一種測定結合珠蛋白的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定結合珠蛋白的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：緩沖液、加速劑、表面活性劑、無機鹽離子、防腐劑、其溶劑為純化水，試劑R2：緩沖液、助懸劑、表面活性劑、無機鹽離子、防腐劑、抗人結合珠蛋白抗體、其溶劑為純化水，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；根據吸光度變化值計算出樣本中的結合珠蛋白的濃度。本發明具有操作方便、準確度高等優點。
【專利說明】
一種測定結合珠蛋白的試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定結合珠蛋白的試劑盒 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 結合珠蛋白，又稱觸珠蛋白，是一種分子量為85000的酸性糖蛋白，廣泛存在于人 類和多種哺乳動物的血清及其他體液中，在CAM電泳及瓊脂糖凝膠電泳中，結合珠蛋白位于 a2區帶，分子中有兩對肽鏈(a鏈與M連)共同形成a2P2的四聚體。結合珠蛋白主要在肝臟合 成，其降解也在肝臟，半衰期約為3.5~4天。
[0003]結合珠蛋白的主要功能是與游離血紅蛋白結合成穩定的復合物，然后被單核-巨 噬細胞系統處理掉，正常情況下，人的紅細胞在循環血中盡管不斷受到機械損傷，但仍可保 持其完整性，這與紅細胞具有良好可塑性的細胞形態和血液微環境的相對穩定有關。當某 種原因誘發紅細胞在血管內破壞時，大量血紅蛋白會釋放到血液循環中，血紅蛋白可以從 人的腎臟濾過，造成腎臟損害，甚至造成不可逆轉的腎功能損傷。當結合珠蛋白與游離血紅 蛋白結合成穩定的復合物后，由于其分子較大，不能從腎臟排出，這樣可以阻止血紅蛋白從 腎小球濾過，避免游離血紅蛋白對腎小管的損害，結合珠蛋白與游離血紅蛋白結合成復合 物后，呈現出新的抗原決定簇，可被單核細胞、巨噬細胞表面的血紅蛋白清除受體(CD163) 所識別并結合，之后被吞噬降解，從而除去了血循環中游離的血紅蛋白，當檢測發現血清結 合珠蛋白含量下降時，結合病人的臨床表現，可以確定是否發生了血管內溶血性疾病，如陣 發性睡眠性血紅蛋白尿癥和蠶豆病，以及先天性無結合珠蛋白血癥等。還有一些其他類型 的血管內溶血和部分血管外溶血時結合珠蛋白可降低，其降低的程度常與病性輕重相一 致。
[0004] 結合珠蛋白又是一種急性期時相反應蛋白，當機體處在應激狀態時，血液中的結 合珠蛋白明顯增多，如心肌梗塞、腫瘤、炎癥、創傷、感染等病理狀態時，以及應用某些激素， 如皮質激素和雄性激素后，其血清含量常有顯著升高，并與嚴重程度和預后有關，研究結論 表明，血清結合珠蛋白和鐵蛋白含量的變化，對急性肺栓塞和深部靜脈血栓形成的病人具 有一定的診斷價值。另外在進行糖尿病合并血管病變患者的基礎研究中，也發現血清結合 珠蛋白含量與疾病進展發生相關性變化，HP基因型有可能是糖尿病冠狀動脈病變的一個獨 立的風險因素，因此認為，對結合珠蛋白含量的動態監測，有益于糖尿病血管病變患者的治 療，尤其是在建立糖尿病患者血管病變預防策略時，具有十分重要的意義。 由于結合珠蛋白的合成與降解均在肝臟，并且在結合珠蛋白與血紅蛋白的復合物形成 與降解的過程中，結合珠蛋白不能重復利用，因此當肝臟功能出現問題時，體內的結合珠蛋 白數量常發生明顯的變化，合成不足則其含量減少，降解不足則其含量增多，此時化驗檢查 血液中的結合珠蛋白含量是否減少或增加，對診斷肝臟疾病，判斷疾病的預后，很有幫助。
[0005] 目前市場上的測定結合珠蛋白的試劑普遍存在操作不便、測定準確度低的缺陷， 因此需要進行改進。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術操作復雜、測定準確度低的缺 陷，而提供一種測定結合珠蛋白的試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發明解決上述技術問題提供的技術方案是:本發明公開了一種測定結合珠蛋白 的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 15~185 mmol/L 加速劑 15~45 g/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 10~300 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 15~185 mmol/L 助懸劑 10.0~30.0 ml/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 150~250 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 抗人結合珠蛋白抗體3.0~18.0 ml/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖 液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種的組合，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、 聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種的組合，所述的表面活性劑采用吐溫-80、 聚氧乙烯苯基醚中的一種，所述的無機鹽離子采用氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂中的一種或多種 的組合，所述的防腐劑采用苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種的組合。
[0009] 作為優選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖 液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種的組合，所述的助懸劑采用阿拉伯膠、海藻酸 鈉、膠體二氧化硅、甘油中的一種或多種的組合，所述的表面活性劑采用吐溫-80、聚氧乙烯 苯基醚中的一種，所述的無機鹽離子采用氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂中的一種或多種的組合， 所述的防腐劑采用苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種的組合。
