一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：AMP緩沖液5~35mmol/L、神經氨酸苷酶2~8KU/L、乳酸脫氫酶0.01~0.30KU/L、吐溫?20 3~15g/L、苯甲酸鈉0.1~2g/L，試劑R2：AMP緩沖液5~35mmol/L、NADH2~18mmol/L、神經氨酸醛縮酶0.5~5.5KU/L、聚乙二醇?2000 1~15g/L、苯甲酸鈉0.1~2g/L，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；根據吸光度變化值計算出樣本中的唾液酸的濃度。本發明具有操作方便、測定準確度高等優點。
【專利說明】
一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定唾液酸的試劑盒及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 唾液酸(SA)是一種天然存在的碳水化合物，它最初由頌下腺粘蛋白中分離而出， 也因此而得名，唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在，人體中，腦的唾液酸含 量最高，腦灰質中的唾液酸含量是肝、肺等內臟器官的15倍，唾液酸的主要食物來源是母 乳，也存在于牛奶、雞蛋和奶酪中。
[0003] 唾液酸是細胞膜糖蛋白的重要組成部分，與生物體的許多生物學功能有關，且與 細胞惡變、癌轉移、浸潤、失去接觸性抑制、細胞粘附性降低以及腫瘤抗原性密切相關，測定 血清唾液酸濃度，可作為癌腫診斷輔助性指標和療效觀察指標。
[0004] 唾液酸(SA)明顯升高的疾病有:急性白血病、食道癌、賁門癌、胃癌、腸癌、肝癌、肺 癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者為最高。腫瘤患者血清唾液酸增高可能是腫瘤細 胞涎糖蛋白合成增加和代謝的改變在血中的反映 癌癥患者的唾液酸(SA)水平動態變化與病情相關，可以用于早期發現腫瘤的轉移和復 發。
[0005] 目前，檢測唾液酸（SA)含量的方法有HPLC法、化學比色法，HPLC法雖然靈敏度高、 特異性好，但是需要特殊的儀器且昂貴，化學比色法特異性低，操作復雜，部分反應的物質 需要特殊的化學手段提取，而且測定準確度低。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術操作復雜、成本高以及測定準確 度低的缺陷，而提供一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發明解決上述技術問題提供的技術方案是:本發明公開了一種測定唾液酸的試 劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.5~5.5KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優選，本發明公開了一種測定唾液酸的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試 劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 作為優選，本發明還公開了上述測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，包 括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.5~5.5 KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d )根據吸光度變化值計算出樣本中的唾液酸的濃度。
[0010]作為優選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。
[0011]作為優選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 10到1:50之間。
[0012]本發明的檢測原理是:樣品中的唾液酸受神經氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神經 氨酸，進而在N-乙酰神經氨酸醛縮酶(NANA-醛縮酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖 胺。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脫氫酶(LDH)作用下生成乳酸和NAD+。測定該NADH的吸光下 降的速率可求得樣本中唾液酸濃度。
式中：△ AT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 Δ As以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 Cs校準液中SA的濃度 與現有技術相比，本發明具有以下有益優點：本發明通過在試劑R2中添加了反應加速 劑聚乙二醇-2000，加快了反應的反應速度，防止了因反應體系反應過慢所帶來的酶濃度變 化過小，進一步造成反映產物過低、變化不靈敏的缺陷，因此本發明的檢測的準確性較高， 另外在苯甲酸鈉作為防腐劑的同時，提高了整個試劑的保存的穩定性，也就進一步提高了 本發明的檢測的準確性、精密性，而且本發明不含有任何污染物，不會造成環境的污染，操 作也比較簡便。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合具體實施例進一步說明，但本發明并不僅限于這些實施例。
[0015] 實施例1 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水。
[0016] 實施例2 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: AMP緩沖液 5 mmol/L 神經氨酸苷酶 8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.30 KU/L 吐溫-20 3 g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5 mmol/L NADH 18 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.5KU/L 聚乙二醇-2000 15g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水。 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長340nm，副波長405nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應方向：負反應； 3、 檢測步驟 (a) 取180ul試劑R1與6μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入60μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 值ΔΑ = A2-A1; (d) 根據樣本中唾液酸(SA)的活性 計算出樣本中的唾液 酸的濃度。
[0017] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 5 mmol/L 神經氨酸苷酶 8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.30 KU/L 吐溫-20 3 g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5 mmol/L NADH 18 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.5 KU/L 聚乙二醇-2000 15 g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長340nm，副波長405nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應方向：負反應； 3、 檢測步驟 (a) 取180ul試劑R1與6μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入60μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 值ΔΑ = A2-A1; (d) 根據樣本中唾液酸(SA)的活性 計算出樣本中的唾液 酸的濃度。
[0018] 表1為實施例1所制得的測定唾液酸的試劑盒以及實施例2所制得的測定唾液酸的 試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的唾液酸的濃度為25.0 mg/dL，測 定結果見表1:
由表1可知，本發明所制得的測定唾液酸的試劑盒對質控品1的測定結果偏差較小，因 此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0019] 表2為實施例1所制得的測定唾液酸的試劑盒以及實施例2所制得的測定唾液酸的試劑 盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的唾液酸的濃度為46.0 mg/dL，測定結 果見表2:
由表2可知，本發明所制得的測定唾液酸的試劑盒對質控品2的測定結果偏差較小，因 此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0020] 表3為實施例3所制得的測定唾液酸的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復測 定以及實施例4所制得的測定唾液酸的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復測定，對所 得的結果進行SD和CV的計算，結果如下： 表3
由表3可知本發明所制得的測定唾液酸的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可知，實 施例3為最優的選擇。
[0021] 上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種測定唾液酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組 分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.5~5.5 KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水。2. 根據權利要求1所述的一種測定唾液酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑 R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水。3. 根據權利要求1或2所述的一種測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.5~5.5 KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d )根據吸光度變化值計算出樣本中的唾液酸的濃度。4. 根據權利要求3所述的一種測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于:步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。5. 根據權利要求3所述的一種測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:10到1:50之間。
【文檔編號】G01N1/38GK106092942SQ201610358111
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司