分離純化昆蟲谷氨酰胺轉氨酶的方法
【專利摘要】本發明涉及一種昆蟲谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase)的分離純化方法。所述分離純化方法包括(1)制備昆蟲谷氨酰胺轉胺酶的步驟；(2)采用硫酸銨，通過沉淀方式分離由步驟(1)所得的昆蟲谷氨酰胺轉胺酶，得到初步目標蛋白的步驟；(3)初步目標蛋白依次經葡萄糖凝膠柱和離子交換柱層析，得到目標蛋白的步驟；或，初步目標蛋白依次經離子交換柱和葡萄糖凝膠柱層析，得到目標蛋白的步驟。本發明首次成功分離純化了昆蟲谷氨酰胺轉胺酶，為以谷氨酰胺轉氨酶為作用靶標的害蟲生理調控研究及以谷氨酰胺轉氨酶為作用靶標的新型害蟲防治或殺蟲手段的研發奠定了基礎。
【專利說明】
分離純化昆蟲谷氨醜胺轉氨酶的方法
技術領域
[0001 ]本發明設及一種昆蟲谷氨酷胺轉胺酶(Transglutaminase)的分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 谷氨酷胺轉胺酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13)能催化谷氨酷胺膚鍵的丫-甲 酷胺基團與賴氨酸膚鍵的ε-氨基基團發生酷基轉移反應，形成ε-(γ-谷氨酷基)氨酸異膚 鍵。能特異性地識別谷氨酷胺類蛋白底物，并對胺類酷基受體的特異性較低，賴氨酸膚鍵的 ε-氨基基團或低分子聚合的伯胺都可W作為反應的酷基受體。具有催化蛋白質分子間或分 子內的交聯反應、氨基酸與蛋白質之間的連接、W及蛋白質分子內谷氨酷胺基的水解等優 良的催化性能。
[0003] 在哺乳動物中，谷氨酷胺轉胺酶參與凝血、免疫防御、細胞分化和調亡、炎性自身 免疫和神經退行性疾病等過程。被用于外創傷、骨折和軟骨病變的修復W及某些腸道疾病 的治療和自身免疫抗原，還被用于許多重大疾病（如：白內障、動脈硬化癥、阿爾茨海默式、 亨廷頓氏病、帕金森病等)的調控過程。目前，谷氨酷胺轉胺酶在食品、化妝品和醫藥等領域 中有著極其廣泛的應用價值。
[0004] 研究谷氨酷胺轉胺酶發現:在微生物、植物、無脊椎動物、兩棲動物、魚類、鳥類等 物種中均存在谷氨酷胺轉胺酶。但是，不同來源谷氨酷胺轉胺酶不僅在酶學性質如：分子 量、等電點、最適pH值、最適溫度等方面存在較大差異，而且在蛋白結構、氨基酸序列、空間 結構、活性等方面也存在差異。其中，微生物來源的谷氨酷胺轉胺酶分子量普遍較小，W 40W)a居多，約為哺乳動物谷氨酷胺轉胺酶分子量的一半。不同來源谷氨酷胺轉胺酶的共同 點在于:蛋白活性中屯、都有Cys殘基，酶的催化Ξ聯體具有高度保守性。
[0005] 在自然條件下，谷氨酷胺轉胺酶容易形成不可逆的聚合物，因而很難分離純化。另 夕h保持谷氨酷胺轉胺酶的穩定性和建立靈敏度高的酶活檢測方法也是分離純化谷氨酷胺 轉胺酶過程中需解決的一大難點。
[0006] 盡管已發現谷氨酷胺轉胺酶廣泛分布于昆蟲肌肉和細胞中，但昆蟲谷氨酷胺轉胺 酶的特性被報道較少，目前主要集中在果蛹（Drosophila melanogaster)和岡比亞按蚊 (Anopheles gambiae)等蟲媒的谷氨酷胺轉胺酶。據報道，果蛹體內谷氨酷胺轉胺酶參與血 漿凝結的形成，敲除果蛹的谷氨酷胺轉胺酶基因能顯著降低果蛹體內谷氨酷胺轉胺酶的表 達水平，幼蟲更容易受到外源病原真菌和細菌的感染，顯著增加幼蟲感染性死亡率;在岡 比亞按蚊體內，谷氨酷胺轉胺酶可能參與其生育和免疫生理的調控。
[0007] 對昆蟲谷氨酷胺轉胺酶認識的局限性，極大地限制了 W谷氨酷胺轉胺酶為作用祀 標的害蟲生理調控研究和新型害蟲防治或殺蟲手段的研發。但是，到目前為止，有關昆蟲谷 氨酷胺轉胺酶的分離純化過程尚未見文獻報道。

【發明內容】

