水稻核糖核酸酶H大亞基A編碼基因OsRNaseH2 A及其用圖
【專利摘要】本發明屬于植物基因工程領域。具體的說，本發明涉及一種利用圖位克隆技術克隆水稻OsRNaseH2 A基因，以及利用轉基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因研究對水稻葉片形態、衰老調控及葉綠體發育的影響，可用于彩色稻觀賞，解決雜交稻育種過程中雜種的剔除問題，調控水稻葉片的衰老形態。
【專利說明】
水稻核糖核酸酶Η大亞基A編碼基因0sRNaseH2 A及其用途
技術領域
[0001] 本發明屬于植物基因工程領域。具體的說，本發明設及一種利用圖位克隆技術克 隆水稻OsRNas細2 A基因，W及利用轉基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還設及利用該 基因研究對水稻葉片形態、衰老調控及葉綠體發育的影響，可用于彩色稻觀賞，解決雜交稻 育種過程中雜種的剔除問題，調控水稻葉片的衰老形態。
【背景技術】
[0002] RNase Η能特異的水解RNA/DNA雜合雙鏈或DNA-RNA-DNA/DNA嵌合底物中的RNA，普 遍存在于各種原核生物、真核生物及病毒中。根據氨基酸序列及空間結構相似性，RNase Η 可被分為1型和2型，1型包括細菌的RNase Η I和真核生物的RNase HI; 2型包括細菌的 RNase Η II和RNase Η III、古細菌的RNase Η II及真核生物的RNase Η 2DRNase Η是一類 嚴格依賴金屬離子才有活性的酶，偏愛Mgh和Μη2+作為輔助因子，其他二價陽離子不能支持 其活性，兩個金屬離子一個在底物的援助下實施親和進攻并負責產物釋放;另一個參與憐 酸基團的轉移反應。從目前的研究來看，RNase Η在生物體的功能包括W下幾個方面:復制 過程中DNA滯后鏈中RNA引物的切除；切除錯誤滲入基因組DNA的單個核糖并維持基因組的 穩定性;轉錄功能等。2007年化kushima S等研究發現在枯草芽抱桿菌中RNase Η的缺失會 導致細胞生長速率緩慢，細胞表現出SOS應激反應及溫敏特性，運可能是由于DNA復制中滯 后鏈的RNA引物的切除受阻所致。酵母基因敲除實驗證明單獨敲除RNase H35對其生長影響 不大，只是在S期有所堆積，可能是細胞受到復制壓力的表型，而RNase H35和RAD27(核酸 酶)雙缺失則嚴重影響酵母的存活。Lazzaro F等進一步敲除了酵母中RNase Η的多個亞基， 證明RNase Η與復制后修復機制（PRR)相關，共同保護細胞的DNA免遭核糖核酸滲入，因此 RNase Η的存在對于維持基因組的穩定與完整具有重要生理意義。逆轉錄酶的RNase田舌性 對于逆轉錄過程是必需的，任何能將RNase Η失活的突變都會抑制逆轉錄，目前醫學上研究 最多的就是W艾滋病病毒化IV)的逆轉錄酶RNase Η為祀點設計HIV藥物，通過抑制RNase Η 的活性阻斷HIV病毒的復制。
[0003] 除了在病毒和微生物中的研究外，鑒于RNase Η功能的重要性，近年來哺乳動物中 的生理功能相關的報道也越來越多。人的RNase Η2發生突變會導致自身炎癥性遺傳疾病 (AGS)，與自身免疫性疾病"系統性紅斑狼瘡"有免疫相似性，是由于在細胞內累積了核酸進 而引發的免疫系統疾病。總體來說RNase Η對于細胞的生長，尤其是DNA的復制、修復等有重 要影響，缺失RNase聞尋使哺乳動物致病或死亡，但并不會使單細胞生物死亡。植物中關于 RNase Η的研究極少，直到2014年才首次在擬南芥中發現了RNase H2突變體。RNase H2缺陷 可回補WEE1蛋白激酶缺陷株的表型，提高基因組的同源重組率，但擬南芥的RNase H2突變 體與野生型比較，并沒有肉眼可見的表型，只有通過DNA合成抑制劑的處理才能顯現其影 響。到目前為止RNase Η在生物體內確切的生理功能仍不清楚，尤其是當生物體內同時含有 兩種不同的RNase邸寸，仍有諸多謎團待解，如二者如何分工?是共同合作還是互為替補?是 競爭還是合作？除了參與DNA復制、修復外，人們對腳ase H2所執行的生物學功能在植物生 理水平產生何種影響一無所知，其與植物葉片衰老、葉片形態及葉綠體發育的關系從未被 發現。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種與水稻葉片形態變異相關的蛋白質及其基 因，W及由此獲得的轉基因植物細胞，和利用所述基因對水稻葉片形態進行改造的方法。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種水稻核糖核酸酶Η大亞基A編碼基因 0sRNase肥A編碼的蛋白質，該蛋白質為SEQIDNo:3所示的氨基酸序列。
