內皮細胞形成毛細管或類毛細管結構。
本發明的TNF-γ可用作抗癌劑。如圖16所示，TNF-γ用于抑制異種移植腫瘤模型中人乳腺癌細胞的生長。盡管這些細胞具有高致瘤性，用本發明的TNF-γ治療可明顯抑制異種移植腫瘤的生長。本發明的TNF-γ，或其突變蛋白，可用于治療許多癌癥包括但非限于乳腺癌，結腸癌，心臟腫瘤，胰腺癌，黑色素瘤，視網膜瘤，成膠質細胞瘤，肺癌，小腸癌，睪丸癌，胃癌，成神經細胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，內皮瘤，成骨細胞瘤，破骨細胞瘤，腺瘤等。
本發明的多核苷酸和多肽可用于作研究制劑和材料用以發現人類疾病的治療和診斷方法。
本發明提供了一種鑒別TNF-γ受體的方法。編碼此受體的基因可用各種本領域已知方法鑒別，例如配體淘選及FACS分選(Coligan等，免疫學當前方案1(2)，第5章(1991))。優選地，應用表達克隆，其中聚腺苷酸化的RNA制備自應答TNF-γ的細胞，且產生自此RNA的cDNA文庫被分成集合體并用于轉染對TNF-γ不應答的COS細胞或其它細胞。在玻片上生長的轉染的細胞曝光于標記的TNF-γ。TNF-γ可通過各種方法標記，包括碘化或包含位點特異性蛋白激酶的識別位點。在固定及培養后，將此玻片進行放射自顯影分析。鑒別陽性集合體并制備亞集合體，再重復用亞克隆轉染并重篩選，最終產生編碼推定的受體的單一克隆。
另一種鑒別受體的方法中，標記的TNF-γ可用細胞膜或表達受體分子的提取制備物進行光親和連接。交連物經PAGE解離并在X線下曝光。切下含有TNF-γ受體的標記的復合物，解離成肽片段，并進行蛋白質微量測序。得自微量測序的氨基酸序列將用于設計一系列簡并的寡核苷酸探針，以篩選cDNA文庫以鑒別編碼推定的受體的基因。
TNF-γ不與兩種可溶的TNF受體sTNF-RⅠ(p55)和sTNF-RⅡ(p75)有效結合。因此，TNF-γ可具有已知TNF蛋白質所包含的活性及其它活性。
配方TNF-γ多肽組合物以良好的醫學實踐，考慮到個體患者的臨床癥狀(尤其單用TNF-γ多肽治療的副作用)，TNF-γ多肽組合物的釋放位點，施用方法，施用計劃及醫生已知的其它因素而制備。TNF-γ多肽的“有效量”將根據這些因素而確定。
拮抗劑可與本文如下所述藥物可接受載體組合應用。
TNF-γ多肽，多核苷酸和興奮劑和拮抗劑可以與合適的藥物載體一起聯合使用。這些組合物包括治療有效量的該化合物和一種適合藥用的載體或賦形劑。此類載體包括但不僅限些，金屬鹽類，緩沖鹽，水，甘油，乙醇，以及上述幾種的混合物。配方應適合應用方式。
本發明還提供了一套藥物包或藥盒，其中包括一個或多個充滿一種或多種本發明的藥物組合物的容器。所使用的容器中還可包括負責藥品或生物制品生產，應用或銷售的政府部門的通知，該通知反映出允許用于臨床的生產，應用或銷售。另外，藥物組合物可以與其他有治療作用的化合物聯合使用。
藥物組合物可以按方便的方法使用，如外用，靜脈，腹腔，肌肉，腫瘤內，皮下，肛門或皮內等途徑。使用的藥物組合物的量應是對適應癥起到有效的治療和/或預防。總的來說，藥物組合物使用劑量至少為10μg/kg體重，并且在多數情況下，使用的劑量每天不超過8mg/kg體重。多數情況下，使用劑量為每天從10μg/kg到1mg/kg，還應考慮到用藥途徑，癥狀，等。
基因治療本發明中，TNF-γ多肽和多肽類的興奮劑或拮抗劑還可通過在體內表達進行應用，也就是在前文經常提到的“基因治療”。
因此，患者的細胞可借助于編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進行間接體內實驗，進行工程化處理，再把工程化細胞植入患者體內，利用表達的多肽進行治療。這些方法為本領域里所熟知的。例如，應用本領域所熟知的操作方法，即用含有編碼本發明多肽RNA的逆轉錄病毒顆粒對細胞進行工程化處理。
例如，同樣也可以通過本領域所熟知的技術方法，進行在體內細胞的工程化處理，使多肽在體內表達。正如本領域所熟知的，用于制備含有編碼本發明多肽RNA的逆轉錄病毒顆粒的細胞，可以用于患者，在體內制備工程細胞，以及在體內進行多肽的表達。用于制備本發明多肽的這些方法和其他方法，對本領域的熟練的技術人員來說，非常清楚。例如，用于工程細胞的表達載體，可以不是逆轉錄病毒顆粒，例如是腺病毒，其與其他合適的載體聯用也可以用于在體內制備工程細胞。
上述逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄病毒可來自，但不僅限于，莫羅尼(Moloney)鼠白血病病毒，脾壞死病毒，逆轉錄病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey(哈維)肉瘤病毒，禽類造血白細胞組織增生病毒，長臂猿白血病病毒，人類免疫缺陷病毒，腺病毒，髓性增生性肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。在一個實施例中，逆轉錄病毒質粒載體來自莫羅尼(Moloney)鼠白血病病毒。
載體包括一個或多個啟動子。所使用的合適的啟動子包括，但不僅限于，逆轉錄病毒LTR啟動子；SV40啟動子；和人巨細胞病毒(CMV)啟動子(見Miller，等，生物技術，1989,7:980-990)，或其它任何啟動子(如細胞啟動子如真核細胞啟動子，包括但不僅限于，組蛋白，pol Ⅲ，和b-肌動蛋白等的啟動于)。也可以使用其它病毒的啟動子，包括但不僅限于這些，腺病毒啟動于，胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。選擇合適啟動子的方法，本領域的熟練的技術人員非常清楚。
編碼本發明多肽的核酸序列是在合適的啟動子的調控之下。可以使用的合適的啟動子包括，但不僅限于，腺病毒啟動子，如腺病毒主要的晚期啟動子或異源性啟動子，如巨細胞病毒(CMV)啟動于；呼吸合胞病毒(RSV)啟動于，可誘導啟動子，例如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；Apo AI(載脂蛋白AI)啟動子；人類球蛋白啟動子病毒胸苷激酶啟動子，如單純皰疹病毒-胸苷激酶啟動子，逆轉錄病毒LTRs(包括上述的經過修飾的逆轉錄病毒LTR)b-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。啟動子還包括調控編碼多肽基因的自身啟動子。
逆轉錄病毒質粒載體用于轉導包裝細胞系，形成生產細胞系。可以轉染的包裝細胞的實例包括，但不僅限于，PE501,PA317,b-2,b-AM,PA12,T19-14X,VT-19-17-H2,CRE,b-CRIP,GP+E-86,GP+envAml2和DAN細胞系(Miller，人類基因治療，1990,1:5-14，附為參考文獻)。通過本領域所熟知的任何方法，可以用載體進行轉導包裝細胞。這些方法包括，但不僅限于，電穿孔，脂質體和磷酸鈣沉淀法。另一種情況，逆轉錄病毒載體質粒可以包被在脂質體中，或與脂質偶聯，再用于宿主。
產生細胞的細胞系可以生成具有感染能力的邊轉錄病毒的載體顆粒，其中含有編碼多肽的核酸序列。再用這些逆轉錄病毒載體顆粒去轉導真核細胞，既可以是體外，也可以是體內。轉導的真核細胞將表達編碼所需的多肽的核酸序列，用于轉導的真核細胞包括，但不僅限于，胚胎干細胞，胚胎瘤細胞，以及造血干細胞，肝細胞，成纖維細胞，成肌細胞，角質細胞，內皮細胞和支氣管上皮細胞。
興奮劑與拮劑劑-分析與分子本發明還與篩選化合物，即用于證實哪些為興奮劑或拮抗劑所使用的方法有關。本方法的一個實施例是利用，在輔助有絲分裂原ConA存在時，TNF-γ具有顯著地刺激人內皮細胞的增殖的優點。內皮細胞可以在96孔的平底培養板(Costar,Cambridge，麻省)中在補加10％熱滅活胎牛血清(Hyclone Labs,Logan,UT),1％L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，0.1％慶大霉素(Gibco LifeTechnologies,Grand Island,NY)的RPM1 1640中，加入conA(Calbiochem,La Jolla，加州)，進行培養并獲得。ConA和待篩選的化合物以0.2ml終體積加入。在37℃下孵育60h后，用1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷(5Ci/mmol；lCi=37BGq；NEN)處理培養物12-18h，并在玻璃纖維濾膜上收獲(PhD,Cambridge Technology,Watertown，麻省)。通過對三份培養樣本的液閃(BeckillanInstruments,Irvine加州)計數，計算出3H-胸腺嘧核苷的摻入(cpm)的平均值。顯著的3H-胸腺嘧啶核苷的摻入表明刺激內皮細胞的增殖。
另外，TNF-γ與受體相互作用所引起的已知第二信使反應，可通過加或不加化合物時進行測量或比較。第二信使系統包括但不僅限于，cAMP鳥苷酸環化酶，離子通道或磷酸肌醇的水解。
為分析拮抗劑，進行以上所述的分析，然而在該分析中TNF和被篩選的化合物一起加入，此化合物在存在TNF-γ情況下抑制3H胸腺嘧啶的能力表明此化合物是TNF-γ的拮抗劑。或者，檢測TNF-γ拮抗劑可通過在適當條件下組合TNF-γ和潛在拮抗劑及膜結合的TNF-γ受體或重組受體，進行競爭抑制分析，TNF-γ可被標記如放射活性標記，由此結合受體的TNF-γ分子數量可確定潛在拮抗劑的效力。
或者，一種表達TNF-γ受體的哺乳細胞或細胞膜制備物與標記的TNF-γ和化合物一起培育。然后測定此化合物增強或阻斷反應的能力。
本發明另一方面提供了一種鑒別與TNF-γ多肽特異性結合的受體蛋白或其它配體結合蛋白的方法。例如，一細胞區室如細胞膜可從表達結合TNF-γ的分子的細胞中制備。此制備物與標記的TNF-γ培養，且根據本領域已知方法分離及定性TNF-γ結合受體或其它結合蛋白質的復合物。或者，TNF-γ多肽可與固體支持物結合，由此從細胞中溶解的結合分子與柱結合，然后洗脫并定性。
在本發明的興奮劑或拮抗劑的分析中，一細胞區室如細胞膜可從表達結合TNF-γ的分子的細胞中制備，如TNF-γ調節的信號轉導或調節途徑的分子。此制備物用標記的TNF-γ在有或無可能是TNF-γ興奮劑或拮抗劑的候選分子的情況下培養。此候選分子與結合分子的結合能力反映在標記的配體結合降低之中。無條件結合的分子，即不誘導TNF-γ對結合TNF-γ結合分子的作用，是良好的拮抗劑。結合良好并激發與TNF-γ相同或相似作用的分子是興奮劑。
測定潛在的興奮劑及拮抗劑的類TNF-γ作用可例如通過在候選分子與細胞或合適細胞制備物相互作用后確定第二信使系統的活性后，并對比TNF-γ或激發與TNF-γ相同作用的分子的作用。用于此目的的第二信使系統包括但非限于AMP鳥苷酸環化酶，離子通道或磷酸肌苷水解第二信使系統。
另一種TNF-γ拮抗劑分析的例子是組合TNF-γ和潛在拮抗劑與膜結合的TNF-γ受體分子或重組TNF-γ受體分子，在適當條件下進行競爭抑制分析。TNF-γ可被標記，如放射活性標記，由此準確地確定結合受體分子的TNF-γ分子的數量以判斷潛在拮抗劑的效力。
潛在的拮抗劑包括與本發明的多肽結合的小有機分子，肽，多肽和抗體，并從而抑制或消滅其活性。潛在的拮抗劑也可以是小有機分子，肽，多肽；如在結合分子(如受體分子)相同位點結合的密切相關的蛋白質或抗體，而不誘導TNF-γ誘導的活性，從而通過拒絕TNF-γ結合而阻止TNF-γ的作用。
其它潛在的拮抗劑包括反義分子。反義技術通過三螺旋的形成或反義DNA或RNA，用于調控基因表達。反義技術見于許多研究中所揭示(例如Okano，核酸化學雜志56:560(1991)；“作為基因表達反義抑制劑的寡脫氧核苷酸”，CRC出版，Boca Raton,FL(1988))。三螺旋形成見于許多研究所述(例如，Lee等，核酸研究6:3073(1979)；Cooney等，科學241:456(1988)；Dervan等，科學251:1360(1991))。這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA結合的原理。例如，多核苷酸序列的5’編碼區(該核苷酸序列編碼成熟的本發明多肽)可用于設計長度為10-40個堿基對的反義RNA寡核苷酸序列。制備的DNA寡核苷酸序列與參與基因轉錄的一個區互補，因此可以阻止轉錄和TNF-γ生成，反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交，抑制mRNA分子翻譯成TNF-γ多肽，上述的寡核苷酸還可以導入細胞中，從而使反義RNA或DNA可以在體內表達，抑制TNF-γ的生成。
特異于TNF-γ的抗體通過結合TNF-γ并阻止TNF-γ與其受體結合而可用作拮抗劑。單克隆抗體尤為有效。然而，特異于TNF-γ受體的抗體可介導明顯的細胞應答，此抗體在與其受體相互作用時趨于激發TNF-γ的作用。
潛在的TNF-γ拮抗劑還包括TNF-γ突變體，其結合TNF-γ受體并不激發第二信使應答以有效地破壞受體與天然配體的結合。特別設計的寡核苷酸和小分子也可結合TNF-γ受體(如DR3)并破壞其與TNF-γ的結合，這種小分子例如包括但非限于小肽或類肽分子。
其它潛在的TNF-γ拮抗劑是TNF-γ受體的可溶形式，其結合TNF-γ并阻止其與膜結合的TNF-γ受體相互作用。以此方式，此受體不受TNF-γ刺激。
另一種可能的拮抗劑為借助反義技術制備的反義構建體。反義技術通過三螺旋的形式或反義DNA或RNA，用于調控基因表達。這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA結合的原理。例如，多核苷酸序列的5’編碼區(該核苷酸序列編碼成熟的本發明的多肽)可用于設計長度為10-40個堿基對的反義RNA寡核苷酸序列。制備的DNA寡核苷酸序列與參與基因轉錄的一個區互補(三螺旋，見，Lee等，核酸研究，1979,6:3073:Cooney，等，科學，1988,24:456；和Dervan，等，科學，1991,251:1360)，因此，可以阻止轉錄和TNF-γ的生成。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交，抑制mRNA分子翻譯成TNF-γ多肽(反義-Okano，神經化學雜志，1991,56:560；寡聚脫氧核糖核酸作為基因表達的反義抑制劑，1988,CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達)。上述的寡核苷酸還可以導入細胞中，從而使反義RNA或DNA可以在體內表達，抑制的生成。
TNF-拮抗劑還可用于治療惡病質，這種疾病是由TNF-γ抑制的脂蛋白脂肪酶系統性缺陷所致的脂肪明顯缺乏。TNF-γ拮抗劑也用于治療腦瘧疾，其中TNF-γ起病理作用。拮抗劑還可通過抑制TNF-γ誘導的炎癥細胞因子如IL-1在滑膜細胞中產生而用于治療類風濕性關節炎。當治療關節炎時，TNF-γ優選關節內注射。
TNF-γ拮抗劑還可通過TNF-γ阻止移植物刺激免疫系統而用于防止移植物排斥。
TNF-γ拮抗劑還用于治療骨質疏松，是由于TNF-γ可誘導骨的再吸收。
TNF-γ的拮抗劑還可用作抗炎劑，是由于TNF-γ介導增強的炎癥應答。
此拮抗劑還可用于治療膿毒性休克也稱為敗血性休克。
這種危重疾病是由于對細菌或其它類型感染的過大反應所致，此反應導致TNF-γ水平提高引起休克及組織損傷。
