除人 CCR5基因中用于特異性靶向CCR5基因的sgRNA，所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列符合5 ' -G (21N) NNGRRT-3 '或者5 ' -ARRCNN (21N) C-3 '的序列排列規則，下劃線代表PAM，21N代表靶位 點的21個堿基序列，其對應的DNA序列如SEQ ID N0.1-4任意一條序列所示，其中SEQ ID NO. 1-3在人與恒河猴的基因位點上保守。
[0052]本發明的目的還在于提供含有CRISPR/SaCas9系統的靶向敲除人CCR5基因的慢病 毒載體，其具有以下特征：
[0053] ①所述靶向敲除載體是將Addgene公司PX601載體上的SaCas9基因通過PCR擴增后 轉移到lentiCRISPR-V2載體上，取代原來的SpCas9;將PX601載體上的SaCas9對應的crRNA 通過重疊 PCR擴增后轉移到lentiCRISPR-V2載體上，取代原來的SpCas9對應的crRNA。
[0054]②此載體含有一個人的U6啟動子，該啟動子控制著sgRNA的表達，用BsmBI核酸內 切酶對此載體進行消化，然后再插入含有粘性末端和長為21bp的靶sgRNA片段，靶序列如 SEQ ID N0.1-4任意一條所示；
[0055]③在酶切位點BsmBI后有長為81bp的crRNA核酸序列為sgRNA的骨架序列；
[0056]④crRNA核酸序列后的EFS的啟動子控制人類編碼最優的SaCas9的表達；
[0057]⑤含有自切割多肽P2A和帶有篩選標記的基因 Puromycin的編碼序列。
[0058]以上所述的含有CRISPR/SaCas9系統的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒載體的序列 如SEQ ID N0.15-18任意一項所示。
[0059] 本發明還提供靶向敲除人CCR5基因的慢病毒載體的慢病毒。
[0060] 本發明提供的含有CRISPR/SaCas9系統的靶向敲除人CCR5基因的腺相關病毒載 體，其特征在于：
[0061 ]①選擇的腺相關病毒載體為Addgene公司PX601;
[0062]②此載體同樣含有一個U6啟動子，控制著sgRNA的表達，用Bsal核酸內切酶切割載 體后，插入含有粘性末端和長為21bp的靶sgRNA片段，靶序列如SEQ IDN0.1-4任意一條所 示；
[0063] ③含有一個TBG啟動子來調控SaCas9的表達。
[0064]本發明提供含有權利要求4所述靶向敲除人CCR5基因的腺相關病毒載體的腺相關 病毒。
[0065]本發明的目的還在于提供在CRISPR/SaCas9特異性敲除人CCR5基因中用于特異性 靶向CCR5基因的sgRNA在非診療目的的敲除人或恒河猴CCR5基因中的應用。
[0066]本發明的目的是提供含有CRISPR/SaCas9系統的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒載 體或腺相關病毒載體在非診療目的的敲除人或恒河猴CCR5基因中的應用。
[0067]本發明的目的還在于含有CRISPR/SaCas9系統的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒載 體或腺相關病毒載體在制備抗艾滋病藥物中的應用。
[0068]以上的研究結果表明：本發明CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載體 可以用于艾滋病基因治療。本發明的有益之處有：
[0069] (1)以上實驗篩選出來的具有高效切除效率的CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和 腺相關病毒載體可以用于基于造血干細胞的艾滋病的基因治療。在某一方面可以運用 CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載體轉導入艾滋病病人的造血干細胞，然后 分選出轉導成功的改造后的細胞把它回輸到病人的體內，從而進行艾滋病的基因治療。
[0070] (2)本發明所提供的CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載體能夠表達 針對于人和恒河猴同一基因的CCR5靶點的SaCas9-RNA，使得應用范圍更廣，效率更高。
[0071] (3)本發明所提供多個靶點的CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載體 能靶向艾滋病毒侵入相關的宿主膜蛋白受體CCR5,可以更有效地抑制病毒的侵入，阻止疾 病的發生發展。
【附圖說明】
[0072]圖1 CRISPR/SaCas9的慢病毒載體和腺相關病毒載體系統的構建流程圖。