[000引為了解決上述W谷氨酷胺轉胺酶為作用祀標的害蟲生理調控研究和新型害蟲管 理手段的研發，進一步深化認識昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的難題，本發明的目的在于:提供一種 昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的分離純化方法。
[0009] 本發明所述昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的分離純化方法，其包括如下步驟：
[0010] (1)制備昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的步驟；
[0011] (2)采用硫酸錠，通過沉淀方式分離由步驟（1)所得的昆蟲谷氨酷胺轉胺酶，得到 初步目標蛋白的步驟;和，
[0012] (3)初步目標蛋白依次經葡萄糖凝膠柱和離子交換柱層析，得到目標蛋白的步驟； 或，初步目標蛋白依次經離子交換柱和葡萄糖凝膠柱層析，得到目標蛋白的步驟；
[0013] 其中，所述昆蟲為鱗翅目、直翅目、銷翅目、雙翅目、同翅目或雙翅目等害蟲，所述 葡萄糖凝膠柱分離范圍為3，000~150，000。
【附圖說明】
[0014] 圖1經不同飽和度硫酸錠沉淀后樣品中谷氨酷胺轉氨酶比活力。
[0015] 圖2谷氨酷胺轉胺酶的S邱hadex G-75葡聚糖凝膠分離。
[0016] 圖3谷氨酷胺轉胺酶的S邱hadex G-100葡聚糖凝膠分離。
[0017] 圖4 PH7.8的Tris-HCl緩沖液對谷氨酷胺轉胺酶的離子交換層析洗脫分離；
[0018] 圖中：各泳道對應于4個具有谷氨酷胺轉胺酶活性的蛋白樣品。
[0019] 圖5 P冊.5的Tris-HCl緩沖液對谷氨酷胺轉胺酶的離子交換層析洗脫分離。
[0020] 圖6谷氨酷胺轉胺酶經方法1純化后的凝膠電泳圖譜；
[0021] 圖中:M-標準蛋白；TG-目標蛋白。
[0022] 圖7谷氨酷胺轉胺酶經方法2純化后的凝膠電泳圖譜；
[0023] 圖中：M-標準蛋白；1-粗酶液;2-硫酸錠沉淀后酶液;3-第一次離子交換沉析 后酶液;4-第二次離子交換沉析后酶液;5-凝膠層析后酶液。
【具體實施方式】
[0024] 在本發明一個優選的技術方案中，采用55%飽和度的硫酸錠，通過沉淀方式分離 由步驟(1)所得的昆蟲谷氨酷胺轉胺酶，得到初步目標蛋白。
[0025] 在本發明另一個優選的技術方案中，步驟(3)中，當初步目標蛋白采用先經離子交 換柱層析，再經葡萄糖凝膠柱層析時，需經兩次離子交換柱層析，再經葡萄糖凝膠柱層析；
[0026] 在本發明又一個優選的技術方案中，步驟(3)中所用葡萄糖凝膠柱為S邱hadex Ο? ι 00 凝膠柱 (分離范圍 4 ， 000-150 ， 000) 。
[0027] 在本發明又一個優選的技術方案中，步驟(3)中所用離子交換柱為DEAE-纖維素- 52離子交換柱，所用洗脫液是:pH值為7.0~9.0(更優選7.8~8.5)、濃度為15mM~25mM的 Tris-肥1緩沖液，且在所述Tris-肥1緩沖液含有0~1.0M NaCl (更優選0.2M~0.8M)。
[0028] 本發明的發明人首次成功分離純化了昆蟲谷氨酷胺轉胺酶，為W谷氨酷胺轉氨酶 為作用祀標的害蟲生理調控研究及W谷氨酷胺轉氨酶為作用祀標的新型害蟲防治或殺蟲 手段的研發奠定了基礎。
[0029] 下面結合實施例對本發明做進一步闡述，其目的僅在于更好理解本發明的內容。 因此，所舉之例不限制本發明的保護范圍。
[0030] 實施例1
[0031 ]昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的制備
[0032] 實驗方法：