由于TNF-γ蛋白質在各種組織中與在正常對照組織中相比的過表達可檢測疾病的易感性，例如腫瘤及腦瘧疾，因此本發明提供了一種診斷方法檢測TNF-γ蛋白在各種組織中表達水平的變化，用于檢測衍生自宿主的樣本中TNF-γ蛋白的表達水平的分析方法，本領域已熟知，包括放射性免疫分析，競爭結合分析，Westerm印跡分析，ELISA分析和“三明治”分析。ELISA分析(Coligan等，Current Protocols In Immunology,1(2),C,(1991))包括制備一特異于TNF-γ抗原的抗體，優選單克隆抗體，另外制備抗單克隆抗體的報道抗體，此報道抗體可附有一種可檢測試劑如放射活性，熒光性或辣根過氧化物酶標記。從宿主取樣本并在結合樣本中蛋白質的固體支持物如聚苯乙烯平皿上培養。平皿上任何游離蛋白質結合位點然后用非特異性蛋白質如BSA保溫而覆蓋。接著，此單克隆抗體在平皿中培養，在此期間單克隆抗體與粘附于聚苯乙烯平皿的任何TNF-γ蛋白粘附。用緩沖液沖洗掉所有未結合的單克隆抗體，將與辣根過氧化物酶連接的報道抗體置于平皿上，使報道抗體與結合TNF-γ的任何單克隆抗體結合，然后沖洗掉未結合的報道抗體，過氧化物酶底物然后加入平皿中，且在給定時間內顯色量，當與標準曲線相對比時，可用以測定給定體積的患者樣本中TNF-γ蛋白的數量。
競爭分析可以使用，其中TNF-γ特異抗體結合在固相上，且標記的TNF-γ和衍生自宿主的樣本包被在固相上，并例如用液閃色譜法檢測標記的量與樣本中TNF-γ的量呈正相關。
“雙抗夾心”法與ELISA法相似。在用“雙抗夾心”法進行檢測時，TNF-γ包被在固相上，并且與結合在固相上的抗體結合。然后，第二抗體與TNF-γ結合。三抗為標記的，并與二抗特異結合，將其再加到固相上，并與二抗結合，可以進行定量分析。
染色體作圖本發明的序列對鑒定染色體也是有價值的，該序列是靶特異性的，能夠與人的某一染色體上的特異位點雜交，當前還用于鑒別染色體上的特異位點。目前僅有很少根據實際的序列數據(重復序列的多態性)的染色體標記試劑能對染色體進行定位。根據本發明對染色體進行DNA作圖，對那些與疾病有關的基因序列而言，是至關重要的第一步。重要的第一步。
簡而言之，作圖通過從cDNA合成PCR引物(最好15-25bp)，可以對染色體的序列進行作圖。用計算機對cDNA進行分析，可以快速地篩出在基因組DNA中不跨越兩個或兩個以上外顯子的引物，否則，會使擴增反應復雜化。這些引物用于PCR，來篩選含有人染色體的體細胞的雜合體。只有那些含有符合引物的人類基因的雜合體才能產生擴增片段。
體細胞雜合體的PCR作圖，在確定某個特異的染色體上的一個特異的DNA時，是非常快速的。同樣的寡核苷酸引物用于本發明的序列，按相同的方式，借助于來自特異染色體的一組片段或者許多大的基因組克隆，可以獲得進一步的定位。其他的類似的染色體作圖策略包括原位雜交，用標記的流式染色體進行的預篩和通過雜交進行預選來構建染色體的cDNA的特異文庫。
cDNA克隆與展開的有絲分裂中期的染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以只用一步就可對染色體進行精確定位。該技術可以與來自長度僅50或60bp的cDNA的探針一起使用。該技術的綜述請見Verma，等，人類染色體基本技術指南，Pergamon出版社，紐約，1988。
某一序列一旦在染色體上精確作圖定位，該序列在染色體上的物理位置可與遺傳作圖數據相關。例如，這些數據請參見V.McKusick的“人類的孟德爾遺傳”(可以在網上從約翰霍普金斯大學的Welch醫學圖書館獲得)。在基因和已經在同一染色體的部位作圖定位的疾病之間的關系可以通過連鎖分析來進行鑒定(物理位置相近的共遺傳)。
再者，有必要確定在發生異常和未發生異常的個體之間eDNA或基因組序列的差異。如果在一些或全部發生異常的個體(而不是所有上常個體)中均發現存在突變，那么該突變有可能是該疾病的病因。
根據現有的物理作圖和遺傳作圖技術的分辨率，與某種疾病有關的精確定位在染色體上的某個cDNA可能只是50-500種可能病因之一。(這假定100萬個堿基對的作圖分辨率和每20kb一個基因)。
利用上述技術，非常有把握地確定TNF-γ的染色體位置為qq32。先前的染色體作圖研究已將染色體9這一區域的幾個發育缺陷基因座連鎖起來。
實施例本發明將以下面的實施例作進一步描述，實施例僅供參考，但必須清楚，本發明并不僅限于這些實例。所有份數或量，如不特殊說明均指重量。
為了便于理解下述的實施例，下面敘述一些經常遇到的方法和/或術語。
“質粒”的第一個字母是為小寫p，和/或接著大寫字母和/或數字。本文使用的質粒可以購買到，公眾不受限地獲得，或按照公開發表的方法，應用現有的質粒進行構建。另外，與所述等效的質粒為本領域所熟知，并且熟練的技術人員也非常清楚。
DNA的“消化”，是指應用限制性內切酶對DNA進行催化裂解，后者只作用于DNA中的特定序列。本文所使用的不同的限制性內切酶可以從商家買到，反應條件，輔助因子和其他所必需使用的，為本領域的熟練技術人員所熟知。
在分析研究時，通常1毫克的質粒或DNA片段在20微升的緩沖反應體系中加入2單位的酶。在用分高的片段構建質粒時，通常是5-50毫克的DNA在更大的反應體系中加入20-250單位的酶。不同的限制性內切酶廠家特異提供合適的緩沖液和底物的用量。通常是在37℃孵育一小時，但可以根據試劑供應商的說明進行改變。在酶切消化后，在聚丙烯酰胺凝膠上直接進行電冰，分離所需的片段。
應用8％的聚丙烯酰胺凝膠，對酶切片段進行大小的分離，具體方法見，Goeddel,D，等，核酸研究，1980,8:4057。
“寡核苷酸”是指單鏈的多聚脫氧核糖核苷酸或兩條互補的多聚脫氧核糖核苷酸鏈，可以化學合成。這些合成的寡核苷酸沒有5’端的磷酸，因此不能與另一個寡核苷酸連接，不能在激酶的作用下，加上由ATP提供的磷酸。合成的寡核苷酸將與沒有去磷酸化的片段連接。
“連接”是指在雙鏈的核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Sambrook，等，分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989,P146)。除非使用其他方法，在已知的緩沖液和反應條件下，大約每0.5毫克的DNA片段可以用10單位的T4DNA連接酶(“連接酶”)進行連接。
除上述的方法外，轉化可以按下述方法進行，Graham,F，和VanderEb,A，病毒學，1973,52:456-457。
實施例1,TNF-γ的細菌表達及純化編碼全長TNF-γ ORF,ATCC保藏號No.75927的DNA序列先用相應于TNF-γ蛋白5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴增。相應于TNF-γ的另外核苷酸分別加入5’和3’序列中。5’寡核苷酸引物示作SEQ ID NO:3，序列為5’-GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC-3’，其含有-BamHⅠ限制酶位點，后接起始自初始甲硫氨酸密碼的TNF-γ編碼序列的頭24個核苷酸。3’序列為5’-CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG-3’(SEQID NO:14)，含有XbaⅠ位點和互補于TNF-γ的22個核苷酸的序列。此限制酶位點相當于細菌表達載體pQE-9(Qiagen)中的限制酶位點，pQE然后BamHⅠ和XbaⅠ消化。擴增的序列連于pQE-9中并插入具有編碼組氨酸標記和RBS的序列框架中，此連接混合物然后用于轉化E.coli菌株(購自Qiagen，商標為M15/rep)。轉化方法見于Sambrook,J等在分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版(1989)所述，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacⅠ阻抑物并還賦予卡那霉素抗性(Kanr)。轉化體通過其在LB平板上生長的能力鑒別，并選擇氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質粒DNA并通過限制分析確認。含有所需構建體的克隆在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB平板液板培養基上生長過夜(O/N)。此O/N培養物以1∶100～1∶250的比率用于接種大培養物，細胞生長至OD600在0.4～0.6之間。然后加入IDTG至終濃度為1mM,IPTG通過滅活lacⅠ阻抑物，清除P/O，使基因表達增加。將細胞再生長3～4小時，然后經離心收集細胞。細胞沉淀物溶于離液劑6M鹽酸胍中(鹽酸胍濃度高于或等于2.5M發現導致回收的重組蛋白純度較高)。澄清后，在使含有6-組氨酸標記的蛋白質緊密結合的條件下，通過在鎳螯合柱上層析，從此溶液中純化溶解的蛋白質(Hochuli.E等，層析學411:177-184(1984))。在鎳螯合柱上進行二次循環將TNF-γ進一步純化。TNF-γ(純度90％)自6M鹽酸胍PH5.0的柱中洗脫，并在PBS緩沖液中透析以復性。此表達產物經SDS-PAGE電泳，結果見于圖5其中標記“M”的泳道含有分子量標記；泳道1是誘導的細胞裂解物；泳道2是未誘導的細胞裂解物；泳道3是在二次鎳螯合柱純化后的TNF-γ蛋白；泳道4是在一次柱純化后的TNF-γ蛋白質。
本領域技術人員將意識到除了pQE-9之外其它細菌表達載體也可用于表達TNF-γ。一個這種優選的細菌表達載體是pHE4-5。pHE4-5可以pHE4-5/MPIFD23質粒DNA獲得(此物建體含有一個不相關的插入體，其編碼不相關的ORF)。pHE4-5/MPIFD23質粒在1997年9月30日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，登記號NO.209311，用側翼于不相關的MPIF ORF插入體的NdeⅠ和Asap718限制位點，技術人員將輕易地用通用分子生物學技術，用本發明TNF-γ ORF或其變體置換pHE4-5/MPIFD23質粒中不相關的ORF。
實施例2用桿狀菌病毒表達系統克隆和表達TNF-γ編碼全長TNF-γ蛋白的DNA序列(ATCC NO.75927)，用相當于該基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴增，5’引物序列為5’-GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC-3’(SEQ ID NO:15)，其含有-BamHⅠ限制酶位點(黑體字處)和隨后的24個TNF-γ基因的核苷酸。3’引物序列為5’-CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG-3’(SEQID NO:16)，其含有限制內切酶XbaⅠ位點和互補于TNF-γ基因3’非翻譯序列的22個核苷酸，擴增的序列用所購得的試劑盒(“Geneclean”,BIO 101 Inc.,La Jolla,CA)從1％瓊脂糖凝膠中分離。此片段然后用內切酶BamHⅠ和XbaⅠ消化，并再在1％瓊脂糖凝膠上純化。此片段稱為F2。
利用桿狀病毒表達系統(綜述參照Summers,M.D.及Smith,G.E.，“桿狀病毒載體和昆蟲細胞培養程序方法手冊”得克薩斯農業實驗站公報NO:1555,(1987)將pA2載體(pVL941載體修飾而來)用于表達TNF-γ蛋白。該表達載體含有一個Autographacaliformica核多角體病毒(AcMNPV)的強多角體蛋白啟動子隨后有BamHⅠ,XbaⅠ限制內切酶識別位點。猿猴病毒(SV)40的多聚腺苷酸位點被用于高效的聚腺苷酸化。為簡便篩選重組病毒將大腸桿菌β-半乳糖苷酶以與連有多角體蛋白基因多聚腺苷酸信號的多角體蛋白啟動子相同的方向插入。多角體蛋白序列兩側連有病毒序列使得共轉染的野生型病毒可發生細胞介導的同源重組。許多其它桿狀病毒載體也可代替pA2例如pA373,pVL941和pAcIM1(Luckow,W.A.和Summers,M.D.，病毒學170:31-39(1989))。
用限制酶BamHⅠ和XbaⅠ消化該質粒，然后根據本領域所知的程序用牛腸磷酸酶去磷酸化。用商業可得的試劑盒(“Geneclean”BIO101 Inc.,La Jolla,Ca)將DNA從1％的瓊脂糖凝膠中分離出來。此載體DNA命名為V2。
用T4DNA連接酶連接片段F2和去磷酸化的質粒V2。再轉化大腸桿菌XL1蘭細胞。通過DNA測序確定克隆片段的序列。
用脂轉染法(Felonber等，美國科學院研究進展84:7413-7417(1987))共轉染5μg pBac TNF-γ質粒和1.0μg商業可得的線性桿狀病毒(“BaculoGold桿狀病毒DNA,Pharmingen,San Diego,CA,)。
在含有50μl無血清Grace’s培養基(生命科技有限公司，Gaithersburg,M.D.)的微滴定板的一個無菌孔中混合1μgBaculoGold病毒DNA和5μg pBac TNF-γ質粒。然后加入10μl脂質體和90μl Grace’s培養基，混勻室溫孵育15分鐘。再將轉染混合物逐滴加到培養于有1ml無血清Grace’s培養基的35mm組織培養皿中的Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL 1711)。前后搖動培養皿以混勻新加入的溶液。于27℃孵育5小時。5小時后從皿中移去轉染溶液，加入補充了10％胎牛血清的1ml Grace’s培養基。培養皿放回孵箱，繼續于27℃孵育四天。
四天后收集上清，用Summers和Smith所描述的相似方法分析噬斑，見上述。一種改良是可簡便分離藍色噬斑的加有“Blue Gal”’(生命科技有限公司，Gaithersburg)的改良膠。(“噬斑分析”的詳細敘述可見生命科技有限公司，Gaithersburg，出版的昆蟲細胞培養和桿狀病毒用戶指南，9-10頁)。
系列稀釋后四天，向細胞中加入病毒，用Eppendorf移液槍頭挑走藍色噬斑。在含200mlGrace’s培養基的Eppendorf試管中重懸含重組病毒的瓊脂。稍加離心移去瓊脂，將含重組桿狀病毒的上清感染培養于35mm平皿的Sf9細胞。四天后收集這些平皿中的上清儲存于4℃。
Sf9細胞生長于補充有10％熱滅活FBS的Grace’s培養基中。感染復數為2用重組桿狀病毒V-TNF-γ感染細胞。6小時后移去培養基，換以無甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900Ⅱ培養基(生命科技有限公司，Gaithersburg)。42小時后加入5μCi35S一甲硫氨酸和5 Ci35S-半胱氨酸。進一步培養細胞16小時后離心收集細胞并通過SDS-PAGE和放射自顯影觀察標記蛋白。圖6示出了一凝膠，其中泳道1和3是TNF-γ和對照培養物的培養基，泳道2和4是TNF-γ和對照培養物的細胞裂解物。
實施例3．在COS細胞中表達重組的TNF-γ質粒TNF-γ-HA的表達衍生自一種載體pcDNA I/Amp(Invitrogen)，其含有1)SV40復制起點，2)氨芐青霉素抗性基因，3)E·coli復制起點，4)CMV啟動子，其后接一接頭區，一SV40內含子和一聚腺苷酸化位點。將編碼全部TNF-γ前體的DNA片段和融合于其框架3’末端的一血凝素抗原(HA)標簽克隆至載體的多接頭區。因此重組蛋白的表達在CMV啟動子控制下。HA標簽相當于衍生自流感血凝素蛋白的表位(I.Wilson,H.Niman,R.Heighten,A Cherenson,M.Connolly,and R.Lerner,1984,Cell 37,767)。HA標簽與靶蛋白的融合使得可以用識別HA表位的抗體簡便檢測重組蛋白。