[0010] 作為優選，本發明公開了一種測定結合珠蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1 和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 30g/L 吐溫-80 15 ml/L 氯化鈉 150 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 20 ml/L 吐溫-80 14 ml/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 抗人結合珠蛋白抗體10.0 ml/L 其溶劑為純化水。
[0011]作為優選，本發明還公開了上述測定結合珠蛋白的試劑盒的制備方法和使用方 法，包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 15~185 mmol/L 加速劑 15~45 g/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 10~300 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 15~185 mmol/L 助懸劑 10.0~30.0 ml/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 150~250 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 抗人結合珠蛋白抗體3.0~18.0 ml/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據吸光度變化值計算出樣本中的結合珠蛋白的濃度。
[0012]作為優選，步驟(b)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。
[0013]作為優選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 5到1:150之間。
[0014]本發明的檢測原理是:本發明所采用的免疫比濁法的反應原理是:樣品中的結合 珠蛋白可與試劑R2中的抗人結合珠蛋白抗體發生特異性的抗原抗體反應，形成抗原抗體免 疫復合物，形成濁度，其濁度高低與樣本中結合珠蛋白含量成正相關，通過測定濁度并與結 合珠蛋白校準曲線進行換算，求出樣品中結合珠蛋白的含量。
式中：A At以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 A As以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 Cs校準液中Hp的濃度。
[0016]與現有技術相比，本發明具有以下有益優點:本試劑中添加了助懸劑和加速劑，助 懸劑有利于抗體的分散和穩定，加速劑則可以加速抗原抗體的反應，即使較微弱的變化也 可以檢測出來，提高了試劑分析靈敏度。
【具體實施方式】
[0017]以下結合具體實施例進一步說明，但本發明并不僅限于這些實施例。
[0018] 實施例1 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 30 g/L 吐溫-80 15 ml/L 氯化鈉 150 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 20 ml/L 吐溫-80 14 ml/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 抗人結合珠蛋白抗體10.0 ml/L 其溶劑為純化水。 實施例2 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 185 mmol/L 聚乙二醇-2000 45 g/L 聚氧乙稀苯基醚 10.0ml/L 氯化鉀 300 mmol/L 苯甲酸鈉 〇.lg/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 185 mmol/L 阿拉伯膠 10.0 ml/L 聚氧乙稀苯基醚 10.0ml/L 氯化鉀 250 mmol/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 抗人結合珠蛋白抗體18.0 ml/L 其溶劑為純化水。 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 30 g/L 吐溫-80 15 ml/L 氯化鈉 150 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 20 ml/L 吐溫-80 14 ml/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 抗人結合珠蛋白抗體10.0 ml/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長340nm，副波長700nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應； 3、 檢測步驟 (a) 取210yl試劑R1與2yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入70yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據樣本中結合珠蛋白的活性 計算出樣本中的結合珠 蛋白的濃度。
[0019] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 185 mmol/L 聚乙二醇-2000 45 g/L 聚氧乙稀苯基醚 10.0ml/L 氯化鉀 300 mmol/L 苯甲酸鈉 〇.lg/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 185 mmol/L 阿拉伯膠 10.0 ml/L 聚氧乙稀苯基醚 10.0ml/L 氯化鉀 250 mmol/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 抗人結合珠蛋白抗體 18.0 ml/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長340nm，副波長700nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應； 3、 檢測步驟 (a) 取210yl試劑R1與2yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入70yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 A A = A2-A1； (d) 根據樣本中結合珠蛋白的活性 計算出樣本中的結合珠 蛋白的濃度。