[0033] (1)取大小均一的四齡粘蟲幼蟲若干頭，饑餓處理地后，用20mM化is-HCl緩沖液 (口冊.0)清洗蟲體。
[0034] (2)按照體積比3:l(v:v)，（緩沖液:幼蟲的體積比為3:1)將幼蟲置于20mM Tris- 肥1緩沖液(P冊.0)中，冰浴條件下，靜置30min后，充分勻漿。
[0035] (3)待蟲體充分破碎后，將勻漿液離屯、（10,000旨，4°(：)20111^，取上清液進行冷凍干 燥，收集干粉，用作谷氨酷胺轉胺酶的酶源。
[0036] (4)測定谷氨酷胺轉胺酶的活力。取10化1預熱至37°C的苯甲基氧化碳酷-k谷氨 酷胺甘氨酸(Na-CBZ-GIn-Gly)底物溶液(配制方法：稱取lOOmg Na-CBZ-GIn-Gly溶于2mL的 0.2mol/L化OH溶液中，完全溶解后加入4mL的0.2M Tris-HCl(pH 6.0)緩沖液、2mL的0.1M 徑胺溶液和2mL的0.01M還原型谷脫甘膚溶液，并調節抑為6.0)，加入50μ1酶液，37°C水浴溫 度下反應lOmin，加入100μΙ TCA顯色液（由3M HC1、12%S氯乙酸、5%六水Ξ氯化鐵按照1: 1:1等體積混合而成)使反應終止，常溫離屯、（8,000g)5min后，取上清液置于酶標儀中波長 為525nm處讀取吸光度值(OD525 )，依據標準曲線計算出谷氨酷胺轉胺酶的比活力。W不添 加 Na-CBZ-GIn-Gly的底物溶液為對照。
[0037] 實驗結果：
[0038] 結果表明（表1)，粘蟲體內存在谷氨酷胺轉胺酶，且谷氨酷胺轉胺酶的總活性隨著 酶源樣品中蛋白含量的增加而逐漸增加，但谷氨酷胺轉胺酶的比活力較低，表明粘蟲體內 谷氨酷胺轉胺酶的含量較低。
[0039] 表1蟲體酶源樣品中谷氨酷胺轉胺酶的比活力
[0040]
[0041] 實施例2
[0042] 昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的硫酸錠沉淀分離
[0043] 實驗方法：
[0044] (1)將粘蟲勻漿液在冰浴條件下緩慢加入硫酸錠固體，分別至飽和度為25%、 35%、45 %、55%、65%、75%、85%，用玻璃棒攬拌均勻，待硫酸錠固體徹底溶解后繼續攬拌 30min，4 °C下靜置過夜后，離屯、（10，OOOg，4 °C) 30min，收集上清液和沉淀。
[0045] (2)將沉淀溶于20mM化is-HCl緩沖液(P冊.0)中，與上清液一樣分別轉移入透析 袋，置于4°C流動緩沖液中透析過夜，至l%BaCl溶液檢測確定透析液中沒有硫酸錠后停止 透析，取酶液進行冷凍干燥。
[0046] (3)測定谷氨酷胺轉胺酶的比活力。
[0047] 實驗結果：
[004引結果表明（圖1)，在硫酸錠溶液的飽和度達到55%，樣品的沉淀中谷氨酷胺轉胺酶 比活力達到最大，而樣品的上清液中谷氨酷胺轉胺酶比活力顯著降低，表明采用55%飽和 度的硫酸錠沉淀樣品中谷氨酷胺轉胺酶的效果最佳。
[0049] 實施例3
[0050] 昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的S邱hadex G-75葡聚糖凝膠分離 [0化1]實驗方法：
[0052] (1)取50g Sephadex G-75葡聚糖凝膠（分離范圍3,000-80,000)加入化去離子水 中，攬拌均勻后，室溫下靜置溶脹過夜，然后置于沸水中溶脹地，冷卻后備用。
[0053] (2)將溶脹好的凝膠一次性裝入層析柱（1.6X 100cm)內，加入3倍柱床體積的20mM 化is-肥1(抑8.0)緩沖液進行平衡。
[0054] (3)待平衡液與凝膠液面約1cm處時，取酶液進行上樣，待酶液全部進入膠面后，加 入20mM Tris-肥1 (pH 8.0)緩沖液進行洗脫，調節流速為0.5血/min，收集流出組分，測定各 組分在波長為280nm處的吸收值，