質粒構建機理如下所述用兩個引物經PCR在克隆的原始EST上構建編碼TNF-γ(ATCC No.75927)的DNA序列。5’引物(SEQID NO:15)含有-BamHⅠ位點，后接24個起自初始密碼子的TNF-γ編碼序列的核苷酸；3’引物序列為5’-CGC TCT AGA TCAAGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG ATA GTA AGA AGG CTCCAA AG-3’(SEQ ID NO:17)，含有XbaⅠ位點，翻譯終止密碼子，HA標簽和TNF-γ編碼序列后18個核苷酸(不包括終止密碼子)。所以，PCR產物含有一個BamHⅠ位點，TNF-γ編碼序列，后接融合于框架的HA標簽，接著HA標簽的翻譯終止密碼子和一個XbaⅠ位點。PCR擴增的DNA片段和載體pcDNAⅠ/Amp用BamHⅠ和XbaⅠ限制酶消化并連在一起。用此連接混合物轉化E.coli菌株SURE(購自Stragagene Cloning Systems,11099 North Torrey DinesRoad,La Jolly,CA92037)。將轉化的培養物置入氨芐青霉素培養平板上并選擇抗性克隆。從轉化體中分離質粒DNA并通過限制分析檢測正確片段的存在。為表達重組TNF-γ,COS細胞用表達載體通過DEAE-DEXTRAN方法轉染(J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版，(1989))。TNF-γHA蛋白的表達通過放射標記及免疫沉淀法檢測(E.Harlow,D.Lane，抗體實驗手冊，冷泉港實驗室出版(1988))。在轉染2天后將細胞用[35S]-S-半胱氨酸標記8小時。然后收集培養基并用去垢劑裂解細胞(RIPA緩沖液(150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,1％NP-40,0.5％DOC,50mM Tris,pH7.5；Wilson,I.等，細胞37:767(1984))。用HA特異性單克隆抗體沉淀細胞裂解物和培養基。沉淀的蛋白然后用15％SDS-PAGE凝膠分析。
實施例4在人組織中TNF-γ的表達模式進行RNA印跡分析以檢測人體組織中TNF-γ的表達水平。用RNA zolTMB系統(Biotecx Laboratories,Inc.6023 South LoopEast,Housten,TX 77033)分離細胞總RNA樣本。大約2μg(為進行圖3A的RNA印跡)的分離自每個人組織的總RNA用1％瓊脂糖-甲醛凝膠分離，并印跡于尼龍濾膜上(Sambrook,Fritsch,andManiatis，分子克隆，冷泉港出版(1989))。根據Stratagene Prime-It試劑盒，用50ng TNF-γ cDNA進行標記反應以產生[32p]標記的TNF-γcDNA。標記的DNA用Select-G-50柱(5 Prime-3Prime,Inc.,5603 Arapahoe Road,Boulder,CO 80303)純化。濾膜然后與1,000,000 cpm/ml的放射標記的全長TNF-γ基因，在0.5MNa2PO4,pH7.4和7％SDS中在65℃雜交過夜。在室溫及60℃用0.5×SSC,0.1％SDS各洗2次后，用增感屏在-70℃曝光過夜。在腎組織中TNF-γ的信使RNA豐富。
除了使用分離自指示組織的10μg聚腺苷酸RNA之外，進行相同反應，獲得的結果如圖3B所示。在此試驗中，編碼TNF-γ的信使RNA優先在HUVEC細胞中表達(圖3B，泳道9)，但不在其它試驗的細胞系中表達；例如泳道1是CAMA1(乳腺癌)；2泳道是AN3CA(子宮癌)；3泳道是SK.UT1(子宮癌)；4泳道是MG63(成骨細胞瘤)；5泳道是HOS(成骨細胞瘤)；6泳道是MCF7(乳腺癌)；7泳道是OVCAR-3(卵巢癌)；8泳道是CAOV-3(卵巢癌)；10泳道是AOSMIC(平滑肌)；11泳道是包皮成纖維細胞。
還進行了Northern印跡分析以確定與HUVEC細胞培養物的增殖速率相關的TNF-γ RNA的相對表達水平。在這些試驗中，等量的分離自HUVEC細胞的總RNA(15μg)經電泳分離并如上所述印跡。從種植1,2,3,4,6和7天后的培養物中分離RNA。如圖4所示，TNF-γRNA(標記的“VEGI”)只在新種植的培養物(1,2和3天)中低水平可見。然而，TNF-γ RNA的表達在開始接近鋪滿的培養物(4,6和7天)是明顯的。這些試驗表明TNF-γ表達在開始接近無增殖或誘導的增殖靜止狀態的培養物或組織中增高。
實施例5重組TNF-γ抑制WEHI 164,ABAE和L929細胞生長及在HL-60中誘導細胞粘附的能力粘附靶細胞制備自在PBS中用胰蛋白酶消化的鋪滿培養物，非粘附靶細胞獲自固定培養物，并用培養基洗一次。靶細胞以3×105個細胞/ml懸浮于含10％FCS的培養基中。0.1ml等分分液于含有0.1ml用血清稀釋的試驗細胞樣本(WEHI 164和L929)的96孔平底微滴定平板中。持續培養70小時。TNF-a,TNF-b和細菌產生的TNF-γ以0.5μg/mi濃度加入。通過在每個孔中加入20μl MTS和吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液進行MTS分析，以確定胞毒性及增殖活性。在培養3小時后，用ELISA平板讀數鏡測定在492nm的光密度(OD)。OD492與孔中可見的細胞數成比例。胞毒性百分率如下計算胞毒性％=(100-OD試驗/OD對照)×100。72小時后照相，如圖7A和8所示，TNF-γ誘導-形態學變化，如黑色圓形細胞(代表殺死的細胞)。
在圖7B中，如上所述進行分析，然而加入培養物中的TNF-aTNF-b和TNF-γ的量增加。結果表明TNF-γ是內皮細胞系WEHI 164而非成纖維細胞系L929生長的劑量依賴型的抑制劑。(圖8和9)。
由SEQ ID NO:2所示完整TNF-γ氨基酸序列的12～147氨基酸組成的截短形式的TNF-γ多肽(稱為TNF-γ12--147)，也用于測試TNF-γ對內皮細胞生長的影響。用TNF-γ12--147處理成牛動脈內皮(ABAE)細胞，導致ABAE培養物中細胞生長接近完全抑制，但在乳腺癌細胞系MDA-MB-435或MDA-MB-231中細胞生長未受抑制(圖10，在此圖中TNF-γ稱為“VEGI”)。用10μg/ml TNF-γ39-174處理內皮細胞生長接近完全抑制，半值抑制濃度值(IC50)大約為1μg/ml(大約70nM)。
為測試TNF-γ的粘附能力，使用HL-60細胞，并在顯微鏡下觀測細胞粘附及細胞間接觸。圖11示出了TNF-γ誘導細胞粘附的能力。未用TNF-γ處理的培養物含有已鋪滿培養平皿的細胞。然而，用TNF-γ處理的培養物含有清晰地聚集在一起的細胞。
實施例6測定TNF-γ的編程性細胞死亡的能力在第一個培養步驟中，抗組蛋白抗體吸附固定在微滴定平板的壁上。隨后，此壁上的非特異性結合位點通過用培養緩沖液(如阻斷劑溶液)處理而飽和。在第二個培養步驟期間，包含于WEHI 164細胞樣本中的核小體通過其組蛋白組分與固定化的抗組蛋白抗體結合，WEHI 164細胞樣本是用TNF-a,TNF-b或細菌產生的TNF-γ處理的。在第三個培養步驟中，抗-DNA過氧化物物酶(POD)與核小體的DNA組分反應。經沖洗除去所有未結合的過氧化物酶之后，用底物ABTS(2,2’-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)經分光光度法確定免疫復合物中保留的過氧化物酶數量。抗組蛋白抗體與樣本中的組蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4反應。抗DNAPOD抗體與單及雙鏈DNA結合。因此，ELISA可檢測單-及寡核小體并可用于測定編程性細胞死亡。細胞死亡的水平通過細胞質組蛋白相關的DNA片段數量而測定，其以在405和490nm的吸光率表示(A405/A490)。這些試驗結果如圖12所示(見BohringerMannheim Catalogue,0990(9321541170)。
如圖12所示，增加量的TNF-γ誘導WEHI 164細胞較高水平地程序死亡，導致細胞死亡。此作用也可在增加量的對照TNF-b或對照TNF-a的任何分析水平觀測到。
實施例7．用TNF-γ進行受體結合分析TNF-a和細菌產生的TNF-γ用融合入重組蛋白質末端的6-組氨酸標簽，通過Ni-NTA親和層析而純化。1μg/孔的蛋白質加入鎳螯合包被的96孔平板(Xenopore Corp.)中并培養2小時。沖洗3次之后，將100ng人可溶TNF受體(具體地，sTNF RⅠ或sTNFRⅡ)加入每個孔中并培養2小時。此平板然后沖洗3次，并加入抗sTNF RⅠ或sTNF RⅡ的堿性磷酸酶標記的多克隆抗體，至總體積為200μl。等份底物溶液(200μl)然后加入每個孔中，再將平板培養2小時。用ELISA讀數鏡測定OD(測試波長450nm，校正波長590nm)。示于圖13的結果表明當與用TNF-a觀測到的對照結合相對比，TNF-γ未與STNF-受體令人滿意地結合。
實施例8通過基因治療的表達通過皮膚活檢從一組織取得成纖維細胞。將所得組織放入組織培養基中并分離成小片。將小塊組織放于一組織培養瓶的潮濕表面，約十片一瓶。顛倒瓶子，封嚴并于室溫過夜。室溫24小時后倒轉瓶子，組織塊仍固定在瓶底。此時，加入新鮮培養基(如補加10％FBS，青霉素及鏈霉素的Ham’s F12培養基)。此培養物然后在37℃培養近一周。這時加入新鮮培養基，隨后每2-3天更換一次。再培養此培養物2周后，出現單層成纖維細胞。用胰蛋白酶消化此單層細胞并于大搖瓶中大規模培養。
用Eco RⅠ和HindⅢ消化pMV-7(Kirschmeier,P.T.等，DNA 7:219-25(1988))，隨后用牛小腸磷酸酶處理，pMV-7兩端是Moloney鼠瘤病毒的長末端重復。此線性載體在瓊脂糖凝膠上分離并用玻珠純化。
編碼本發明多肽的cDNA用分別相當于5’和3’末端序列的PCR引物擴增。5’引物含有一個Eco RⅠ位點，3’引物含有一個HindⅢ位點。在T4連接酶存在下，加入等量的Moloney鼠瘤病毒線性骨架和擴增的Eco RⅠ和Hind Ⅲ片段。在適于兩片段連接的條件下培養所得混合物。此連接混合物用于轉化細菌HB101，然后將轉化物置于含卡那霉素的瓊脂上以確定載體有相應正確插入的基因。
用含10％小牛血清(CS)，青霉素和鏈霉素的Dulbecoo改良的Eagles培養基(DMEM)，組織培養兼嗜性pA317或GP tam 12包裝細胞使生長至匯合密度。然后將基因的MSV載體加入培養基中，包裝細胞將被該載體轉導。包裝細胞現在可產生含該基因的感染性病毒顆粒(該包裝細胞現被稱為生產細胞)。
向轉導的生產細胞中加入新鮮培養基，接著從匯合包裝細胞的10cm平板中收集培養基。將含感染性病毒顆粒的用過的培養基通過微孔過濾器過濾，以除去分裂的生產細胞并用該培養基感染成纖維細胞。從亞匯合狀態的成纖維細胞平板中移去培養基，并快速換成生產細胞的培養基。移去這種培養基并換成新鮮培養基。如果病毒滴度高，那么實際上成纖維細胞都會被感染無需選擇。如果滴度低，那么就有必要用有選擇標記的逆轉錄病毒載體例如neo或his。
再將工程化的成纖維細胞注入受體，或者單獨注入，或者在cytodex 3微載體玻珠上生長至匯合之后注入。成纖維細胞現在生產蛋白產物。
實施例9．體外血管生成分析此分析用于確定TNF-γ12-147抑制成牛動脈內皮(ABAE)細胞培養物中FGF-2誘導的類毛細管結構形成的能力。向含有1×DMEM的每個孔中加入0.5ml預冷的0.7mg/ml鼠尾Ⅰ型膠原(BectonDickinson Labwares,Bedford,MA)溶液，并用NaHCO3將pH調節為中性，從而制備3維膠原凝膠平板(24孔)。在形成膠原凝膠之后(大約1-2mm厚)，以5×104個細胞/孔將ABAE細胞種植。此培養物在5％CO2濕度，在37℃，在含有10％胎牛血清(HyClone,Logan,UT)及補加的L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM中培養，直至達到匯合。培養基然后用含有20ng/ml FGF-2的新鮮培養基置換。TNF-γ12-147作為FGF-2誘導的在ABAE培養物中形成類毛細管結構的抑制劑的效力，通過在培養基中補加0.1,0.3,1,3，或10μg/ml的TNF-γ12-147分析。所有培養物然后在37℃保持48小時，并通過冷凍甲醇(-20℃)固定而中止。
由ABAE細胞形成的類毛細管結構的豐度通過用裝備有一個Hamamatsu C2400圖象攝影機及一個Zeiss Axioshop顯微鏡的KotronIBAS Image分析儀加以分析。類毛細管結構的豐度以白色區占總測定區的百分比表示。作為對照。抗原因子FGF-2刺激體外血管生成的EC50值大約為5ng/ml。作為最終對照，在FGF-2為10ng/ml的，觀測到最大刺激效力。
如圖14所示(其中TNF-γ稱為“VEGI”)，通過加入1,3和10μg/ml的TNF-γ12-147(標記為VEGI)可觀測到ABAE培養物中FGF-2誘導的類毛細管結構形成被抑制。抑制FGF-2誘導的類管結構形成的IC50值大約為1μg/ml，其類似于在抑制內皮細胞生長時觀測的IC50值(見實施例5)。
實施例10雞絨毛尿囊膜(CAM)血管生成分析基本如Nguyen等(Microvasc.Res.47:31-40(1994))和Iruela-Arispe及Dvorak(Thromb.Haemost.78:672-677(1997))所述方法，進行CAM分析。此方法基于新毛細管生長入直接放在絨毛尿囊膜(CAM)上的膠原凝膠片中。抗原因子FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)包埋在膠原凝膠片中，并與CAM接觸。在放入凝膠片24小時后，用Nikon熒光顯微鏡對凝膠片中血管生成定量。用CCD Sony攝相機將此圖象移至Power PC 100AV。用NH Image 1.61軟件評估熒光密度。陽性對照(只含有抗原因子)的熒光密度被認為是最大抗原應答，并設為100。由于分析的可變性，抑制超過20％認為是令人滿意的。
為實驗性確定TNF-γ對FGF-2或VEGF誘導的血管生成的效力，細菌產生的TNF-γ(250ng)與FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)混合，并包埋于膠原凝膠片中。然后將此片如上述放置與CAM接觸。如圖15所示(其中TNF-γ稱為“VEGI”),TNF-γ明顯地抑制膠原凝膠中新毛細管生長。
實施例11體內致瘤性分析用異種移植模型進行TNF-γ對血管生成的潛在效力的體內分析。在此試驗中，1百萬個人乳腺癌細胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)注入雌性裸鼠的乳腺脂肪層中，此癌細胞或者單獨注入，或者與用TNF-γ轉染的CHO細胞混合注入，或者與只用CHO載體轉染的CHO細胞混合注入(每只鼠注入5×106個細胞)。這些試驗中表達的TNF-γ多肽由SEQ ID NO:2所示多肽除N端22個氨基酸之外組成。此TNF-γ突變蛋白的N端22個氨基酸用人白細胞介素-6的分泌型信號肽置換(Hirano,T.等，自然324:73-76(1986))。
將用人乳腺癌細胞和表達TNF-γ的CHO細胞或載體轉染的CHO細胞聯合注射的鼠隨機化并每周測二次腫瘤。用測徑器測垂直直徑，并以二維直徑測量值相乘計算腫瘤大小。數據示于圖16A和16B，是每組6只鼠的平均+/-標準偏差。
圖16A和16B(其中TNF-γ稱為“VEGI”)所示結果表明了異種移植腫瘤MDA-MB-231或MDA-MB-435在接種后的大小(mm2)。在接種后0天，5天至28天測腫瘤。其中，乳腺癌細胞與表達TNF-γ的CHO細胞聯合注射所致的腫瘤(在圖16A和16B中以實心圓表示)的大小令人滿意地較小，而那些乳腺癌細胞與只用CHO載體轉染的CHO細胞聯合注射所致腫瘤(在圖16A和16B中以空心圓表示)則較大。
實施例12．通過TNF-γ誘導NF-kB和c-Jun激酶(JNK)細胞性NF-kB通過磷酸化，遍在蛋白化及稱為IkBa的內源性NF-kB抑制劑分子最終降解而優先活化。抑制劑的降解使NF-kB的p65亞單位轉運至細胞核中，在那它能作為轉錄調節劑。為此，電泳遷移率變動分析(EMSA)是分析用TNF-γ處理培養的細胞激活細胞性NF-kB的適當方法。
