專利名稱：藥物原料中細菌內毒素的檢測方法
技術領域：
本發明屬于微生物檢驗領域，具體涉及ー種測定易揮發、難溶于水藥物原料中細菌內毒素的方法。
背景技術：
無菌藥品是指法定藥品標準中列有無菌檢查項目的制劑和原料藥，包括無菌制劑和無菌原料藥。“產品的無菌或其它質量特性絕不能只依賴于任何形式的最終處理或成品檢驗(包括無菌檢查)。”是2010年版藥品生產質量管理規范中，無菌藥品管理的基本原則之
ο細菌內毒素是注射劑藥品中的主要污染物質。細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復合物，它的特殊性不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的ー種具有內毒素生物活性的物質。內毒素具有極強的生物學活性，特別是革蘭氏陰性菌感染和靜脈注射提取的內毒素溶液吋，可導致動物體發生內毒素休克和死亡。很多嚴重疾病(如損失、燒傷、心、腎、消化系統、呼吸系統、腫瘤、心血管手木、 自動免疫等方面的疾病)都直接或間接與革蘭氏陰性菌感染及其釋放的內毒素有關。專利CN1116031C提供了一種靜脈注射用乳化吸入全身麻酔藥及其制備方法。該方法提示可將揮發性麻醉藥制成靜脈給藥。揮發性藥物如氟烷、地氟醚、異氟烷、恩氟烷、七氟烷等在制成靜脈注射用藥時，作為直接進入血液藥物，細菌內毒素是藥典規定必檢項。同時為進ー步控制無菌產品質量，除了嚴格按照GMP要求采用無菌生產エ藝，還需在源頭上把關，對原料的細菌內毒素進行控制是非常必要和有效的質量保證手段。常規細菌內毒素檢查法檢測或量化樣品細菌內毒素吋，首先需對樣品進行復溶、 稀釋或在水性溶液中浸提制成供試樣品溶液，再根據樣品的性質確定內毒素限值和最大有效稀釋倍數(MVD)，最后采用凝膠法或光度測定法檢查樣品的細菌內毒素。但異氟烷、恩氟烷、七氟烷等揮發性原料難溶于水，采用已知方法無法直接檢查出樣品細菌內毒素。

發明內容
本發明的目的是提供ー種簡便、可靠方法，可快速檢測易揮發性、不溶于水藥物原料的細菌內毒素含量的方法。本發明的目的是這樣實現的一種藥物原料中細菌內毒素的檢測方法，該檢測方法包括如下步驟
1)藥物原料的選擇選擇易揮發、難溶于水藥物原料；
2)供試液的制備稱取計量所選擇的藥物原料，加熱使其揮發，用等量細菌內毒素檢查用水(BET)補充到原藥物質量，得到供試液；
3)利用步驟2)中得到的供試液，采用常規方法檢測藥物原料中細菌內毒素。步驟2)中對藥物原料的加熱溫度為藥物原料的沸點。所述的藥物原料為氟烷、地氟醚、異氟烷、恩氟烷或七氟烷。
本發明具有以下有益效果
(1)檢測過程中無需添加其它試劑，能夠簡便、可靠的檢測樣品中細菌內毒素的存在。(2)本發明提供的檢測方法能夠測定出采用已知方法無法直接測定的如異氟烷、 恩氟烷、七氟烷等難溶于水、易揮發的藥物原料中的細菌內毒素，能從源頭上對無菌產品質量進行控制，對保證制劑產品安全性有重要意義。
具體實施例方式本發明的整體檢測方案如下
1)藥物原料的選擇選擇易揮發、難溶于水藥物原料，如氟烷、地氟醚、異氟烷、恩氟烷或七氟烷；
2)供試液的制備稱取計量所選擇的藥物原料，加熱到沸點使其揮發，用等量細菌內毒素檢查用水(BET)補充到原藥物質量，得到供試液；
3)利用步驟2)中得到的供試液，采用常規方法檢測藥物原料中細菌內毒素。一、實驗準備 1、實驗用具
1)數顯恒溫水浴鍋，型號HH-2，金壇市榮華儀器制造有限公司。2) V0RTEX-2 旋渦混合器。3)其它玻璃試驗器械均超聲后純化水清洗三次，然后在250°C下干烤2小時以上。、試驗材料