[0055] (4)測定各饋分樣品中谷氨酷胺轉胺酶的比活力。
[0056] ( 5)樣品進行聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)。采用12 %的分離膠（3.36m 1 d地2〇,2.5ml 1.5M Tris-肥l(p冊.8)，100μ1 10%SDS，4ml 30%聚丙締酷胺，2扣1 10%過 硫酸錠，1 化1 TEMED)和4%的濃縮膠（2.4ml d地2〇，1.0ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8)，40yl 10%505,0.53111130%聚丙締酷胺，1化110%過硫酸錠，1化1了6160)。濃縮膠電壓為80￥，分 離膠電壓為120V。采用0.1%考馬斯亮藍R250染色液對凝膠進行染色，采用脫色液(水：甲 醇:冰醋酸8:1:1)對染色后的凝膠進行脫色。
[0化7]實驗結果：
[005引結果表明，在Se地adex G-75凝膠層析中，谷氨酷胺轉胺酶活性集中在13-20號管 (圖2A)。在SDS-PA(iE圖譜中，谷氨酷胺轉胺酶的分子量約為63.31kDa，表明谷氨酷胺轉胺酶 蛋白在Se地adex G-75的分離范圍內，但是經S邱hadex G-75凝膠層析后，目的蛋白樣品中 仍含較多雜蛋白（圖2B)。
[0化9] 實施例4
[0060] 昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的S邱hadex G-100葡聚糖凝膠分離
[0061] 實驗方法：
[0062] (1)取50g Sephadex G-100葡聚糖凝膠(分離范圍4,000-150,000)加入化去離子 水中，攬拌均勻后，室溫下靜置溶脹過夜，然后置于沸水中溶脹地，冷卻后備用。
[0063] (2)將溶脹好的凝膠一次性裝入層析柱（1.6X 100cm)內，加入3倍柱床體積的20mM 化is-肥1(抑8.0)緩沖液進行平衡。
[0064] (3)待平衡液與凝膠液面約1cm處時，取酶液進行上樣，待酶液全部進入膠面后，加 入20mM Tris-肥1 (pH 8.0)緩沖液進行洗脫，調節流速為0.5血/min，收集流出組分，測定各 組分在波長為280nm處的吸收值，
[0065] (4)測定各饋分樣品中谷氨酷胺轉胺酶的比活力。
[0066] 實驗結果：
[0067] 結果表明（圖3)，在S邱hadex G-100凝膠層析中，谷氨酷胺轉胺酶活性集中在7-11 號管，表明谷氨酷胺轉胺酶蛋白在S邱hadex G-100的分離范圍內，且蛋白洗脫的峰形優于 Sephadex G-75洗脫峰。
[006引實施例5
[0069] PH7.8的Tris-HCl緩沖液進行谷氨酷胺轉胺酶的離子交換層析分離
[0070] 實驗方法：
[0071] (1)取30g DEAE-纖維素-52溶于化去離子水中，攬拌均勻后，室溫下靜置溶脹過 夜，抽濾去除去離子水，置于0.5M化0H溶液中浸泡30min，抽濾去除上層液，用去離子水洗 至中性。然后再置于0.5M肥1溶液中30min，抽濾并水洗至中性，最后再置于0.5M化0田容液 中浸泡30min，抽濾并水洗至中性。
[0072] (2)將溶脹好的DEAE-纖維素-52-次性裝入層析柱(3.9 X 20cm)內，加入3倍柱床 體積的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.8)進行平衡。
[0073] (3)待平衡液與凝膠液面約1cm處時，取酶液進行上樣，待酶液全部進入膠面后，用 含有0-1.0M化C1的20mM化is-HCl緩沖液(pH7.8)進行梯度洗脫，調節流速為0.5血/min， 收集流出組分，測定各組分在波長為280nm處的吸收值。