在這些分析中，細胞(2×106/ml)用不同濃度的(0.1～1.0μg/ml)細菌產生的TNF-γ在37℃處理12小時。然后從培養的細胞中制備核提取物，并進行EMSA分析，如本領域所熟知的那樣及基本如Singh，S.和Aggarwal,B.B.生物化學雜志270:10631-10636(1995)所述。
用TNF-γ處理U-937細胞12小時，導致NF-kB的p65亞單位的DNA結合增加。p65的DNA結合峰活化在用1μg/ml TNF-γ處理U-937細胞12小時時觀測到。然而，用少如0.2μg/ml的TNF-γ處理U-937細胞12小時，導致在p65 DNA結合中產生可觀測到的增加。已觀測到TNF-γ在開始處理U-937細胞之后30分鐘～18小時，激活p65 DNA結合超過基本水平。
這些試驗經確定U-937細胞中IkBa對用TNF-γ處理的反應的降解分布圖詳細闡述。通過Western印跡分析確定IkBa降解時間過程，這一技術本領域技術人員已熟知，并已知Singh和Aggarwal所述(生物化學雜志270:24995-25000(1995))。當U-937細胞用0.1-1.0μg/ml的TNF-γ處理12小時時，IkBa完全降解。
稱為c-Jun激酶(JNK)的細胞激酶是細胞活化的早期事件。TNF-γ激活JNK用另一種確定用TNF-γ處理的細胞反應的方法分析。本領域技術人員熟知JNK激酶活化分析，并已由Derjard等闡述(細胞76:1025-1029(1994))。在用0.1-3.0μg/ml TNF-γ處理U-937細胞12小時后，收獲細胞并分析JNK激酶活性。在6和12小時，JNK活性分別提高2和3.6倍。
實施例13:TNF-γ治療大鼠中佐劑誘導的關節炎的效力使用大鼠佐劑誘導的關節炎(AIA)模型，分析TNF-γ治療類風濕性關節炎(RA)的應用。AIA是本領域技術人員熟知的類風濕性關節炎的特征熟知并可重復的動物模型(Pearson,Ann.Rheum.Dis.15:379(1956):Pearson&Wood.Arthritis Rheum.2:440(1959))。TNF-γ預期能抑制在這一動物模型RA中觀測到的為延長侵入骨和軟骨的血管翳所需的血管生成或內皮細胞增殖的增加。Lewis和BB大鼠(購自Charles River Lab,Raleigh,NC andUniversity of Massachusetts Medical Center,Worcester,MA)在這些試驗中用作一般的及應答佐劑誘導的關節炎的品系。
關節炎初始通過皮在尾根部內注射0.1ml佐劑(5mg/ml)而誘導。每組5～6只大鼠在注射佐劑20天后在關節內注入0.1～1.0mg/kg的TNF-γ或載體。此時，急性炎癥達到最大水平而慢性血管翳形成剛剛開始。TNF-γ對血管翳形成的影響，在用佐劑攻擊15天后，每周放射分析一次，基本如Taurog等所述(J.Exp.Med.162:962(1985))。簡而言之，將鼠用乙醚或水合氯醛麻醉并固定以便二后肢能一起用X光照射。用0-3評分系統遮光檢測X光片中的骨膜反應，骨侵蝕，關節腔狹窄及破壞。當用載體處理的大鼠中關節破壞明顯時，處死動物。此時，對大鼠腳爪進行組織學評估以檢測組織破壞程度及TNF-γ對這些關節的治療功效。
最后，對用TNF-γ和載體處理的動物每周進行二次臨床評估，以用plethysmometer系統評估后爪體積和評估體重。
實施例14:DR3配體(TNF-γ)是以兩種不同形式存在，且在不同組織和細胞中差異表達的新抗腫瘤細胞因子背景TNF(腫瘤壞死因子)超家族成員在細胞活化、增殖、分化、編程性細胞死亡、細胞毒性和免疫調節方面發揮非常重要的作用。TNF配體和受體超家族成員經常在各種人癌細胞和/或活化的淋巴細胞中過量表達，其胞外可及性使得它們成為特異抗腫瘤治療和免疫調節治療的優異的潛在靶。在過去的幾年中，屬于TNF受體和配體超家族的分子的名單迅速增加。細胞因子的TNF配體家族由13個Ⅱ型跨膜蛋白(除了TNF-b)組成，TNF受體超家族由18個Ⅰ型跨膜蛋白組成，除了分泌蛋白OPG，也稱為OCIF或TR1，以及GPI-連接的細胞表面分子TRID/DcR1/TRIAL-R3。
參與編程性細胞死亡的幾種TNF受體超家族成員以及一些胞間信號轉導分子含有一段氨基酸序列，約60-80個氨基酸長，稱為“死亡結構域”。這些含有死亡結構域的受體，如TNFR1,Fas/Apo-1/CD95,DR3(也稱為Ws1,Apo3,TRAMP或LARD),DR4,DR5或TRAIL-R2，在被其配體活化時，募集各種蛋白質，這些蛋白質通過死亡結構域介導細胞死亡。這些蛋白質隨后募集其他蛋白質，通過其死亡結構域或死亡效應子結構域轉導死亡信號。TNFR1在大多數組織和細胞類型中表達并參與轉導3種主要類型的信號轉錄因子NF-kB、c-jun N-末端蛋白激酶和細胞編程性死亡的活化。而Fas在淋巴細胞、肝、心臟、肺、腎和卵巢中表達。相反，DR3主要在脾、胸腺和外周血淋巴細胞中表達。DR3的配體尚未被鑒別。DR3與TRADD相互作用，與RIP稍弱結合，但當TRADD被過量表達時與RIP強結合。在存在TRADD時，其也與FADD強烈結合。這些結果提示DR3誘導的細胞編程性死亡的機制與Fas和TNFR1誘導的細胞編程性死亡的機制類似。與TNFR1一樣，DR3也激活NF-kB。
我們用檢索策略已鑒別了幾種新的TNF受體和配體超家族成員。一種新的TNF樣配體TNF-γ主要在內皮細胞中表達。雖然TNF-γ共享TNF的某些活性，但是它不結合TRNFR1和TNFR2，表明TNF-γ與一獨立的受體結合。我們在此顯示了TNF-γ與DR3在幾種受體-配體結合分析中結合。令人感興趣地，TNF-γ以兩種不同的形式存在，它們在不同細胞和組織中差異表達。結果和討論我們從含有來自超過620個cDNA文庫的超過150萬個EST的HGS數據庫中鑒別了幾個新TNF受體和配體超家族成員。一個新TNF樣配體主要在內皮細胞文庫中表達，顯示與TNF家族其它成員20-30％序列同源性，該蛋白被命名為TNF-γ-α(或稱VEGIa，即血管內皮衍生腫瘤生長抑制因子α)。隨后的數據庫分析和文庫篩選鑒別了TNF-γ-α的一種新剪接變體，稱為TNF-γ-β(或VEGIb)，這一異構形主要存在于TNFa和IL-1誘導的內皮細胞、單核細胞和活化T細胞的cDNA文庫中。TNF-γ-α的cDNA編碼174個氨基酸殘基，TNF-γ-β編碼251個氨基酸。兩種蛋白均具有Ⅱ型跨膜蛋白的特征，它們僅在相應于胞內和跨膜結構域的N-末端不同(圖18A-D和圖19)。
重組TNF-γ在幾種細胞系如牛肺動脈內皮細胞和成牛大動脈內皮細胞中誘導細胞編程性死亡〔牛肺動脈內皮細胞與各種濃度的TNF-γ保溫48小時，用Hoechst 33342熒光染料(10mg/ml)經核染色評價細胞編程性死亡〕。TNF-γ還體外誘導核因子kB(NF-kB)和c-JunN-末端激酶(JNK)活化，抑制血管發生〔用0.2mg報道質粒(NF-kB-SEAP)經脂轉胺試劑(根據廠商指導)轉染U937細胞，收集轉染的U937細胞并加至具有不同濃度TNF-γ的96孔板(200微升/孔)，37℃保溫72小時后，用光度計在450nm測量NF-kB活性〕。
為鑒別新的受體和配體對，建立幾種受體-配體結合分析。含有完整胞外域的重組可溶性TNF-γ與固定在BIAcore芯片上的DR3-Fc融合蛋白結合，純化的DR3-Fc也與固定有TNF-γ的BIAcore芯片結合〔純化的DR3-Fc或TNF-γ在用TNF-γ或DR3-Fc衍生化的BIAcore儀器流動池中分析，所示數據代表在TNF-γ與固定化DR3-Fc受體結合或DR3-Fc與固定化TNF-γ結合后作圖的凈結合(脫離率)區，其是經相對質量單位(RU)對時間而測定，結合條件在限制擴散條件下以高受體芯片密度進行〕。使用免疫沉淀技術，重組TNF-γ與DR3-Fc、但不與LTbR-Fc免疫粘附素共免疫沉淀〔如它處所述制備DR3的Fc胞外域或單獨的Fc以及相應配體，并進行結合分析。各個Fc融合蛋白用蛋白G-Sepharose沉淀，共沉淀的可溶性配體經與抗TNF-γ抗體免疫印跡檢測。如BM化學發光Westem印跡試劑盒方案所述進行印跡和檢測〕。
為進一步證實DR3和TNF-γ之間的相互作用，我們用抗重組可溶性TNF-γ的多克隆抗體篩選幾種細胞系中TNF-γ的細胞表面表達。與Northern印跡分析一致，通過抗TNF-γ的抗體的免疫染色發現外周血單核細胞(PBMC)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在細胞表面表達TNF-γ細胞經胰酶化作用或抽吸而收集，在1500-2000rpm離心5分鐘，細胞沉淀在5ml冰冷PBS中重懸及洗滌兩次。細胞與抗TNF-γ抗體(10mg/ml)在40℃保溫30分鐘以檢測TNF-γ在細胞表面的表達，細胞與DR3-Fc或LTbR-Fc(10mg/ml)在結合緩沖液(含10％BSA,20mM HEPES,pH7.2,0.02％NaN3的HBSS)中在40℃保溫30分鐘以檢測受體和配體結合。用純化的人IgG(25mg/ml)作為對照。然后洗滌細胞并用20mg/ml與山羊抗兔或抗人IgG綴合的藻紅蛋白(PE)染色。經FACscan流式細胞儀(BectonDickinson,Mountain View,CA)分析熒光。〕。用TNF-γ轉染的兩個腫瘤細胞系(MC-38/TNF-γ和MDA-231/TNF-γ)也在細胞表面表達TNF-γ。FACS分析顯示在MC-38/TNF-γ細胞與DR3-Fc接觸之后在大多數群體中有一移位，指示TNF-γ和DR3之間的細胞表面結合。類似地，在用TNF-γ轉染的MDA-231細胞中也觀察到移位。另外，DR3-Fc蛋白也與HUVEC細胞和PBMC結合。應注意的是在用PHA延長刺激后DR3表達和TNF-γ與PBMC的結合下降。如是預期的，DR3-Fc抑制以劑量依賴方式活化的TNF-γ誘導的NF-kB。〔用0.2mg報道質粒(NF-kB-SEAP)經脂轉胺試劑(根據廠商指導)轉染U937細胞，收集轉染的U937細胞并加至具有不同濃度DR3-Fc報道蛋白和100ng/ml TNF-γ的96孔板(200微升/孔)，37℃保溫72小時后，用光度計在450nm測量NF-kB活性。〕TNF-γ的染色體位置位于9q32泳道中，這一染色體位置鄰近CD30L(9q33)，但與TNFα、LTα和LTβ基因不同，后三個基因在染色體6上MHC復合物內緊密連鎖。令人感興趣的是，TNF-γ受體DR3位于染色體1的長臂，區域p36.2，位于已定位有CD30、TNFR2和OX40的一個區域。
與TNF-γ和DR3在細胞編程性死亡和免疫調節中的作用以及DR3和TNF-γ的相互作用一致的是，在同種MC-38鼠結腸癌模型中TNF-γ的局部產生導致體內腫瘤的完全抑制。在該相同動物模型中，可阻斷TNF-γ功能的可溶性DR3的局部產生促進腫瘤生長。〔將全長TNF-γ和DR3的胞外域分別克隆進pcDNA3表達載體中并轉染MCA38細胞。在選擇和克隆后，從每個構建體挑取三個克隆進行致瘤性研究。將表達TNF-γ或DR3胞外域的MCA 38細胞(1×106個細胞/小鼠)注射進C57BL6/6小鼠。用測徑器測量垂直徑并通過兩個方向的直徑測量值相乘而計算評估腫瘤大小。數據以每組中6個小鼠的平均值+/-SD代表。〕很清楚大多數免疫細胞和癌細胞可表達多于一種TNF受體(甚至多于一種死亡受體)和配體超家族成員。一個配體存在多個受體或一個受體存在多個配體以及存在受體或配體的多個剪接變體形式提示細胞編程性死亡和免疫功能的調節中的未預料到的復雜性。這些受體和配體似乎是功能冗余的，但是它們的表達模式不同，提示在特定功能中涉及不同的特異的組織或細胞。另外，這些配體和受體的表達可在組織內的具體細胞類型水平上不同，并且相同細胞類型的表達也可不同。
預計10％的基因可以可變剪接，但是在許多情況下是產生的蛋白質的功能不清楚。為檢查TNF-γ的兩個剪接變體的潛在功能顯著性，在超過100個cDNA文庫中進行PCR分析。這些結果如下表所示
DR3、TNF-γ-α和TNF-γ-β的差異表達模式文庫DR3 TNF-ga TNF-gb 文庫 DR3 TNF-ga TNF-gb正常組織 異常組織和細胞肝 + + 肝細胞腫瘤 +淋巴結 + + Hodgkin′s淋巴瘤 +扁桃腺 + 橫紋肌肉瘤+骨髓+ 鼻息肉脾 + 脾轉移黑素瘤心臟+ 脾慢性淋巴細胞胸腺+ + 白血病心包膜 + 傷口愈合(皮膚) ++腦 + B細胞淋巴瘤肺 + 血管外皮瘤骨骼肌 胰腺腫瘤 +胎盤 + 燒傷皮膚 +前列腺 + 前列腺癌，C期垂體 U937細胞 +睪丸+ + 卵巢腫瘤 +結腸 結腸癌，轉移至 ++胰腺+ 肝腎 + 結腸癌腎皮質 + Crohn′s病pualmonary 排斥的腎 ++脂肪+ + T細胞淋巴瘤 +卵巢+ + 卵巢腫瘤小腦 子宮內膜腫瘤海馬 皮膚腫瘤hyperthalamus 胰腺癌 +嗅覺上皮 + + Jurkat細胞+striatum + Hela細胞 ++depression LNCAP+0.3nM +松果腺 雄激素LNCAP+30nM雄 ++激素胎兒組織 正常細胞8周胚胎+ + HUVEC9周胚胎+ 真皮內皮胎腦 + + + 靜息T細胞胎腎 + + 活化T細胞(12hr)胎心 + + + 活化T細胞(16hr)胎胸腺 + 活化T細胞(24hr)胎肺 + + T細胞輔助細胞Ⅰ胎肝 + T細胞輔助細胞Ⅱ胎脾 + CD34+原代樹狀細胞嗜伊紅性粒細胞單核細胞成骨細胞角質形成細胞子宮內膜基質細胞基質細胞TF274如表所示，DR3和兩種形式的TNF-γ在不同的組織和細胞中差異表達。在所測試的文庫中，發現DR3在大多數組織、活化的T細胞、單核細胞、樹狀細胞、TH2細胞和幾種其它細胞系(如U937，HeLa)以及腫瘤組織(如肝細胞腫瘤和Hodgkin′s淋巴瘤)中表達。在用30nM合成雄激素處理的LNCAP前列腺癌細胞系中的DR3表達增加。TNF-γ-α僅在少數組織或細胞中表達，如胎腦、胎心、脂肪、腎皮質、嗅覺上皮、胰腺癌和HUVEC。相反，TNF-γ-β具有較寬的表達譜，在細胞水平只有內皮細胞、活化T細胞、單核細胞、角質形成細胞、HeLa和Jurkat細胞表達TNF-γ-β。僅有HUVEC、胎腦和胎心cDNA文庫表達兩種形式的TNF-γ和DR3。TNF-γ-α、TNF-γ-β和DR3在靜息T細胞或早期活化T細胞(12hr)中不表達。在用PHA刺激后16小時可檢測出DR3，用PHA刺激后24小時可檢測出DR3和TNF-γ-β。在活化T細胞中DR3和隨后TNF-γ-β的時間依賴性誘導提示DR3和TNF-γ-β可能在活化誘導的細胞編程性死亡中起重要作用。
Northern和eDNA數據庫分析表明DR3表達主要在具有高含量淋巴細胞的組織中發現，TNF-γ主要在內皮細胞、單核細胞和活化T細胞中表達。因此，DR3和TNF-γ可能在活化誘導的細胞編程性死亡和淋巴細胞的陰性選擇中起作用。不同細胞和組織具有不同的DR3、TNF-γ-α和TNF-γ-β表達譜。不同剪接變體形式的DR3或TNF-γ的表達可在DR3介導的細胞編程性死亡的易感性和抗性之間設定平衡。很清楚的是導致細胞編程性死亡的途徑是高度調節過程并涉及一系列蛋白質。