[0006] 作為本發明的水稻核糖核酸酶Η大亞基A編碼基因 OsRNase肥A編碼的蛋白質的改 進，氨基酸序列還包括在SEQ ID No:3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或 多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
[0007] 本發明還同時提供了一種編碼上述蛋白質的基因，該基因具有SEQ ID No:l、SEQ ID No :2所示的核巧酸序列。
[000引備注說明：SEQ ID N0:1為cDNA全長，SEQ ID ^:2為曲臟全長。
[0009] 作為本發明的基因的改進:所述核巧酸序列還包括在SEQ ID No:l、2所示的核巧 酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核巧酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
[0010] 本發明還同時提供了含有上述基因的質粒。
[0011] 本發明還同時提供了含有上述基因的植物表達載體。
[0012] 本發明還同時提供了一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述基因序列。細胞例如為 大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞。
[0013] 本發明還同時提供了上述基因的用途，其特征在于：用于構建轉基因水稻，所述轉 基因水稻的葉片顏色得W改良用于觀賞及高產品種的培育。
[0014] 本發明還同時提供了一種改良水稻葉片形態、影響葉綠素含量的方法:包括用具 有SEQ ID No: 1、2所示的核巧酸序列的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成 植株。
[0015] 進一步具體說明：本發明的目的是提供一種從水稻斑馬葉突變體中克隆的新基因 畑2，具有如56910齡：1和沈910齡：2所示的0魁序列，也包括與沈910齡：1和56910 No:2所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本發明中的SEQ ID No:3所示的蛋白質 屬于鐵硫蛋白，其中進行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括 在SEQ ID No:l和SEQ ID No:2中添加、取代、插入或缺失一個或多個核巧酸而生成的突變 體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發明的目的。
[0016] 本發明的另一個目的是提供一種用RH2基因進行高效的植物轉化的方法，具體地 說，本發明提供了具有SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2所示的序列的基因或基因部分片段的載 體，其中，如圖4所示的PCAMBIA1300-畑2,該載體可W表達有上述核巧酸序列編碼的多膚或 其同源類似物。
[0017] 本發明還提供了一種利用植物表達載體轉化植物細胞影響水稻葉片形態的方法。 具體地是利用植物表達載體轉化植物細胞W影響水稻葉片形態的方法。
[0018] 本發明可用于彩色稻觀賞（突變體具有明顯的斑馬葉表型，大量種植后白綠相間， 有一定的觀賞價值，根據不同景觀設計可W產生多種植物景觀），解決雜交稻育種過程中雜 種的剔除問題，調控水稻葉片的衰老形態。