[0074] (4)測定各組分中谷氨酷胺轉胺酶的比活力。
[0075] (5)含有谷氨酷胺轉胺酶活性的樣品進行聚丙締酷胺凝膠電泳。
[0076] 實驗結果：
[0077] 結果表明，采用抑7.8的20mM化is-HCl洗脫液進行洗脫時，離子交換柱層析能檢 測到四個具有谷氨酷胺轉胺酶活性的且緊密相鄰的蛋白吸收峰，峰值界限不明顯（圖4A)。 聚丙締酷胺凝膠電泳圖譜顯示，運四個具有谷氨酷胺轉胺酶活性的蛋白樣品中仍存在較多 雜蛋白，且雜蛋白條帶與谷氨酷胺轉胺酶條帶距離較近(圖4B)。
[007引實施例6
[0079] P冊.5的Tris-HCl緩沖液進行谷氨酷胺轉胺酶的離子交換層析分離
[0080] 實驗方法：
[0081 ] (1)取30g DEAE-纖維素-52按照實施例5方法進行溶脹處理。
[0082] (2)將溶脹好的DEAE-纖維素-52-次性裝入層析柱(3.9 X 20cm)內，加入3倍柱床 體積的20mM Tris-HCl緩沖液(P冊.5)進行平衡。
[0083] (3)待平衡液與凝膠液面約1cm處時，取酶液進行上樣，待酶液全部進入膠面后，用 含有0-1.0M化C1的20mM化is-HCl緩沖液(P冊.5)進行梯度洗脫，調節流速為0.5血/min， 收集流出組分，測定各組分在波長為280nm處的吸收值。
[0084] (4)測定各組分中谷氨酷胺轉胺酶的比活力。
[0085] (5)含有谷氨酷胺轉胺酶活性的樣品進行聚丙締酷胺凝膠電泳。
[00化]實驗結果：
[0087] 結果表明，采用抑8.5的20mM化is-HCl洗脫液進行洗脫時，離子交換柱層析能檢 測到一個具有谷氨酷胺轉胺酶活性的蛋白吸收峰（圖5A)。聚丙締酷胺凝膠電泳圖譜顯示， 具有谷氨酷胺轉胺酶活性的蛋白樣品中，谷氨酷胺轉胺酶條帶與其他雜蛋白條帶距離較遠 (圖 5B)。
[0088] 實施例7(昆蟲谷氨酷胺轉胺酶的純化）
[0089] 方法1，具體包括如下步驟：
[0090] (1)按照實施例1方法制備粘蟲谷氨酷胺轉胺酶的酶源。
[0091] (2)采用55%飽和度的硫酸錠進行蛋白沉淀，初步目標蛋白，裝入透析袋中透析過 夜。
[0092] (3)采用S邱hadex G-lOO凝膠柱進行層析，每15mL洗脫液收集一管，
[0093] (4)采用DEAE-纖維素-52離子交換柱層析(D2.6 X 20cm)和抑8.5洗脫緩沖液
[0094] 實驗結果：
[00M]結果表明，經S邱adex G-100凝膠層析后，獲得初步分離的含谷氨酷胺轉胺酶活性 的目的蛋白樣品，谷氨酷胺轉胺酶蛋白被純化了5.683倍。該目的蛋白經濃縮后，經過DEAE- 纖維素-52離子交換層析，大部分蛋白未被吸附而被洗脫，谷氨酷胺轉胺酶蛋白被離子濃度 約為0.5M的NaCl洗脫液洗脫，收集的谷氨酷胺轉胺酶蛋白被純化了 48.36倍，最終回收率為 12.69%。在聚丙締酷胺凝膠電泳圖譜中，目的蛋白僅顯示一條清晰的谷氨酷胺轉胺酶蛋白 條帶，分子量約為63.WkDa(圖6)，達到了蛋白的N-端測序純度。缺點是蛋白的損失量較大， 目的蛋白的回收率較低。
[0096] 方法2,具體包括如下步驟：
[0097] (1)按照實施例1方法制備粘蟲谷氨酷胺轉胺酶的酶源。
[0098] (2)采用55%飽和度的硫酸錠進行蛋白沉淀，初步目標蛋白，裝入透析袋中透析過 夜。
[0099] (3)采用DEAE-纖維素-52離子交換柱進行層析，洗脫液為PH7.8的20mM化is-HCl (含0-1.0M NaCl)緩沖液。
[0100] (4)采用DEAE-纖維素-52離子交換柱進行層析，洗脫液為P冊.25的Tris-肥1(含0- 1.0M NaCl)緩沖液。
[0101] (5)采用S邱hadex G-100凝膠柱進行層析，收集目標蛋白。