最近描述了命名為Apo3L的另一種DR3的配體，其也是由Tweak公開的。與TNF-γ不同的是Apo-3L/Tweak在許多種組織中表達。這兩種DR3配體間的相互關系和功能重要性有待于研究。結論已經鑒定了TNF超家族的一對新的受體和配體，即DR3和TNF-γ。與TNF家族其它配體不同的是TNF-γ以兩種不同形式存在且在不同細胞和組織中差異表達。已提示調節DR3功能的一種機制是通過DR3的可變剪接。前mRNA的可變剪接產生至少11個DR3異構體，提供了可能有助于形成免疫應答的一系列功能結果。我們的數據提示DR3功能也可通過其配體TNF-γ的可變剪接和差異表達而調節。這些發現對于我們如何看待細胞編程性死亡和TNF受體超家族功能的調節有很大的影響。鑒別出兩種差異表達的DR3配體變體提高了選擇性調節細胞編程性死亡、免疫應答和腫瘤的免疫監視的可能性。兩種差異表達的TNF-γ的生理學和病理學功能的進一步鑒定可提供TNF受體和配體超家族的生物學活性、生理學功能和治療性應用的新見識。了解這些基因的作用和機制應能使我們開發在各種生理學和病理學條件下調節細胞編程性死亡和細胞增殖的途徑。材料和方法細胞編程性死亡分析牛肺動脈內皮細胞(BPAEC)與各種濃度的TNF-γ保溫48小時。經形態學和經用Hoechst 33342熒光染料(10mg/ml)核染色評價細胞編程性死亡，實驗進行3份重復。在4個隨機視野中記錄活細胞和編程性死亡細胞，計數約1000個細胞。如前所述進行DNA片段化分析。BIAcore受體-配體結合分析如前述論文所述產生重組受體DR3-Fc融合蛋白和重組TNF-γ。將純化的TNF-γ或DR3-Fc分別固定在BIAcore上。在用TNF-γ或DR3-Fc衍生化的BIAcore儀器流動池上分析純化的DR3-Fc或TNF-γ。在TNF-γ與固定化的DR3-Fc受體結合后或在DR3-Fc與固定化的TNF-γ結合后，測量相對質量單位(RU)對時間圖的凈結合(脫離率)區域。結合條件是在限制擴散條件下以高受體芯片密度進行。共免疫沉淀和Western印跡分析如前所述(Ni,J.等，生物化學雜志272:10853-10858(1997))在兔中制備抗TNF-γ的多克隆抗血清。如它處所述制備DR3的Fc胞外域或單獨Fc及相應配體并進行結合分析。相應的Fc融合體與蛋白G-Sepharose沉淀，用抗TNF-γ抗體的免疫印跡檢測共沉淀的可溶性配體。樣品上樣于凝膠(NOVEX預澆鑄凝膠)(4-20％Tris-甘氨酸凝膠)。根據BM化學發光Western印跡試劑盒方案所述進行印跡和檢測。FACS分析經胰酶化或抽吸收集細胞并在1500-2000rpm離心5分鐘。重懸細胞沉淀并在5ml冰冷PBS中洗2次。細胞在40℃與抗TNF-γ抗體(10mg/ml)保溫30分鐘以檢測在細胞表面TNF-γ的表達，與DR3-Fc或LTbR-Fc(10mg/ml)在結合緩沖液(含10％BSA、20mM HEPES,pH7.2和0.02％NaN3的HBSS)保溫以檢測受體和配體結合。純化的人IgG(25mg/ml)用作對照。然后洗滌細胞并用20mg/ml與山羊抗兔或抗人IgG綴合的藻紅蛋白(PE)染色。經FACscan流式細胞計數儀(Becton Dickinson,Mountain View CA)分析熒光。NF-kB-SEAP(分泌型堿性磷酸酶)報道基因分析經脂轉胺試劑(根據廠商指導)用0.2mg報道質粒(NF-kB-SEAP)轉染U937細胞，收集轉染的U937細胞并與各種濃度的活性TNF-γ或失活(煮沸)TNF-γ一起或與各種濃度DR3-Fc受體和100ng/ml的TNF-γ聯合加入96孔板(200ml/孔)。在37℃保溫72小時后，用光度計在450nm測量NF-kB活性。用大量cDNA文庫和cDNA數據庫的PCR分析組織和細胞分布為研究DR3、TNF-γ-α和TNF-γ-β的組織分布，對于每個基因合成兩個基因特異性引物。測試了超過100個cDNA文庫，給出陽性預計大小信號的文庫記為+。體內致瘤性分析將全長TNF-γ和DR3的胞外域分別克隆進pcDNA3表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中并轉染MCA38細胞。轉染、G418選擇和克隆后，每個構建體選擇3個克隆進行致瘤性研究。TNF-γ和DR3在MCA38細胞中的表達經Northern分析證實。將表達TNF-γ或DR3胞外域的MCA38細胞(1×106個細胞/小鼠)注射進C57BL6/6小鼠中，隨后隨機化小鼠并每周測量腫瘤兩次。用測徑器測量垂直直徑估算腫瘤大小并通過將兩個方向的直徑測量值相乘計算腫瘤大小。數據以每組中6個小鼠的平均值±SD表示。實施例15:TNF細胞因子家族的一個新成員TNF-γ-α導致內皮細胞編程性死亡背景TNF-γ-α是最近檢索人體基因組科學有限公司(HGS)cDNA數據庫而鑒別的分子量為22kD的新蛋白(Tan，K.B.等，基因204:35-46(1997))。TNF-γ-α是Ⅱ型膜蛋白并與人腫瘤壞死因子a(TNFa)具有30％序列同源性。TNF家族這一新鑒定的成員已證明在內皮細胞和腎、肺和前列腺中豐富表達。在HL-60和THP1細胞中TNF-γ-α的表達經PMA處理誘導。放射雜種作圖將TNF-γ基因定位于染色體9q32上，位于CD30L附近。由于其在內皮細胞中過量表達，已提示TNF-γ-α可能在血管功能中起作用(Tan,K.B.等，基因204:35-46(1997))。本研究目的在于探索TNF-γ-α是否誘導內皮細胞編程性死亡，內皮細胞編程性死亡這一現象已提示是導致各種炎癥和心血管功能異常的內皮細胞損傷的一個原因(Bryant,D.等，循環97:1375-1381(1998))。為檢查這一可能性，我們使用牛肺動脈內皮細胞(BPAEC)，該細胞TNFa誘導的編程性死亡已被證實(Polunovsky,V.A.等，實驗細胞研究214:584-594(1994))。在形態學(包括超級結構)和生化鑒定(DNA斷裂)基礎上檢測細胞編程性死亡。另外，我們研究了TNF-γ-α對應力激酶、應力活化蛋白質激酶(SAPK/JNK)和p38促有絲分裂原活化的蛋白質激酶(p38 MAPK)以及caspase的活性的作用。兩種信號途徑據信參與細胞編程性死亡(Xia,Z.等，科學270:1326-1331(1995))。也確定了TNF-γ-α刺激的BPAEC中Fas和Bcl-2的表達，以研究Fas的死亡促進效應和Bcl-2的抗細胞編程性死亡效應(Nagata,S.和Golstein,P.，科學267:1449-1456(1995))。材料和方法材料TNF-γ-α蛋白(22kD)由HGS提供，Ac-YVAD-AMC和Ac-DEVD-AMC購自美國肽公司(Sunnyvale,CA,USA),ZVAD-fmk和Ac-YVAD-CHO分別得自酶系統公司(Dublin,CA,USA)和肽國際公司(Louisville,KY,USA),Ac-DQMD-AMC,Ac-LEED-AMC,Ac-VETD-AMC和抗p38 MAPK mAb由SmithKline Beecham(SB)制藥公司(King of Prussia,PA,USA)提供，Ac-IETD-AMC和小鼠抗人JNKmAb分別購自Biomol研究實驗室(Plymouth Meeting,PA,USA)和PharMingen(San Diego,CA,USA)，小鼠可溶性TNF受體1(sTNFR1)和TNF受體2(sTNFR2)得自R&D系統公司(Minneapolis,MN,USA)。細胞培養物BPAEC得自美國典型培養物保藏中心(Rockville,MD,USA)。細胞在補加10％熱滅活FCS的DMEM中如前所述在5％CO2/85％空氣的加濕環境中于37℃培養(Yue,T.L.等，分子藥物學51:951-962(1997))。使用亞鋪滿密度的細胞。在實驗前，將培養基更換為含2％FCS的DMEM。17-20代的BPAEC用于所有研究。細胞編程性死亡的形態學評價和定量為定量經歷細胞編程性死亡的細胞，如前所述(Yue,T.L.等，分子藥物學51:951-962(1997))固定細胞單層并用Hoechst 33324染色(分子探針，Eugene,OR,USA)。細胞編程性死亡的形態學特征(細胞收縮、染色質凝聚、起泡(blebbing)和斷裂)經熒光顯微鏡術監控。如前述報道(Yue,T.L.等，分子藥物學51:951-962(1997))進行透射電子顯微鏡術。DNA斷裂分析(a)DNA梯用載體或TNF-γ-α處理的細胞在含有100mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH8.0,2.5mM EEDTA,0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液中裂解，裂解物在55℃保溫16h。保溫后，如前所述用苯酚/氯仿/異戊醇溫和抽提3次，用無DNA酶的RNA酶處理，再次抽提并再次沉淀。在含溴化乙啶的1.8％瓊脂糖凝膠中進行DNA電泳，在紫外光下觀察DNA斷裂。
(b)原位末端標記(TUNEL):BPAEC在兩室玻片(Nunc)上培養并用TNF-γ-α處理8-24h。用ApopTag原位細胞編程性死亡檢測試劑盒(Oncor)根據廠商推薦用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記進行編程性死亡細胞的原位檢測。應力活化的蛋白激酶(SAJPK/JNK)分析用如前所述(Yue，T.L.等，分子藥物學51:951-962(1997))與谷胱甘肽-Sepharose 4B結合的GST-c-Jun(1-81)測量SAPK活性。簡單地說，用載體或TNF-γ-α處理細胞，洗滌并在裂解緩沖液中裂解。校正無核上清液的蛋白質含量并用抗SAPK抗體綴合的Sepharose珠免疫沉淀。混合物在4℃振蕩3h。將含GST-c-Jun(1-81),10μC[g-32P]-ATP,125μM ATP和100mM MgCl2的磷酸化緩沖液加入在分析緩沖液中的SAPK結合的珠中。在30℃保溫20分鐘后通過加入蛋白質上樣緩沖液并在90℃加熱3分鐘終止反應。磷酸化蛋白質在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳隨后放射自顯影而分辨。泳道密度通過PhosphorImager定量(Yue,T.L.等，J.Mol.Cell.Cardiol.30:495-507(1998))。p38 MAPK分析如上所述制備的細胞裂解物與和蛋白A瓊脂糖結合的抗p38MAKP抗體在4℃免疫沉淀4h。如前所述用裂解緩沖液洗珠，隨后用激酶緩沖液洗珠(Kumar,S.M.等，生物化學雜志271:30864-30869(1996))。通過加入含2微克GST-ATF2和50μM[γ-32P]ATP(20Ci/mmol)的25微升激酶緩沖液起始免疫復合物激酶分析。磷酸化產物經SDS-PAGE分辨并用Phosphorimage觀察。c-JUN的顯性干擾突變體在BPAEC中的體外轉染細胞在兩室玻片中鋪板。用Calphos Maximizer轉染試劑盒(Clontech)根據廠商推薦，用作為轉染細胞的熒光標記的0.5μg/mlPegfp-c-1(Clontech；Li,Y.和Horwitz,M.S.，生物工程23:1026-1028)與1μg/ml空克隆載體pCDNA1(對照)或顯性干擾c-Jun突變體pcDNA1-FigΔ169(Xia,Z.等，科學270:1326-1331(1995))一起共轉染細胞。轉染后，使細胞在完全培養基中復蘇24h。細胞用TNF-γ-α處理，在根據方法部分固定細胞后經核染色估計編程性死亡細胞數。Caspase活性分析用TNF-γ-α的載體處理細胞，如前述報道進行Caspase活性分析(Yuc,T.L.等，文獻同上)。簡單地說，收獲細胞并在含25mM HEPES,pH7.5,10％蔗糖，0.1％CHAPS,2mM DDT.5mM PMSF和1μM抑胃酶肽A的緩沖液中重懸。使懸浮液通過25規格針10次以破壞細胞。勻漿液在100000xg離心1h，將澄清的裂解液用于酶分析。細胞抽提物(5-20μg蛋白質)在分析緩沖液中稀釋(表2)并在加入底物之前在30℃預保溫10分鐘。用Cytofluor-4000熒光讀板器(Perseptive Biosystems)在激發和發射波長分別為360nm和460nm時測量釋放的7-氨基-4-methylcocmarin(AMC)水平。Fas,Bcl-2和Caspase-3表達的免疫組織化學分析細胞在兩室玻片上培養，在用載體或TNF-γ-α處理后，用4％低聚甲醛在4℃固定細胞30分鐘，然后更換成冷PBS。細胞用0.2％Triton X-100在4℃處理40分鐘，用冷PBS洗滌，然后用正常山羊血清(Vector Laboratories)在室溫封閉非特異性免疫球蛋白結合位點1小時。細胞樣品與一級抗體鼠抗人Fas(UpstateBiotechnology)，鼠抗人Bcl-2(DAKO)或兔抗人CPP32p17肽多克隆抗血清(SmithKline Beecham)在室溫保溫1小時。作為陰性對照，細胞樣品與非免疫IgG(對Bcl-2和CPP32)或IgM(對Fas)而非一級抗體保溫。在與一級抗體保溫后，用PBS洗細胞，然后與和熒光素異硫氰酸酯綴合的二級抗體保溫30分鐘。洗細胞，用Weetashield覆蓋培養基處理(Vector Laboratories)并經熒光顯微鏡術(OlympusIX70)觀察。統計學分析所有數值以n個獨立實驗的平均值±S.E.M.表示。用單通道差異分析進行統計學評價。p＜0.05的數值差異被認為是顯著的。結果TNF-γ-α在BPAEC中誘導細胞編程性死亡當BPAEC接觸TNF-γ-α時，細胞縮小并與其相鄰細胞隔離，細胞質變得致密。用Hoechst 33324染色的并經熒光顯微鏡術評價的細胞證實了斷裂核的致密染色質以及質膜的起泡。用透射電子顯微鏡術的研究表明TNF-γ-α處理的BPAEC含有許多經歷細胞編程性死亡特征性形態學改變的細胞，這些改變包括染色質凝聚和出現細胞編程性死亡小體。當細胞與TNF-γ-α(30-300ng/ml)接觸24小時時觀察到DNA特征性降解為寡核小體長度的片段。用TUNEL方法進一步原位觀察DNA片段。相當一部分用TNF-γ-α處理的內皮細胞顯示陽性染色，在用載體處理的培養物中未觀察到陽性染色的細胞。
TNF-γ-α誘導的內皮細胞編程性死亡是時間和濃度依賴性過程，其EC30值為72ng/ml。在細胞與TNF-γ-α接觸6-8小時后觀察到具有編程性死亡形態學改變的細胞數顯著增加。在相似條件下，10ng/mlTNFa在PEAPC中誘導的細胞編程性死亡為16.7±3.2％(n=4)。sTNFR1和sTNFR2對BPAEC中TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡的影響sTNFR1和sTNFR2均不顯示對BPAEC中TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡有影響。在相同條件下，TNFa誘導的BPAHC編程性死亡被sTNFR1明顯降低。TNF-γ-α對內皮細胞中Fas和Bcl-2表達的調節在用TNF-γ-α處理8和24h后測定Fas和Bcl-2蛋白的免疫細胞化學分析。Fas在BPAEC中的基礎水平為不可檢測到，但是在刺激后8和24h檢測到許多表達Fas受體的細胞。當用小時IgM取代一級抗體時，未檢測到陽性Fas免疫反應性。相反，在未刺激的或TNF-γ-α處理的BPAEC中均未檢測到Bcl-2表達。SAPK/JNK和p-38 MAPK的活化關于TNF-γ-α對BPAEC中SAPK/JNK活性的作用，內皮細胞與TNF-γ-α接觸誘導SAPK/JNK的快速活化。在刺激后20分鐘檢測到SAPK/JNK活性的明顯增加，在40分鐘時達到峰值，然后在60分鐘后回到接觸水平。內皮細胞中TNF-γ-α誘導的SAPK/JNK的活化是一濃度依賴性過程。SAPK/JNK活性的一些基礎活性在存在50和300ng/ml TNF-γ-α時相對于基礎水平分別增加5.6±1.4倍(p＜0.05 n=4)和9.1±1.8倍(p＜0.01 n=6)。TNF-γ-α以類似于SAPK/JNK但程度稍低的時間過程活化BPAEC中p38 MAPK。在存在100和300ng/ml TNF-γ-α時，p38 MAKP活性峰值相對于基礎水平分別增加3.1±0.5倍和3.8±0.4倍。c-JUN的顯性干擾突變體在BPAEC中的表達或p38 MAPK抑制劑SB203580對TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡的作用為研究SAPK/JNK在TNF-γ-α誘導的BPAEC細胞編程性死亡中的作用，我們用c-JUN顯性干擾突變體pCDNA1-FlagΔ169轉染BPAEC，該突變體中包括JNK結合位點的NH2-末端反式活化結構域被缺失(Xia,Z.等，文獻同上)。顯性干擾c-JUN構建體在BPAEC中的表達使TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡降低62.8％(p＜0.05)。BPAEC中TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡也被p38 MAPK抑制劑SB203580以濃度依賴方式弱化。在存在3和10μM SB203580時，TNF-γ-α誘導的BPAEC細胞編程性死亡分別降低33％(p＜0.05)和51％(p＜0.01)。當SB203580濃度增加時未觀察到進一步的抑制。TNF-γ-α對BPAEC中Caspase的活化TNF-γ-α誘導的BPAEC細胞編程性死亡被在TNF-γ-α處理前1h加入到培養基中的caspase的不可逆細胞通透性抑制劑ZVAD-fmk(Jocobson,N.L.等，細胞生物學133:1041-1051(1996))弱化。在相同條件下，加入caspase-1的相對特異性抑制劑Ac-YYAD-CHO(Thorberry,NA.等，自然(倫敦)356:768-774(1992))直至100μM仍未顯示增強BPAEC拯救的作用。為進一步確定caspase家族哪些成員在內皮細胞的TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡過程中活化，我們檢查了細胞抽提物的蛋白裂解活性。用一系列確定的肽序列變體在如前所述優化條件下測量AMC形成的相對速率(Yue,T.L.等，文獻同上)，所述的變體相對特異于caspase1,3,4,7或8。3次重復實驗均觀察到類似結果。來自TNF-γ-α處理的BPAEC的細胞抽提物對Ac-DEVD-AMC是高度活性的，對Ac-DQMD-AMC活性程度稍低，但對更特異于caspase1,4和8的其余三個底物沒有活性。蛋白酶解活性在細胞用TNF-γ-α處理6h后出現，在24h達到峰值，并在48h內逐漸返回至基礎水平。TNF-γ-α處理的細胞抽提物和重組caspase-3對四種底物水解速率的相對速率進行了比較，四種底物中兩種酶來源的相對速率非常相似。