[0019] 實現本發明的具體技術步驟如下：
[0020] -、水稻斑馬葉突變體的表型觀察和遺傳分析：
[0021 ] 本發明的水稻斑馬葉突變體;rh2來自日本晴EMS化thyl Methyl Sulfonate)誘變 產生的突變（圖lA，B)jh2通過與野生型水稻的反交實驗，證明該突變體受隱性單基因控 審IJ。光照強度實驗結果表明突變體的斑馬表型受高光強誘導（圖1C)。進一步觀察發現突 變體斑馬性狀主要是由于葉片部分區段葉片早衰造成葉綠體降解和葉片內卷(圖1D，F)。二 氨基聯苯胺(DAB)染色結果也表明突變體斑馬區段的細胞中有大量的過氧化氨積累（圖 1E)，說明突變體目的基因的突變造成細胞中超氧化物的大量積累從而啟動了細胞的衰老。
[0022] 二、圖位克隆控制水稻斑馬葉性狀的RH2基因：
[0023] 1)、畑2基因的初步定位：
[0024] 為了分離RH2基因，本發明首先組建了一個定位群體，由rh2與釉稻品種TN1 (Indica)雜交組配成F2定位群體，再通過圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子標記對RH2 位點進行初步定位，將其初步定位在第11染色體的長臂端，并介于RM286和B11-5兩標記之 間，見圖2。
[0025] 2)、畑2基因的精細定位與預測：
[00%] 通過對RM286和B11-5兩個標記之間的BAC序列分析，發展新的SSR、STS標記將RH2 精確定位于BAC 0SJNBb0030I09上ZY12711-20與ZY12711-21標記之間60-kb范圍之內（圖 3)，通過分析此區段開放閱讀框(OR巧推測候選基因。
[0027] 3)、畑2基因的鑒定和功能分析：
[00%]為了驗證候選基因功能，構建了如圖4所示的互補載體，通過轉基因技術，將互補 載體轉入到突變體rh2中，結果表明本發明獲得了使突變體恢復正常表型的轉基因水稻(圖 5)，證明本發明正確克隆了 RH2基因，氨基酸序列分析表明RH2編碼核糖核酸酶Η大亞基A (0sRNaseH2 A)。此外，由于該基因被預測與DNA合成相關，我們還構建了如圖6所示亞細胞 定位載體，通過水稻原生質體轉化技術證明0sRNaseH2 A蛋白在細胞中定位于細胞核。
[0029] 本發明利用水稻斑馬葉突變體rh2,通過圖位克隆技術首次在水稻中克隆到了 0sRNaseH2 A基因，該基因編碼核糖核酸酶Η大亞基A，在水稻中影響葉片形態、葉綠體的降 解及光合效率。通過對OsR化seH2 A基因的功能解讀，不僅豐富了葉片形態、葉綠體發育及 光合效率的分子調控機制，對于闡明DNA復制與葉片形態、葉綠體發育的作用關系也具有重 要理論意義。
[0030] 葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，廣泛分布在葉片綠色組織細胞中。斑馬 葉突變典型特征是葉綠體發育異常，大部分斑馬葉突變體白色部分缺乏葉綠素，植物斑馬 葉突變產生機制非常復雜，設及光合電子傳遞、核-質基因組互作、質體基因及基因與環境 的互作等過程，目前對斑馬葉的分子機理研究還僅停留在葉綠素代謝的層面，更為復雜的 調控模式還不清楚。本發明獲得的斑馬葉突變體，是眾多斑馬葉突變體中較為特殊的一類， 其相關基因編碼蛋白可能是通過影響高光強引起的DNA損傷修復，進而對葉片形態、葉綠體 的降解和光合效率產生影響。通過圖位克隆技術本發明首次在水稻中克隆了相關基因 0sRNaseH2 A，該基因編碼核糖核酸酶Η大亞基A，在水稻中影響葉片形態、葉綠體的降解及 光合效率。通過對0sRNaseH2 A基因的功能解讀，將為深入研究葉片形態調控、葉綠體發育 機制，闡明植物高光強引起的DM損傷修復與葉片形態調控、葉綠體降解的關系，進而為水 稻高光合育種奠定基礎。
[0031] 本發明的有益效果主要體現在：
[0032] 光合色素載體一一葉綠體是進行光合作用的重要場所，廣泛分布在葉片綠色組織 細胞中，與此同時所有體內、體外逆境對植物造成的傷害都會首先對葉綠體的發育造成影 響，最快速、直接的反應植物的生理狀態。本發明利用水稻斑馬葉突變體zb3,通過圖位克隆 技術首次在水稻中克隆到了0sRNaseH2 A基因，該基因編碼核糖核酸酶Η大亞基A，在水稻中 影響葉片形態及葉綠體的降解。通過對0sRNaseH2 A基因的功能解讀，進一步明確了 0sRNaseH2 A對水稻葉片形態、葉綠體降解及光合效率的影響，同時為深入掲示高光強引起 的DNA損傷修復與葉片形態及葉綠體降解的關系奠定基礎。
