一種在家蠶絲腺中表達重組i型類人膠原蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開一種在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，利用家蠶后部絲腺生產具有廣泛用途和經濟價值的Ⅰ型類人膠原蛋白。該方法獲得的重組I型類人膠原蛋白能夠在家蠶絲腺中穩定表達，并在后代延續。
【專利說明】
一種在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域和家蠶領域，特別涉及基因工程領域，通過基因重組的辦法在家蠶絲腺中獲得了重組I型類人膠原蛋白表達。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是哺乳動物結締組織關鍵的結構蛋白質，對維護細胞、組織及器官的正常生理功能有著重要作用。膠原蛋白憑借其強度和穩定性，以及與活體組織的兼容性，作為生物材料被廣泛應用于多種醫療領域和美容保健等方面。纖維狀膠原蛋白主要分為I，II，ΙΙΙ，ν，ΧΙ五類，不同類型膠原蛋白在組織細胞及生理功能等有明顯差異。I型膠原蛋白是最主要和最先被鑒定的纖維狀膠原蛋白，是結締組織與骨骼的主要蛋白質，對于維持細胞的完整性及傳遞細胞外信號起重要作用。
[0003]目前，膠原蛋白的主要來源是動物皮膚，而這種來源含有高致病風險，同時也可能會引起過敏性反應。隨著對膠原蛋白需求的日益增加，原先從屠宰動物體的皮革、骨骼中提取膠原的方式已經不能滿足日益增長的膠原蛋白的需求，而且還可能有致病之虞。因此，急需要一種能夠代替此來源，并大量生產膠原蛋白的新方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的不足，公開一種在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，利用家蠶后部絲腺生產具有廣泛用途和經濟價值的I型類人膠原蛋白。該方法獲得的重組I型類人膠原蛋白能夠在家蠶絲腺中穩定表達，并在后代延續。
本發明的技術方案如下:
一種在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，包括:
1)構建轉基因載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP;
2)將轉基因質粒pBFL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射將轉基因質粒注射入產后2?5 h以內的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射10?15 nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化；
3)G1代的幼蟲或蛹置于體視熒光顯微鏡下篩選陽性個體，5齡4天幼蟲使用小動物活體成像系統確認幼蟲陽性EGFP熒光。
[0005]優選的，構建轉基因載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP包括:
1)擴增克隆HCool-1cDNA；
2)構建pMD-FL-HCoo1-1 -pA載體；
3)構建pBFLHCool-1- A3EGFP載體；
4)構建pMD-FL-BmP4Ha-pA 載體；
5)構建目標載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP。
[0006]優選的，況oo>I cDNA序列如序列I所示； 同樣優選的，1W-1 cDNA序列翻譯的蛋白序列如序列2所示；
更為優選的，-L啟動子序列如序列3所示；
再優選的，郝a cDNA序列如序列4所示；
本發明還包括一個優選的技術方案，經顯微注射后的蠶卵在培養箱中培育孵化條件為25 °C、90% 濕度。
[0007]更進一步的，G1代幼蟲由所述的顯微注射后的蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化，經約Ild左右孵化，孵化出的幼蟲GO代用桑葉飼養至結繭，羽化后與正常的蠶蛾交配，由雌蛾產生Gl代蠶卵，單獨孵化為Gl代幼蟲。
[0008]本發明方法與現有技術相比，具有以下有益效果:通過將VCooJ-1cDNA和家蠶脯氨酰4-羥化酶α-亞基cDNA同時轉入早期胚胎并通過絲素輕鏈(ΛΚ)啟動子在后部絲腺表達，獲得具有完整生物學功能的I型類人膠原蛋白，并揭示在家蠶中穩定遺傳表達I型類人膠原蛋白的方法。
【附圖說明】
[0009]圖1:顯微注射不意圖；
圖2:1型類人膠原蛋白轉基因家蠶陽性個體EGFP標記的熒光檢測圖，其中A圖是在體視顯微鏡下對照圖，檢測無熒光;B圖為顯微注射后的幼蟲在體視顯微鏡下存在熒光現象;C圖為5齡4天幼蟲在小動物活體成像系統的熒光現象，其中C圖左側兩條家蠶幼蟲為對照，右側兩條家蠶幼蟲是經過顯微注射轉基因質粒的蠶卵經培養的幼蟲，能明顯觀察到綠色熒光現象，確認幼蟲陽性EGFP熒光。
【具體實施方式】
[0010]本發明家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，包括:
1)構建轉基因載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP;
2)將轉基因質粒pBFL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射將轉基因質粒注射入產后2?5 h以內的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射10?15 nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化；
3)G1代的幼蟲或蛹置于體視熒光顯微鏡下篩選陽性個體，5齡4天幼蟲使用小動物活體成像系統確認幼蟲陽性EGFP熒光。
[0011]為了更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下:
實施例一:轉基因載體pBFLHCoo 1-1 -FLBmP4Ha-A3EGFP的構建
I.擴增及克隆見OOhI cDNA:1型類人膠原蛋白(HCool-1)cDNA的人工設計與RT-PCR擴增參考人類I型膠原蛋白基因序列(GenBank Access1n N0.Z74615)及能促進細胞信號傳導、基質金屬蛋白酶的生成和細胞膠原蛋白相互作用等發揮重要生理功能的特征序列，設計引物:HCool-1-V: 5 ’ -CCCCCGGGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGG-3 ’，HCool-1- R: 5 ’ -CGGGGTACCCTAGCGTTCACCTGGTAGGCCAAC-3’，(分別設計I和I限制性內切酶位點)；以I型類人膠原蛋白(HCool-1)cDNA克隆作為RT-PCR擴增模板，擴增見片段，回收目的片段并與PMD-20T載體連接，篩選出陽性克隆并測序，DNAStar 5.0分析軟件分析測序結果，確證擴增序列。家蠶脯氨酰4-羥化酶α-亞基如cDNA的擴增參考家蠶(GenBankAccess1n N0.AY099068)設計弓I 物尸4"a-F:5’_CCCATATGATGGAAACAGTAAGAGCGATAGCT-3，B m P 4 Ha - R: 5 ’ -
限制性內切酶位點)；
回收目的片段并與PMD-20T載體連接，篩選出陽性克隆并測序，DNAStar 5.0分析軟件分析測序結果，經序列比對分析，確證擴增序列，詳見序列1，該序列與I型類人膠原蛋白(HCool-1)cDNA并不完全一樣，其區別在于截取I型類人膠原蛋白(HC001-1)cDNA部分效應cDNA，使其使用與家蠶絲腺后部表達，其表達蛋白的氨基酸序列如序列2所示，其中GPQGIAGQRGVVGLP(P，Hyp)序列具有促進細胞信號傳導、基質金屬蛋白酶的生成，具有高度活躍的成纖維細胞結合性等功能，GER三肽序列具有參與細胞附著、血小板聚集，GER對于血管生成也是必須的。
[0012]2.構建pMD-FL-HCool-1-pA載體:將已克隆到pMD-20T載體的#Coo>I cDNA用
I和命/3 I雙切酶，回收片段連接到通過同樣酶切的含/iA-L啟動子序列和polyA加尾信號序列的中間載體pMD-FL-pA中，構建成pMD-FL-HCool-1-pA載體，含/if L啟動子序列如序列3所示，該序列為家蠶后部絲腺表達重組I型類人膠原蛋白基因5 ’端調控序列；
3.構建pB FLHCool-1- A3EGFP載體:將pMD-FL-HCool-1-pA載體用及?oRI和份/κΙΙΠ雙切酶，回收含/M-L啟動子和polyA序列的優bW-1片段，連接到通過同樣酶切的pBA3EGFP載體，構建成PB FLHCool-1- A3EGFP載體。
[0013]4.構建pMD-FL-BmP4Ha-pA載體:用M/eMPfe mH I 雙切酶已含有他 P4Ha cDNA克隆的PMD-20T載體，回收片段連接到通過同樣酶切的中間載體pMD-FL-pA中，構建成pMD-FL-BmP4Ha-pA載體，他cDNA序列如序列4所示，該序列為家蠶后部絲腺表達重組I型類人膠原蛋白基因3’端調控序列；
5.構建目標載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP:將pMD-FL_BmP4Ha-pA載體用Sa cl和雙切酶，回收含/?/7-L啟動子和polyA序列的BmP4Ha片段，連接到通過同樣酶切的pBFLHCool-1-A3EGFP載體，構建成目標pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP載體。