為進一步證實caspase-3在BPAEC中被TNF-γ-α活化，進行其酶學活性形式17kD亞基的免疫細胞化學檢測。產生抗來自p17亞基的C-末端部分的肽的抗體，如果在“p-10”和“p-20”亞基之間已有特異性裂解，該新表位抗體僅結合caspase-3。使用這一新表位抗體，僅檢測到加工的caspase-3，未檢測到酶原(Yuc,T.L.等，文獻同上)。caspase-3的17kD亞基在TNF-γ-α處理的BPAEC中檢測到，但在載體處理的BPAEC中未檢測到，其與斷裂的核定位于細胞中。討論本論文的研究證實了一種新的TNF樣細胞因子和Ⅱ型跨膜蛋白TNF-γ-α在培養的內皮細胞中誘導強烈的細胞編程性死亡，形態學和生化標準反映了這一點。在我們的實驗條件下，根據先前的觀察自發性BPAEC死亡約為2-4％(Polunovsky,V.A.等，文獻同上)。TNF-γ-α的作用是濃度依賴性的，其EC80值為72ng/ml(3.5nM)，在處理后6-8小時檢測到明顯數量的編程性死亡的細胞。另外，原細胞編程性死亡基因Fas的表達在TNF-γ-α處理的BPAEC中證實，這與先前報道的在編程性死亡內皮細胞中觀察的結果一致(Yuc,T.L.等，文獻同上)。
介導TNF-γ-α活性的受體尚未被鑒別。為檢查TNF-γ-α是否通過獨立的受體起作用，我們測試了sTNFR1和sTNFR2對BPAEC中TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡的影響。這兩個TNFR先前已顯示阻斷細胞表面TNFR1和TNFK2介導的對應答細胞系的TNF生物活性(來自R&D系統的數據)。sTNFR1或sTNFR2均不抑制TNF-γ-α對BPAEC的作用。相反，TNFa誘導的BPAEC細胞編程性死亡顯著地被sTNF1降低。結果清楚地提示TNF-γ-α誘導的細胞死亡不依賴于sTNFR1或TNFR2。
最近對TNF家族成員的研究已證實TNFa和Fas在各種細胞類型中激活應力蛋白激酶SAPK/JNK和p38 MAPK(Sluss，H.K.等，細胞生物學14:8376-8384(1994))，但是，這一家族其它成員對SAPK和p38 MAPK的作用未仔細研究。另外，已有SAPK/JNK和p38 MAPK在TNFa或Fas介導的細胞死亡中的作用的不一致報道。例如，TNFa誘導的細胞編程性死亡在U937細胞中依賴于JNK活性(Verjeji,M.等，自然(倫敦)380:75-79(1995)；Zanke,B.W.等，當前生物學6:606-613(1996))，但在成纖維細胞中不是如此(Reinhard,C.等，EMBO J.16:1080-1092(1997))，表明JNK活化的結果在細胞類型之間變化相當大。Fas介導的JNK活化以與TNFa不同的動力學發生，提示TNFa和Fas很可能通過不同的機制激活JNK(Wilson,D.J.等，歐洲免疫學雜志26:989-994(1996))。另外，Juo等最近報道了用特異的p38 MAPK抑制劑阻斷p38 MAPK不影響Jurkat細胞中Fas介導的細胞編程性死亡(Juo,P.等，分子細胞生物學17:24-35(1997))。因此，我們感興趣的是發現是否TNF-γ-α激活JNK和p38 MAPK，以及這一活化在BPAEC中的TNF-γ-α介導的細胞編程性死亡中的作用是什么。本研究清楚證明JNK和p38 MAPK均被TNF-γ-α以相似方式迅速激活，如在TNFa激活的U937中所觀察到的一致。另外，c-JUN的顯性干擾突變體在BPAEC中的表達降低了TNF-γ-α誘導的細胞死亡，表明在BPAEC中TNF-γ-α的細胞編程性死亡依賴于JNK活性。為表明p38 MAPK在BPAEC中的TNF-γ-α介導的細胞編程性死亡中的可能的作用，測試了特異性p38 MAPK抑制劑SB203580。這一抑制劑已顯示能在體外特異抑制p38 MAPK活性，對所測試的各種激酶包括JNK和ERK-1均無作用(Cuenda,A.等，FEBS通信364:229-233(1995))。BPAEC中TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡也被SB203580以濃度依賴方式降低，提示p38 MAPK信號途徑參與TNF-γ-α介導的BPAEC細胞編程性死亡。這一作用與在Jurkat細胞中Fas介導的細胞編程性死亡中觀察到的不同，在Jurkat細胞中SB203580沒有保護性作用(Juo,P.等，文獻同上)。另外，TNF-γ-α誘導的p38 MAPK活化在BPAEC中的動力學比Jurkat細胞中觀察到的更快，其中p38 MAPK活化的峰值在Fas刺激后2-4h，表明TNF-γ-α和Fas很可能通過不同的機制以不同的結果活化p38MAPK。我們的數據進一步提示TNF家族不同成員可具有不同的信號途徑介導細胞死亡或在不同細胞類型中具有不同作用。
最近的研究支持caspase家族成員作為細胞編程性死亡效應子的中心作用(Kumar,S.M.等，文獻同上)，但是caspase在內皮細胞編程性死亡中的作用尚未充分探索。caspase家族的兩個特征已被驗證，它們在特異性天冬氨酸之后裂解其靶蛋白，產生兩個亞基，這兩個亞基一起形成酶的活性位點(Nicholson,D.W.等，自然(倫敦)376:37-43(1995)；Kumar,S.M.等，文獻同上)。在caspase家族中，caspase-3(CPP32)已被認為是在細胞編程性死亡過程中蛋白酶解級聯的一個中心組分，并在這一家族中起關鍵作用(Wang,X.,EMBOJ.15:1012-1020(1996)；Woo,M.，等，基因發育12:806-819(1998))。TNF-γ-α誘導的BPAEC細胞編程性死亡被ZVAD-fmk抑制，提示caspase家族在細胞編程性死亡這一效應子途徑中的潛在作用。為確定涉及哪些caspase家族成員，我們通過測量相對特異于caspase1,3,4,7和8(Talanian,R.V.等，生物化學雜志272:9677-9682(1997))的六個不同底物的AMC形成相對速率，檢查了來自TNF-γ-α活化的BPAEC的抽提物中蛋白酶解活性的底物特異性。用TNF-γ-α處理BPAEC導致主要針對DEVD-AMC和一定程度針對DQMD-AMC的蛋白酶解活性的增加，兩者均顯示針對caspase-3的相對特異性(Kumar,S.M.等，文獻同上)。當Ac-YVAD-AMC,LEED-AMC或VETD-AMC用作底物時，TNF-γ-α活化的細胞抽提物中蛋白酶解活性沒有被誘導，提示可能不涉及caspase1,4和8。另外，對比來自TNF-γ-α處理的BPAEC抽提物與重組caspase-3的底物特異性顯示類似的模式，進一步提示caspase-3可能是被TNF-γ-α活化的caspase家族的主要成員。另外，免疫細胞化學研究檢測了TNF-γ-α處理的BPAEC中caspase-3的活化形式。據報道在HL-60細胞中鬼臼亞乙苷誘導的細胞編程性死亡的細胞質和核中均發現多個caspase同系物(Martins,I.M.等，生物化學雜志272:7421-7430(1997))。令人感興趣地，在TNF-γ-α誘導的編程性死亡的BPAEC中，caspase-3的免疫反應性17kD亞基僅與斷裂的核定位，進一步表明caspase-3在TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡中的作用。以下事實有待于進一步研究，即這一活性caspase-3是被轉運到核中，或者無活性caspase-3已存在于核中等待由TNF-γ-α促進的活化。總之，這些結果提示caspase-3被TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡所活化。但是，我們的結果不能排除這一家族的其他成員，特別是與caspase-3緊密相關的成員如caspase-7介導TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡。另外，ZVAD-fmk在稍后的時間(30小時)抑制BPAEC中TNF-γ-α誘導的細胞編程性死亡比稍早的時間(14小時)的抑制效率低，提示在TNF-γ-α誘導的BPAEC細胞編程性死亡的晚期可能存在不依賴于陰性反饋機制的caspase。
總之，本研究已證明TNF細胞因子家族的一個新成員TNF-γ-α導致內皮細胞編程性死亡。TNF-γ-α看起來通過與TNF受體1或2不同的受體起作用。TNF-γ-α的作用是通過應力蛋白激酶SAPK/JNK和p38 MAPK的活化以及caspase、主要是caspase-3樣蛋白酶的活化。已提示細胞編程性死亡是導致各種炎癥和心血管損傷的內皮細胞損害的原因(Karsan,A.心血管醫學趨勢8:19-24(1998))。另外，內皮細胞編程性死亡可能是參與抗血管發生和促血管發生過程之間的平衡的一重要機制，喪失這一平衡將導致各種疾病如實體腫瘤轉移和視網膜病(Folkman,J.and Shing,J.，生物化學雜志267:10931-10934(1992)；Brooks,P.C.等，細胞79:1157-1164(1994))。
根據以上教導本發明可有各種修改和變化，因此在所附權利要求書范圍內，本發明可以不同于所描述的方式實施。
本文所引述的所有出版物(包括專利、專利申請、雜志文章、實驗手冊、書或其他文件)的全文引入本文作參考。
另外，以計算機和紙件形式提交的序列表以其全部引入本文作參考。關于微生物保藏的說明(PCT細則13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)關于微生物保藏的說明(PCT細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)序列表<110>Yu,Guo-LiangNi,JianRosen,Craig A.<120>腫瘤壞死因子-γ<130>PF141P4.PCT<140>PCT/US99/02722<141>1998-08-06<150>60/074,047<151>1998-02-09<150>09/131,237<151>1998-08-07<150>09/005,020<151>1998-01-09<150>08/461,246<151>1995-06-05<150>PCT/US94/12880<151>1994-11-07<160>24<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2442<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(783)..(1304)<220><221>成熟肽<222>(864)..(1304)<220><221>信號肽<222>(783)..(863)<220><221>misc_特征<222>(2265)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2273)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2307)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2336)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2341)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2379)<223>n等于a,t,g，或c<400>1cccaatcaag agaaattcca tactatcacc agttggccga ctttccaagt ctagtgcaga 60aatccaaggc acctcacacc tagagttcct atacctctga gactccagag gaaagaacaa 120gacagtgcag aaggatatgt tagaacccac tgaaaaccta gaaggttgaa aaggaagcat 180accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240attggtgtta 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180accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240attggtgtta tcatttgact aagaggaaat tatttgtggt gagctccnag tgaggnttag 300ggaccaggng gtgnccaagt ttctatcact tacctcatgn ctntaagnca agtgttttgt 360tcccattgnt gatggggtta aaacnttcag ccatcacttt tggggcaagn atggggnttt 420gangggttgg ngcnggnctt gtcntcgtaa acagggggnt tggtgggttt ttctgggtcc 480ttgggnagga ctt493<210>10<211>380<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(53)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(258)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(316)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(324)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc特征<222>(346)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(367)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(378)<223>n等于a,t,g,or<400>10ggcagaggtt