【附圖說明】
[0033] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0034] 圖1為水稻斑馬葉突變體與野生型WT苗期、分葉期表型及DAB染色結果；
[0035] A:水稻斑馬葉突變體與野生型WT苗期表型；
[0036] B:水稻斑馬葉突變體與野生型WT分葉期表型；
[0037] C:不同光照強度條件下野生型WT與突變體的表型；
[0038] D:水稻斑馬葉突變體與野生型WT葉片特寫；
[0039] E:突變體斑馬部位及野生型WT葉片二氨基聯苯胺(DAB)染色；
[0040] F:突變體斑馬部位及野生型WT葉片縱切面。
[0041 ]圖2為OsRNase肥A基因（畑2基因）在水稻第11染色體上的初步定位圖。
[0042] 圖3為OsRNase肥A基因（R肥基因）的精細定位及突變位點示意圖；
[0043] (A)代表OsRNase肥A基因在水稻第11染色體上的精細定位圖；
[0044] (B)代表OsRNase肥A基因定位區間候選基因預測圖；
[0045] (C)代表0sRNaseH2 A基因定位區間目的基因結構分析及突變位點測序；
[0046] (D)代表0sRNaseH2 A基因序列及蛋白編碼序列在突變體和野生型間的差異比較。
[0047] 圖4為互補載體PCAMBIA1300-R肥圖譜。
[0048] 圖5為功能互補實驗TO轉基因水稻植株表型及測序驗證；
[0049] A:從左到右依次為野生型(WT)、突變體、及轉互補載體的突變體轉基因回復單 株；
[0050] 野生型(WT)、突變體、及轉互補載體的突變體轉基因回復單株葉片的特寫；
[0051] B:轉互補載體的rh2突變體轉基因回復單株測序驗證，箭頭所指為突變位點。
[0052] 圖6為0sRNaseH2 A亞細胞定位載體的構建及原生質體轉化結果；
[0化3] A:OsRNase肥A與GFP融合表達載體示意圖；
[0054] B:巧光共聚焦顯微鏡觀察轉化OsR化seH2 A亞細胞定位載體的水稻原生質體，結 果表明OsRNase肥A定位于細胞核中。
[0055] 圖7為突變體不同表型部位與對照日本晴光合色素含量測定。
[0056] 圖8為透射電鏡分析突變體RNaseH2 A(rh2)與對照日本晴葉綠體形態的變化；
[0057] 上圖為野生型不同放大倍數條件下葉肉細胞中葉綠體形態；
[0058] 中圖為突變體綠色部分不同放大倍數條件下葉肉細胞中葉綠體形態；
[0059] 下圖為突變體白色部分不同放大倍數條件下葉肉細胞中葉綠體形態。
【具體實施方式】
[0060] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此。
[0061] 實施例1、
[0062] 1、水稻材料：
[0063] 水稻(0巧za sativa L.)突變體原始野生材料為梗稻品種"日本晴"。
[0064] 水稻斑馬葉突變體來自日本晴EMS化thyl Methyl Sulfonate)誘變產生的突 變(如圖1所示），該突變體是在中國浙江省境內獲得。
[00化]光強實驗：
[0066] 挑選飽滿的野生型和突變體種子各50粒，30°C避光浸種48小時，漸干水分30°C避 光催芽48小時，挑選發芽整齊，胚芽健壯的種子播種在鋪有營養±的容器中，把已發芽的突 變體和日本晴的種子分為兩組，分別種植在光強為25化mol photons m-2s-l和90化mol photons m-2s-l的光照培養箱中（Snijders，MD1400)，溫度均為晝/夜28°C/24°C，光照時長 1地，觀察并記錄葉片表型，用于鑒定突變體的光強敏感性。
[0067] DAB染色：
[006引染色液配方為：Img/ml的二氨基聯苯胺（diaminobenzine ,DAB,Sigma)水溶液，pH 調節至3.8。