[0102] 實驗結果：
[0103] 結果表明，在第一次離子交換柱層析中，經PH7.8的20mM Tris-HCl(含盡-1.0M的 NaCl)緩沖液洗脫，在0.3M~0.8M的化C1溶液的洗脫液條件下，含有谷氨酷胺轉胺酶活性的 蛋白被較大程度地解吸附洗脫，出現一個較大的蛋白吸收峰。該目的蛋白在第二次離子交 換柱層析中，經抑8.25的20mM化is-HCl(含0-1.0M化C1)緩沖液洗脫，含有谷氨酷胺轉胺 酶活性的蛋白被0.3M~0.6M的NaCl溶液的洗脫液解吸附洗脫。進一步通過S邱hadex G-100 凝膠柱進行層析，收集的谷氨酷胺轉胺酶蛋白被純化了 40.68倍，最終回收率為18.62%。但 是，在聚丙締酷胺凝膠電泳圖譜中，目的蛋白的分子量約為63.17,而分子量約為56.68的雜 蛋白沒有被去除。優缺點是目的蛋白的回收率高，但存在少量雜蛋白。
【主權項】
1. 一種分離純化昆蟲谷氨酰胺轉胺酶的方法，其包括如下步驟： (1) 制備昆蟲谷氨酰胺轉胺酶的步驟； (2) 采用硫酸銨，通過沉淀方式分離由步驟（1)所得的昆蟲谷氨酰胺轉胺酶，得到初步 目標蛋白的步驟;和， (3) 初步目標蛋白依次經葡萄糖凝膠柱和離子交換柱層析，得到目標蛋白的步驟;或， 初步目標蛋白依次經離子交換柱和葡萄糖凝膠柱層析，得到目標蛋白的步驟； 其中，所述昆蟲為鱗翅目、直翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅目或雙翅目害蟲，所述葡萄糖 凝膠柱分離范圍為3，000~150，000。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所用硫酸銨為55%飽和度的硫酸 銨。3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，初步目標蛋白先經兩次離子 交換柱層析，再經葡萄糖凝膠柱層析，得到目標蛋白。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所用葡萄糖凝膠柱為Sephadex G-100凝膠柱。5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所用離子交換柱為DEAE-纖維素 -52離子交換柱，所用洗脫液是:pH值為7.0~9.0、濃度為15mM~25mM的Tris-HCl緩沖液，且 在所述Tris-HCl緩沖液含有0~1.0M NaCl。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述pH值為7.8~8.5。7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述NaCl濃度為0.2M~0.8M。8. 如權利要求1~7中任意一項所述的方法，其特征在于，其中昆蟲谷氨酰胺轉胺酶由 包括如下步驟的制備方法制得： (1) 取大小均一的四齡粘蟲幼蟲若干頭，饑餓處理4小時后，用pH值為8.0、濃度為20mM 的Tris-HCl緩沖液清洗蟲體； (2) 將pH值為8.0、濃度為20mM的Tris-HCl緩沖液與經清洗蟲體，按體積比為3:1混合， 得混合物，在冰浴條件下，將所得混合物靜置至少30分鐘，充分勻漿，得勻漿液； (3) 將步驟(2)中所得勻漿液離心，取上清液進行冷凍干燥，收集干粉，用作谷氨酰胺轉 胺酶的酶源。
【文檔編號】C12N9/10GK106011099SQ201610458931
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】黃青春, 張蕾, 鄆新明, 饒文兵, 肖慈英, 楊超
【申請人】華東理工大學