[0014]實施例二:產后2h家蠶蠶卵顯微注射，劑量1nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分別抽提轉基因載體和輔助質粒pHA3PIG質粒DNA，其原理是做ggyfec轉座子介導的家蠶早期胚胎顯微注射法(Tamura，2000年)，能獲得穩定遺傳的轉基因家蠶。本發明根據特有的轉基因質粒PB FL-HCoo 1-1 -pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP，將轉基因質粒pB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為I: I，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射的方法注射入產后2h的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射10nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，以防止細菌和真菌感染。經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化。
[0015]實施例三:產后2h家蠶蠶卵顯微注射，劑量15nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分別抽提轉基因載體和輔助質粒pHA3PIG質粒DNA，具體是將轉基因質粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射的方法注射入產后2h的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射15 nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，以防止細菌和真菌感染。經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化。
[0016]實施例四:產后3h家蠶蠶卵顯微注射，劑量1nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分別抽提轉基因載體和輔助質粒pHA3PIG質粒DNA，具體是將轉基因質粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射的方法注射入產后3h的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射10nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，以防止細菌和真菌感染。經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化。
[0017]實施例五:產后3h家蠶蠶卵顯微注射，劑量15nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分別抽提轉基因載體和輔助質粒pHA3PIG質粒DNA，具體是將轉基因質粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射的方法注射入產后3h的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射15nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，以防止細菌和真菌感染。經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化。
[0018]實施例六:產后5h家蠶蠶卵顯微注射，劑量1nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分別抽提轉基因載體和輔助質粒pHA3PIG質粒DNA，具體是將轉基因質粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射的方法注射入產后5h的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射10nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，以防止細菌和真菌感染。經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化。
[0019]實施例七:產后5h家蠶蠶卵顯微注射，劑量15nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分別抽提轉基因載體和輔助質粒pHA3PIG質粒DNA，具體是將轉基因質粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為1:1，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射的方法注射入產后5h的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射15nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，以防止細菌和真菌感染。經甲醛蒸氣再次消毒后，蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化。
[0020]實施例八:熒光檢測