[0069] 具體染色步驟為：將野生型和rh2苗期葉片輕輕加入染色液中，25°C光照下染色 她;除去染色液，加入95 %的乙醇，脫色12h-24h;水懸浮，鏡檢，拍照。
[0070] rh2通過與野生型品種（即，釉稻品種TN1)的反交實驗，證明該突變體受隱性單基 因控制。實驗的結果為：在M2代群體中隨機選擇85個單株進行遺傳分析，66株為野生型表 型，19株為突變型表型，卡平方檢測結果U2 = 0.29分2 0.05 = 3.84)，分離比符合3:1，說明 該突變表型由單隱性核基因控制。W釉稻品種TN1為父本，rh2為母本進行反交所得的F1代 植株全部表現為正常表型，F2代種子播種四周后，隨機選380個單株其中281株表現為野生 型表型，99株表現為突變型表型。卡平方檢測結果U2 = 0.22分2 0.05 = 3.84)，正常植株表 型和突變體植株表型分離比符合3:1;進一步證明該突變表型受隱性單隱性核基因控制。
[0071] 2、分析和定位群體：
[0072] 純合的rh2突變體和野生型品種釉稻品種TN1進行雜交，Fi代自交，得到F2群體。并 從中選出1273株斑馬葉rh2突變個體作為定位群體。在Ξ葉期期每株取1克左右的嫩葉，用 來提取總DNA。
[0073] 3、SSR和STS標記定位OsRNase肥A基因
[0074] 采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。 取大約0.2g水稻葉片，經液氮冷凍，在直徑5cm的小研鉢中磨成粉狀，轉移到1.5ml離屯、管里 提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于15化1超純水中。每一個PCR反應用化1 DNA樣品。
[00巧]OsR化seH2 A基因的初步定位：在RNaseH2 A與TN1組合的F2群體中選取30個隱性 個體，根據公布的梗稻和釉稻創建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的 SSR引物，根據已知的反應條件進行PCR擴增，經5%瓊脂糖凝膠電泳分離和漠化乙晚化B)染 色，檢測PCR產物的多態性，將OsRNase肥A初步定位在第3號染色體長臂端RM286和B11-5兩 STS標記之間（如圖2所示）。
[0076] 0sRNaseH2 A基因的精細定位:選取與TN1組合的F2群體中共1273株隱性個體， 在初定位的基礎上進一步設計SSR和STS標記，最終將0sRNaseH2 A精確定位于BAC號為 0SJNBb0030I09上60-kb范圍之內（圖3A)，兩邊的分子標記為ZY12711-20與ZY12711-21引物 序列為：
[0077] ZY12711-20：F：CACAGGGACTACAGTTAAGTC,R：AGTCTTTTCCATACGCCTTAC；
[007引 ZY12711-21: F: AGTACAGTTCACCGAGTAAGT，R: TGATAAGCTCAATAACAATTG;上文中設及 的0sRNaseH2 A基因的定位標記序列具體如表1所示。
[0079] 表UOsRNase肥A基因的定位標記序列
[0080]
[0082] 4、基因預測和比較分析：
[0083] 根據精細定位的結果，在6〇-kb范圍內根據Rice Automated Annotation System 化ttp: //RiceGAAS. dna. af打c. go. jp)的預測，發現在此區間內共有17個候選基因（圖3B)。 根據兩標記剩余的重組個體數，我們設計了各基因的測序引物，采用PCR方法分別從rh2和 野生型品種基因組中擴增出候選基因進行測序分析。發現rh2突變體在L0C_0sllg05570的 第3個外顯子發生1個堿基的替換突變，由C突變為Τ，使對應的氨基酸由丙氨酸突變為鄉氨 酸（圖3C，D)。將此用不同的突變單株及群體中突變表型的單株，各重復驗證Ξ次，突變位點 穩定存在(測序引物序列見表2)。根據BAC克隆0SJNBb0030I09序列的基因注釋信息(NCBI)， 預測此基因編碼pWative r;Lbonuclease H21arge subunit(OsRNase肥 A)，該基因編碼區 全長2532bp，包含8個外顯子和7個內含子，水稻中的OsRNaseH2 A基因與擬南芥中編碼 RNASE肥A蛋白的基因有69%的同源率。