caatttgatc ataaatttgc ttcaattcag gagctttgaa ggnngtccaa 60ggaaagctct agaaaacagt ataaactttc agaggcaaaa tccttcacca atttttccac 120atactttcat gccttgccta aaaaaaatga aaagagagtt ggtatgtctc atggaatgtt 180cacacagaag gagttggttt tcatgtcatc tacagcatat gagaaaagct acctttcttt 240tgattatgta cacaggtntc taaataagga agtatgagtt tcacatgtat attcaaaaat 300acaacagttg cttgtnttca gttngggttt ttcttggcct acccantttt ggtgctgggg 360gttctanctt taaccccnga 380<210>11<211>458<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(9)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(12)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(119)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(303)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(311)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(387)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(409)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(425)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(427)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(453)<223>n等于a,t,g，或c<400>11ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna actttccagg 420cctgncncaa aaaaatggaa agggagttgg tangtccc 458<210>12<211>388<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(11)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(46)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(50)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(81)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(138)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(155)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(182)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(188)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(269)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(317)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(322)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc差異<222>(358)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(363)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(375)<223>n等于a,t,g，或c<400>12ctgcactggg nncatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgantgan ctataccaac 60aaattcctgc tgatcccaga ntcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt 120gggaatgaac ctctgaantg ccagtgaaaa tcagncaagc aggccgacca aacaagccag 180antccatnca ctgtggtcat caccaaggta acagacagct accctgagcc aacccagctc 240cttcatgggg accaagtttg tttgcgaant aggttagcaa ctggttccag cccattttac 300cttgggggcc agttctnctt gncaagaagg ggacaagctt atggtggaac gttcatanca 360tcntttttgg gtggntttac acaaaagg388<210>13<211>37<212>DNA<213>Homo sapiens<400>13gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc 37<210>14<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<400>14cgcgtctaga ctatagtaag aaggctccaa agaagg 36<210>15<211>37<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc 37<210>16<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16cgcgtctaga ctatagtaag aaggctccaa agaagg 36<210>17<211>56<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatggatag taagaaggct ccaaag 56<210>18<211>733<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720gactctagag gat733<210>19<211>1116<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19atggccgagg atctgggact gagctttggg gaaacagcca gtgtggaaat gctgccagag 60cacggcagct gcaggcccaa ggccaggagc agcagcgcac gctgggctct cacctgctgc 120ctggtgttgc tccccttcct tgcaggactc accacatacc tgcttgtcag ccagctccgg 180gcccagggag aggcctgtgt gcagttccag gctctaaaag gacaggagtt tgcaccttca 240catcagcaag tttatgcacc tcttagagca gacggagata agccaagggc 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Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp210 215 220Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys225 230 235 240Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu245 250<210>21<211>434<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(15)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(19)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(133)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(388)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(424)<223>n等于a,t,g，或c<400>21tctacacaag gtacngacng ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 60gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 120caagaagggg acnagctaat ggtgaacgtc agtgacatct ctttggtgga ttacacaaaa 180gaagataaaa ccttctttgg agccttctta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 240aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 300tttcttgggg ccgggagtag ggggcattcc cacagggaca acggtttagc tatgaaattt 360ggggggccca aaatttcaca acttcatngt tgcccttact tgatgagaag tacttaactt 420gganaaaagg cttg 434<210>22<211>417<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(4)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(8)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(17)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(24)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(28)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(31)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(35)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(41)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(43)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(46)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(48)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(50)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(53)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(55)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(61)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(63)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(66)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(202)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc-特征<222>(209)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(282)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(306)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(321)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(344)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(380)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(395)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(405)<223>n等于a,t,g，或c<400>22attncggnac 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atggtggaac gttcatanca 360tcntttttgg gtggntttac acaaaagg 388<210>24<211>458<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(9)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(12)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(119)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(303)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(311)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(387)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(409)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(425)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(427)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(453)<223>n等于a,t,g，或c<400>24ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna 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權利要求