鱟試劑規格為0. Iml/支，鱟試劑靈敏度標示值λ =0. 5EU/ml ； 有國家主管部門批準文號，并經過靈敏度復核符合規定的細菌內毒素工作標準品 (WSE) (160EU/ 支)；
細菌內毒素檢查用水(BET) :5ml/支(按藥典要求，內毒素含量采用凝膠法檢查應小于 0. 015Eu/m 1的滅菌注射用水，采用光度測定法為小于0. 005Eu/m 1)。以上材料市售可得。ニ、溶液的配備
1、供試樣品的制備
精密稱取藥物原料樣品，將其置于加熱鍋中加熱蒸干，然后取等重細菌內毒素檢查用水補入，封ロ混合后作為供試樣品。經驗證實驗證明蒸干過程沒有帶入外源內毒素也沒有損失樣品內含有的內毒素， 且本稀釋級溶液對內毒素檢查沒有影響。否則需取更高稀釋級溶液進行干擾試驗。(干擾試驗在實施例中詳述。)
2、細菌內毒素標準溶液的配備
取細菌內毒素工作標準品1支，用砂輪輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭啟開，加入Iml細菌內毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混合15分鐘，然后制備2. 0 λ、1. 0 λ、0. 5 λ、0. 25 λ 所需內毒素標準溶液，毎次稀釋均在漩渦混合器上混合30秒鐘，封ロ備用。三、細菌內毒素檢測
限值的確定參照注射液用法用量，按藥典要求以L=K/M (L為供試品的細菌內毒素限值；K為人每千克體重每小時最大可接受的細菌內毒素劑量；M為人每千克體重每小時的最大供試品劑量)計算限值L，単位Eu/ml、Eu/mg或Eu/U (活性単位)。
將制備好的供試樣品，稀釋到經過干擾試驗驗證的最大稀釋倍數MVD (MVD=c*L/ λ，c為供試品溶液濃度，)，與細菌內毒素標準溶液混合成下表溶液
權利要求
1.一種藥物原料中細菌內毒素的檢測方法，其特征在于該檢測方法包括如下步驟1)藥物原料的選擇選擇易揮發、難溶于水藥物原料；2)供試液的制備稱取計量所選擇的藥物原料，加熱使其揮發，用等量細菌內毒素檢查用水(BET)補充到原藥物質量，得到供試液；3)利用步驟2)中得到的供試液，采用常規方法檢測藥物原料中細菌內毒素。
2.根據權利1所述的藥物原料中細菌內毒素的檢測方法，其特征在于步驟2)中對藥物原料的加熱溫度為藥物原料的沸點。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥物原料為氟烷、地氟醚、異氟烷、恩氟烷或七氟烷。
全文摘要
一種藥物原料中細菌內毒素的檢測方法，包括以下步驟藥物原料的選擇選擇易揮發、難溶于水藥物原料；供試液的制備稱取計量所選擇的藥物原料，加熱使其揮發，用等量細菌內毒素檢查用水補充到原藥物質量，得到供試液；對供試液采用常規方法檢測藥物原料中細菌內毒素。本發明提供的檢測方法能夠測定出采用已知方法無法直接測定的但異氟烷、恩氟烷、七氟烷等難容于水、易揮發的藥物原料中的細菌內毒素，能從源頭上對無菌產品質量進行控制，對保證制劑產品安全性有重要意義。檢測過程中無需添加其它試劑，能夠簡便、可靠的檢測樣品中細菌內毒素的存在。
文檔編號G01N33/15GK102565293SQ201110435140
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者劉峰, 徐華斌, 李莉娥, 趙蔓菁, 鐘麗君 申請人:宜昌人福藥業有限責任公司