[0084] 該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表的SEQ ID No:3所示。該基因的cDNA 全長如SEQ ID NO: 1所示，曲ΝΑ全長如SEQ ID NO:2所示。
[0085] 表2、0SRNA沈肥A基因的測序引物序列
[0086]
[0087] 實施例2、
[0088] 植物轉化：
[0089] W梗稻品種"日本晴"基因組為模板，根據目的基因設計引物F-5'- AAAGGTACCTAATCTACACCAGAGCCACCAACGC-3 ' 和R-5 '-AAAGTCGACTGATCCTGTACCGCTATTACAATT TACTCA-3'，PCR擴增體系為：50化的PCR反應體系：模板DNA 2^;2ΧΡ〔Κ buffer 2扣1^; 2mmol dNTP(^R) 10μΙ；Κ00ΡΧ(Τ0Υ0Β0)||?μΙ； ΙΟμΜ PrimerF 3μΙ；10μΜ PrimerR 3μΙ； d地2〇 eiiMPCR擴增條件為：94°C預變性2min;98°C變性 1〇3,60°(：退火3〇3,68°(：延伸8111111; 共35個循環;68°C下延伸10min，15°C保溫。PCR擴增后進行電泳分離，回收得到6062bp的DNA 片段，用Κρη巧日Sal I酶切pCAMBIA1300(pl300)后連接，獲得了互補載體PCAMBIA1300- OsRNas細2 A，該克隆覆蓋了整個0RF的基因組區域（即包含了SEQ ID No:2所示的核巧酸序 列），還包括ATG上游2424-bp啟動子序列和TGA下游1106-bp終止子序列（如圖4所示）。運個 質粒通過電擊的方法轉入農桿菌(Agrobacterium 1:umefaciens)株系EHA105中轉化水稻。 我們利用突變體成熟種子誘導愈傷組織，經過誘導培養基培養3周后，挑選生長旺盛愈傷用 作轉化的受體。用含有雙元質粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25Γ條件下共培 養3天后，在含有300mg/L潮霉素的篩選培養基上培養。篩選抗性愈傷在含有250mg/L潮霉素 預分化培養基上培養10天左右。將預分化的愈傷轉至分化培養基上在光照條件下培養。一 個月左右得到抗性轉基因植株。對植株進行鑒定和連續的觀察發現，與同時期的突變體比 較，轉基因植株葉色恢復為正常綠色，與轉入空載P1300的日本晴表型一致。
[0090] 通過上述轉基因技術，結果表明：本發明獲得了使突變體恢復正常表型的轉基因 水稻（圖5)。
[0091] 說明：上文中所設及的各種培養基的配方可參考Toki S.，Hara Ν.,Οηο K.， Onodera Η.,Tagiri A.,Oka S.,Tanaka H.(2006)Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The Plant Journal 47:969-976。
[0092] 實施例3、
[0093] 水稻原生質體的轉化及0sRNaseH2 A綠色巧光融合蛋白的定位觀察：
[0094] 將RNA沈肥A基因 cDNA序列克隆至PCAMBIA1301-S65T中構建GFP融合載體（圖6A)
[00M] (1)生長15天左右的水稻幼苗用鋒利的刀片在塑料培養皿板上切碎幼苗莖葉，移 至Ij200ml洗凈的錐形瓶中（一般20ml酶解液每次60株左右;預先將酶解液倒入瓶中，根據瓶 底大小合理分配酶解液），每瓶不宜裝太多。放入28 °C搖床，60-80巧m，4-6小時。
[0096] (2)在酶解時間完成之前，配置PEG4000 40%溶液，置于65°C水浴鍋中或室溫溶 解，65°C溶解，中間取出來振蕩一次。
[0097] (3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入約15ml左右的W5。用300目（或400目）的 鋼制濾網將碎葉片過濾掉，用干凈的塑料培養皿收集酶解后的原生質體。然后將原生質體 緩慢倒入（或用去槍尖的槍頭吸取）50ml離屯、管中，天平稱重平衡后，放入水平離屯、機， 150g，5min，充分收集原生質體，離屯、完成后，緩慢吸走上清。