1.一種分離的核酸分子，包含具有與選自如下一組的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的組為(a)編碼具有SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27至147位)的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO:2的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26至147位)的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO:2的1-147位所示的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列；和(g)與上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.權利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有圖1A和1B(SEQID NO:1)的完整核苷酸序列。
3.權利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有圖1A和1B(SEQ ID NO:1)的編碼具有SEQ ID NO:2的-27至147位氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列。
4.權利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有圖1A和1B(SEQ ID NO:1)的編碼具有SEQ ID NO:2的1至147位氨基酸序列的成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列。
5.一種分離的核酸分子，包含具有與選自如下一組的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的組為(a)編碼包含SEQ ID NO:2的n1至147位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n1是-27至35之間的一個整數；(b)編碼包含SEQ ID NO:2的-27至m1位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m1是146至147之間的一個整數；(c)編碼具有SEQ ID NO:2的n1至m1位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n和m是分別在上述(a)和(b)中定義的整數；(d)編碼由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的所述完整氨基酸序列的氨基末端的1至約62個氨基酸；(e)編碼由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的所述完整氨基酸序列的羧基末端的1個氨基酸；和(f)編碼由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分包括上述(d)和(e)的任意氨基末端和羧基末端缺失的組合。
6.權利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
7.權利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有編碼TNF-γ多肽的核苷酸序列，該TNF-γ多肽具有由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列。
8.權利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有編碼成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列，該成熟TNF-γ多肽具有由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。
9.一種分離的核酸分子，包含在嚴格雜交條件下與具有與權利要求1的(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中雜交的多核苷酸在嚴格條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。
10.一種分離的核酸分子，包含編碼具有權利要求1的(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的氨基酸序列的TNF-γ多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
11.權利要求10的分離的核酸分子，其編碼TNF-γ多肽的攜帶表位部分，其中所述部分的氨基酸序列選自SEQ ID NO:2的約Thr-24至約Asn-32；約Ile-37至約Ile-45；約Met-54至約Arg-62；約Gln-63至約Asp-71；約Glu-57至約Gly-65；約Val-80至約Thr-88；約Leu-116至約Val-124；和約Asp-133至約Phe-141序列組成的一組。
12.制備重組載體的方法，包括將權利要求1的分離的核酸分子插入一載體。
13.由權利要求12的方法制備的重組載體。
14.制備重組宿主細胞的方法，包括將權利要求13的重組載體導入一宿主細胞。
15.由權利要求14的方法生產的重組宿主細胞。
16.生產TNF-γ多肽的重組方法，包括在表達所述多肽的條件下培養權利要求15的重組宿主細胞，并回收所述多肽。
17.一種分離的TNF-γ多肽，包含與選自如下一組序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，所述的組為(a)具有SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27至147位)的全長TNF-γ多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:2的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26至147位)的全長TNF-γ多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:2的1-147位所示的氨基酸序列的預測的成熟TNF-γ多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的預測的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列。
18.與權利要求17的TNF-γ多肽特異結合的分離的抗體。
19.治療患者的腫瘤的方法，包括給予患者權利要求1的分離的核酸分子。
20.治療患者的腫瘤的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求17的TNF-γ多肽。
21.治療患者的類風濕性關節炎的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求17的TNF-γ多肽。
22.一種分離的核酸分子，包含具有與選自如下一組的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的組為(a)編碼具有SEQ ID NO:20的完整氨基酸序列(即SEQ IDNO:20的1至251位)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO:20的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2至251位)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO:20的62-251位所示的SEQ ID NO:20的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的胞外域的核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的胞外域的核苷酸序列；和(g)與上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。
23.權利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有圖20A和20B(SEQ ID NO:19)的完整核苷酸序列。
24.權利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有圖20A和20B(SEQ ID NO:19)的編碼具有SEQ ID NO:20的1至251位氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列。
25.權利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有圖20A和20B(SEQ ID NO:19)的編碼具有SEQ ID NO:20的約62至約251位氨基酸序列的TNF-γ多肽的胞外域的核苷酸序列。
26.一種分離的核酸分子，包含具有與選自如下一組的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的組為(a)編碼包含SEQ ID NO:20的n4至251位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n4是2至246之間的一個整數；(b)編碼包含SEQ ID NO:20的1至m4位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m4是6至250之間的一個整數；(c)編碼具有SEQ ID NO:20的n4至m4位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n4和m4是分別在上述(a)和(b)中定義的整數；(d)編碼由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的所述完整氨基酸序列的氨基末端的1至約246個氨基酸；(e)編碼由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的所述完整氨基酸序列的羧基末端的1個氨基酸；和(f)編碼由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分包括上述(d)和(e)的任意氨基末端和羧基末端缺失的組合。
27.權利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
28.權利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有編碼TNF-γ-β多肽的核苷酸序列，該TNF-γ-β多肽具有由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列。
29.權利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有編碼TNF-γ-β多肽的胞外域的核苷酸序列，該TNF-γ-β多肽的胞外域具有由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。
30.一種分離的核酸分子，包含在嚴格雜交條件下與具有與權利要求22的(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中雜交的多核苷酸在嚴格條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。
31.一種分離的核酸分子，包含編碼具有權利要求22的(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
32.制備重組載體的方法，包括將權利要求22的分離的核酸分子插入一載體。
33.由權利要求32的方法制備的重組載體。
34.制備重組宿主細胞的方法，包括將權利要求33的重組載體導入一宿主細胞。
35.由權利要求34的方法生產的重組宿主細胞。
36.生產TNF-γ-β多肽的重組方法，包括在表達所述多肽的條件下培養權利要求35的重組宿主細胞，并回收所述多肽。
37.一種分離的TNF-γ多肽，包含與選自如下一組序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，所述的組為(a)具有SEQ ID NO:20的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1至251位)的全長TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:20的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2至251位)的全長TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:20的62-251位所示的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的預測的胞外域的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的TNF-γ-β多肽的預測的胞外域的完整氨基酸序列。
38.與權利要求37的TNF-γ-β多肽特異結合的分離的抗體。
39.治療患者的腫瘤的方法，包括給予患者權利要求22的分離的核酸分子。
40.治療患者的腫瘤的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求37的TNF-γ多肽。
41.治療患者的類風濕性關節炎的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求37的TNF-γ多肽。
全文摘要
本發明公開了人TNF－γ－α和TNF－γ－β多肽,編碼這些多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術生產這些多肽的方法。本發明還公開了利用這些多肽抑制例如腫瘤或癌癥的細胞生長、促進傷口愈合、提供抗感染抗性、誘導炎性活性和刺激某些細胞類型生長以治療疾病如再狹窄的方法。本發明還涉及用于檢測TNF－γ－α和TNF－γ－β核酸序列中的突變或TNF－γ－α和TNF－γ－β多肽的過量表達的診斷方法。本發明還公開了抗這些多肽的拮抗劑及其作為治療惡病質、膿毒性休克、腦瘧疾、炎癥、關節炎和移植排斥的治療劑的應用。
文檔編號C07K16/24GK1322244SQ99811864
公開日2001年11月14日 申請日期1999年2月8日 優先權日1998年8月7日
發明者余國良, 倪健, 克雷格·A·羅森, 張筠 申請人:人體基因組科學有限公司