將實施例二至實施例七中獲得的蠶卵放在25 °C、90%濕度的培養箱中培育孵化，蠶卵經約Ild左右孵化。孵化出的幼蟲GO代用桑葉飼養至結繭，羽化后與正常的蠶蛾交配，每一個雌蛾的Gl代蠶卵分別單獨孵化，將Gl代的幼蟲或蛹置于體視熒光顯微鏡(Olympus)下篩選陽性個體，5齡4天幼蟲進一步使用小動物活體成像系統(IVIS spectrum,Calipur PerkinElmer)確認陽性EGFP熒光。上述實施例二至實施例七中獲得的蠶卵均在體視顯微鏡和小動物活體成像系統觀察到EGFP熒光，如圖2所示:1型類人膠原蛋白轉基因家蠶陽性個體EGFP標記的熒光檢測圖，其中A圖是在體視顯微鏡下對照圖，檢測無熒光;B圖為顯微注射后的幼蟲在體視顯微鏡下存在熒光現象;C圖為5齡4天幼蟲在小動物活體成像系統的熒光現象，其中C圖左側兩條家蠶幼蟲為對照，右側兩條家蠶幼蟲是經過顯微注射轉基因質粒的蠶卵經培養的幼蟲，能明顯觀察到綠色熒光現象，確認幼蟲陽性EGFP熒光。。確定轉基因陽性的Gl代同蛾區的雌雄蠶蛾交配產卵為G2代(按SHCP系列命名)。將G2代蠶卵按25°C、85%濕度培養箱中培育，每一個雌蛾的蠶卵也單獨孵化，再在同一區中挑選出轉基因陽性的雌雄蠶蛾自交產卵，產生G3代。
[0021]利用/7基因技術構建家蠶絲腺生物反應器生產膠原蛋白是一種安全、高效的生產重組類人膠原蛋白的方法。I型類人膠原蛋白不僅是確立組織細胞形狀的結構蛋白，也對維持細胞的完整性及傳遞細胞外信號起重要作用。膠原蛋白分子由一個GXY三聯子不間斷序列構成的中心三螺旋結構域，在I型膠原蛋白中，X和Y可以是任何殘基，但X主要是脯氨酸，Y主要是羥脯氨酸，占了總三肽數量的44%，在三螺旋域G-X-Y重復序列Y-處，脯氨酸殘基的4-羥基化修飾是在生理條件下形成熱穩定三螺旋膠原蛋白分子的關鍵步驟，也是膠原蛋白生物合成后完整發揮活性功能所必需的翻譯后修飾。本發明通過將//CoW-1cDNA和家蠶脯氨酰4-羥化酶α-亞基cDNA同時轉入早期胚胎并通過絲素輕鏈(fib~L)啟動子在后部絲腺表達，獲得具有完整生物學功能的I型類人膠原蛋白JHCool-1)，為后期大量工業化獲得I型類人膠原蛋白(HCool-1)做好了準備，具有非常重要的經濟價值。
[0022]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:包括: (1).構建轉基因載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP; (2).將轉基因質粒pBFL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG質粒以濃度比為I: I，總DNA濃度為400 ng/yL的比例混合，通過顯微注射將轉基因質粒注射入產后2?5 h以內的家蠶蠶卵中，每粒蠶卵注射10?15 nL，注射后立即用無毒膠水封閉注射孔，經甲醛蒸氣再次消毒后，經顯微注射后的蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化； (3).Gl代的幼蟲或蛹置于體視熒光顯微鏡下篩選陽性個體，5齡4天幼蟲使用小動物活體成像系統確認幼蟲陽性EGFP熒光。2.如權利要求1所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的構建轉基因載體pBFLHCoo 1-1-FLBmP4Ha-A3EGFP包括: (1).擴增克隆cDNA； (2).構建pMD-FL-HCool-1-pA載體； (3).構建pBFLHCool-1- A3EGFP載體； (4).構建pMD-FL-BmP4Ha-pA 載體； (5).構建目標載體pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP。3.如權利要求2所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的況oW-1 cDNA序列如序列I所示。4.如權利要求2所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的cDNA序列翻譯的蛋白序列如序列2所示。5.如權利要求2所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的/M-L啟動子序列如序列3所示。6.如權利要求2所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的咖cDNA序列如序列4所示。7.如權利要求2所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的經顯微注射后的蠶卵在培養箱中培育孵化條件為25°C、90%濕度。8.如權利要求2所述的在家蠶絲腺中表達重組I型類人膠原蛋白的方法，其特征在于:所述的Gl代幼蟲由所述的顯微注射后的蠶卵放在25°C、90%濕度的培養箱中培育孵化，經約Ild左右孵化，孵化出的幼蟲GO代用桑葉飼養至結繭，羽化后與正常的蠶蛾交配，由雌蛾產生Gl代蠶卵，單獨孵化為Gl代幼蟲。
【文檔編號】A01K67/04GK105969800SQ201610289773
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月3日
【發明人】徐豫松, 王華兵, 占鵬飛
【申請人】浙江大學