[0098] (4)向原生質體沉淀中加入1ml W5溶液，緩慢輕輕傾斜混勻重懸，然后用去槍尖的 槍頭吸移到2ml離屯、管中。此時50ml離屯、管中可能還有少量未重懸的原生質體，可再加入 1ml W5溶解，吸移到之前的2ml離屯、管中，150g，3min，移除上清液。
[0099] (5)用MMG重懸，具體加多少根據原生質體的量和要轉的質粒個數來定，一般最后 每個質粒中加入lOOul稀釋的原生質體。或者用顯微鏡稍微觀察下產量和酶解后完整個體 的數目比例，然后根據原生質體的狀態來確定MMG用量。
[0100] (6)準備轉化用質粒10-1加 g左右或lOul，于2ml離屯、管中。
[0101] (7)加入lOOul的重懸好的原生質體，然后加入PEG 40%110ul，混勻。
[0102] (8)28 度避光靜置 15min。
[0103] (9)加入足量的W5稀釋，混勻，然后離屯、150g，3min，緩慢移除上清，再用W5洗一次 (中間會有損失，但不影響結果）。最后得到的沉淀，用W5重懸（用2ml的管子裝滿），輕輕混 勻，移到細胞培養板中。用錫錐紙包裹，避光28度靜置培養，14小時。
[0104] (10)培養時間完成后，將培養板各孔中沉淀的原生質體輕輕混勻，吸移到2ml管 中，然后離屯、150g，3min，去除上清，保留lOOul左右上清液，重懸原生質體。
[0105] (11)共聚焦顯微鏡觀察拍照。
[0106] 結果顯示陽性對照在細胞各個部位均有表達，說明實驗的表達系統工作正常， 0sRNaseH2 AGFP融合蛋白特異的在細胞核中表達，其他部位未見表達，說明0sRNaseH2 A是 定位于細胞核中的蛋白（圖6B)。
[0107] 說明：上文中所設及的各種溶液的配方可參考Zhang et曰1.A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light chloroplast-related processes.Plant Methods 2011,7:30。
[010引實施例4、
[0109] 光合色素含量測定：
[0110] 由于rh2突變體表型與溫度沒有明顯的相關性，因此我們在大田取樣，分別測定苗 期突變體白色部分(rii2wMte)和綠色部分(rii2green)及對照葉片(NIP)葉綠素含量，同時 測定光合效率。分別取突變體和野生型即十期葉片去掉主脈，剪成1cm左右的片段，稱取0.2g 浸泡于10ml 80 %丙酬，26°C條件下暗培養48小時。取溶液在紫外分光光度計（DU800, 邸CKMAN C0ULT邸)663皿、645皿和470皿Ξ種波長下測定葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿h素的光 密度值。3次重復，然后根據Amon(1949)的方法計算出各檢測葉片中的葉綠素 a(化1 a)、葉 綠素 b (化1 b)的含量，按照WeUbu;rn(1994)計算類胡蘿h素(化r)的含量，計算公式如下：
[0111] chi a=(12.7X0D663-2.69X0D645)XV/W
[0112] chi b = (22.9 X0〇645-4.68 XODees) X V/W
[0113] car=(1000XOD47〇XV/W_3.27XChl a_104XChl b)/198
[0114] 其中：V為提取液體積（10ml)，W為葉片質量0.2g，0D663、0D645及0D47Q為在分光光度 儀上讀取的光密度值，單位:mg/g。
[0115] 結果顯示，與野生型相比，突變體綠色部分葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿h素及化1 a/ 化化的值均無明顯變化，但白色部分葉綠素 a、葉綠素 b及類胡蘿h素含量均大幅下降，但化1 a/b的比值與野生型差別不大（圖7)。運一結果說明，突變體白色部分的表型變化是由于葉 綠素和類胡蘿l·素缺失引起。
[0116] 實施例5、
[0117] 葉綠體透射電鏡的制備和觀察：