[0020]表1為實施例1所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定結合 珠蛋白的試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的結合珠蛋白的濃度為 0.689 g/L，測定結果見表1:
由表1可知，本發明所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒對質控品1的測定結果偏差較 小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0021]表2為實施例1所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定結合 珠蛋白的試劑盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的結合珠蛋白的濃度為 2.00 g/L，測定結果見表2:
由表2可知，本發明所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒對質控品2的測定結果偏差較 小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0022]表3為實施例3所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反 復測定以及實施例4所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復測 定，對所得的結果進行SD和CV的計算，結果如下： 表3
由表3可知本發明所制得的測定結合珠蛋白的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可 知，實施例3為最優的選擇。
[0023]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種測定結合珠蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液 體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 15~185 mmol/L 加速劑 15~45 g/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 10~300 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 15~185 mmol/L 助懸劑 10.0~30.0 ml/L 表面活性劑 10.0~25.0 1/L 無機鹽離子 150~250 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 抗人結合珠蛋白抗體3.0~18.0 ml/L 其溶劑為純化水。2. 根據權利要求1所述的一種測定結合珠蛋白的試劑盒，其特征在于：所述的試劑R1 中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的 一種或多種的組合，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中 的一種或多種的組合，所述的表面活性劑采用吐溫-80、聚氧乙烯苯基醚中的一種，所述的 無機鹽離子采用氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、 苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種的組合。3. 根據權利要求1所述的一種測定結合珠蛋白的試劑盒，其特征在于：所述的試劑R2 中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的 一種或多種的組合，所述的助懸劑采用阿拉伯膠、海藻酸鈉、膠體二氧化硅、甘油中的一種 或多種的組合，所述的表面活性劑采用吐溫-80、聚氧乙烯苯基醚中的一種，所述的無機鹽 離子采用氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、苯甲酸 鈉、疊氮鈉中的一種或多種的組合。4. 根據權利要求1-3任一所述的一種測定結合珠蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此 獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 30 g/L 吐溫-80 15 ml/L 氯化鈉 150 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 20 ml/L 吐溫-80 14 ml/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 0.4 g/L 抗人結合珠蛋白抗體 10.0 ml/L 其溶劑為純化水。5. 根據權利要求1-3任一所述的一種測定結合珠蛋白的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 15~185 mmol/L 加速劑 15~45 g/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 10~300 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 15~185 mmol/L 助懸劑 10.0~30.0 ml/L 表面活性劑 10.0~25.0 ml/L 無機鹽離子 150~250 mmol/L 防腐劑 0.1~0.7 g/L 抗人結合珠蛋白抗體 3.0~18.0 ml/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據吸光度變化值計算出樣本中的結合珠蛋白的濃度。6. 根據權利要求5所述的一種測定結合珠蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，其特 征在于:步驟(b)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。7. 根據權利要求5所述的一種測定結合珠蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，其特 征在于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1:150之 間。
【文檔編號】G01N33/68GK106053839SQ201610544881
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司