[0118] (1)樣品：取突變體苗期葉片和對照野生型苗期葉片，切成0.5~lmm3左右的小塊；
[0119] (2)固定:將切好的樣品塊放入2ml離屯、管中，加入2.5%的戊二醒溶液(PH=7.2)， 在抽真空儀器中抽真空直到葉片完全下沉。0.1M憐酸漂洗Ξ次，每15min-次，然后加入1% 餓酸固定2~3小時，直至樣品變黑；
[0120] (3)脫水:先用50 %、70 %、和90 %的乙醇溶液依次脫水，每個濃度處理20分鐘，再 用乙醇和丙酬（1:1)溶液處理20分鐘，W上均在4度冰箱內進行，最后將樣品用純丙酬室溫 處理20分鐘；
[0121] (4)滲透:將樣品在無水丙酬和包埋劑(3:1)混合液中作用4小時，再在無水丙酬和 包埋劑（1:1)混合液處理3小時，最后在純的包埋劑中作用12小時；
[0122] (5)包埋:將上述步驟中的樣品挑的包埋盒內，37 °C過夜，45 °C處理12小時最后60 °C處理24小時，獲得包埋樣品；
[0123] (6)切片、拍照:將包埋樣品用超薄切片機切成60-70皿左右的超薄片，然后將切片 用巧樣酸鉛溶液染色10分鐘，再有醋酸軸溶液染色30分鐘，雙蒸水清洗Ξ次后驚干，用 化化chi H-7650型透射電鏡觀察并且選擇清晰地倍數拍照。
[0124] 結果顯示野生型葉片的葉肉細胞中葉綠體數目較多，葉綠體結構完整，葉綠體中 基粒片層層次豐富，排列緊密。突變體葉片綠色部分相比野生型葉綠體結構和數量并無明 顯變化，但突變體白色部分相比野生型葉綠體數量明顯減少、葉綠體內部無明顯的基粒結 構（圖8)。觀察結果表明目的基因的突變造成了突變體白色部分中葉綠體結構發育缺陷。
[0125] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 水稻DNA復制相關基因 OsRNase H2A編碼的蛋白質，其特征在于：該蛋白質具有SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。2. 根據權利要求1所述的水稻DNA復制相關基因 OsRNase H2A編碼的蛋白質，其特征在 于:所述氨基酸序列還包括在SEQ ID N〇:3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一 個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。3. 編碼權利要求1或2所述蛋白質的基因，其特征在于：該基因具有SEQ ID N〇:l、SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。4. 根據權利要求3所述的基因，其特征在于:所述核苷酸序列還包括在SEQ. ID. No: 1和2 所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因 或衍生物。5. -種含有權利要求3或4所述基因的質粒。6. -種含有權利要求3或4所述基因的植物表達載體。7. -種宿主細胞，其特征在于:該宿主細胞含有權利要求3或4所述的基因序列。8. 根據權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于：該細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞 或植物細胞。9. 如權利要求3或4所述基因的用途，其特征在于：改良水稻葉片形態、顏色；提高光合 效率。10. -種改良水稻葉片形態、影響葉綠素含量的方法的方法，其特征在于:包括用具有 SEQ ID No: 1和2所示的核苷酸序列的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植 株。
【文檔編號】A01H5/00GK106011105SQ201610524845
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】朱麗, 錢前, 邱振楠, 王小琦, 赫磊, 張森, 曾大力, 張光恒, 胡江, 郭龍彪, 董國軍, 任德勇, 高振宇
【申請人】中國水稻研究所