[0073]通過BsmBI酶切位點將用化學方法合成的編碼不同靶位點的寡核苷酸片段經過退 火合成含有與載體酶切后末端互補的粘性末端的sgRNA寡聚核苷酸雙鏈后連入 lentiCRISPR載體，同樣的方法通過Bsal酶切位點把經過退火合成sgRNA寡聚核苷酸雙鏈連 入AAVCRISPR載體，分別得到不同靶CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載體。 [0074]圖2 T7EN1酶切鑒定不同靶點的CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載 體對CCR5基因的基因敲除效果圖
[0075]圖 2A 通過 T7Endonucl ease I酶切實驗，con為陰性對照組。結果表明：在T7E1實驗 中，CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體的2、6、8、11號靶點有作用，但6、11號作用最強；
[0076] 圖2B CRISPR/SaCas9重組腺相關病毒載體的2、3、5、8、11、12號靶點有作用。
[0077]圖3 T克隆測序驗證不同靶點的CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載 體對CCR5基因的基因敲除效果圖
[0078] 圖3A通過T克隆測序顯示CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體的2、6、8、11號都有堿基 的插入或缺失以及突變，6號效果最為明顯；
[0079]圖3B CRISPR/SaCas9重組腺相關病毒載體的8、11號有插入、缺失或突變(圖3B); [0080]圖4流式細胞儀技術檢測CRISPR/SaCas9重組慢病毒載體和腺相關病毒載體建立 的基于TZM-bl細胞的穩定細胞系的CCR5膜蛋白表達水平圖
[0081 ] 圖4A未經改造的con細胞其APC-CCR5陽性細胞率為100%，而經lentiCRISPR-2、6、 8、11改造的細胞其六?(：-〇^5陽性細胞率分別為46.6%、39.5%、43.7%和36.6%。相比于對 照分別下調了53·4%、60· 5%、56· 3%和63·4% ;
[0082] 圖4B未經改造的con細胞其APC-CCR5陽性細胞率為100%，而經AAV-CRISPR-8、11 改造的細胞其APC-CCR5陽性細胞率分別為84.8 %、和86.4 %。相比于對照分別下調了 15.2% 和 13.6%〇
[0083] 圖5單熒光素酶報告基因檢測HIV在經Lenti-CRISPR慢病毒和AAV-CRISPR腺相關 病毒改造的TZM-bl細胞中的復制情況
[0084] 圖5A是HIV-1感染經Lenti-CRISPR慢病毒改造的TZM-bl細胞后5天后收樣品檢測 細胞內HIV的復制情況，從上圖我們可以發現與陰性對照Con相比，lenti-CRISPR-2、6、8、11 號細胞中HIV-1的復制水平明顯下降；
[0085] 圖5B是HIV-1感染細胞后5天后收樣品檢測經AAV-CRISPR腺相關病毒改造的TZM- bl細胞內HIV的復制情況，從上圖我們可以發現與陰性對照Con相比，AAV-CRISPR-8、11號細 胞中HIV-1的復制水平明顯下降。
【具體實施方式】
[0086]通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施 例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。
[0087]【實施例l】CRISPR/SaCas9特異性敲除人CCR5基因中用于特異性靶向CCR5的sgRNA 的設計及靶位點序列保守性的分析
[0088]在本發明選擇了HIV-1病毒的輔助受體蛋白即宿主蛋白CCR5(NCBI基因號：匪_ 000579)作為靶標，依據SaCas9編輯規則(F.Ann Ran et al. 2015)篩選出了多個在恒河猴 和人的基因都保守的靶位點，13個靶位點見附表1，為了證明申請人所選的CCR5靶位點序列 在人和恒河猴中具有保守性，申請人把針對于CCR5的13個靶位點在National Center For Biotechnology Information Database中的BLAST軟件進行了序列保守性的分析，結果顯 示:其中10個靶位點在人與恒河猴的基因位點上保守，有一個堿基不一樣的有3個靶位點， 即在附表1中分別是7、9和11號以粗體顯示的靶點，序列中括號內是恒河猴基因組上對應的 喊基）。
[0089] 所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列符合5'-G(21N)NNGRRT-3'（下劃線代表PAM)或 者5'-ARRCNN(21N)C-3'（下劃線代表PAM)的序列排列規則；由此獲得了在CRISPR/SaCas9特 異性敲除人CCR5基因中用于特異性靶向CCR5基因的sgRNA，如附表1所示。
[0090] 附表1、人和恒河猴CCR5基因的保守靶位點分析
[0091]
[0092]【實施例2】重組lenti-CRISPR和AAV-CRISPR構建以及基因編輯效果鑒定 [0093]本發明中選擇的慢病毒載體為lentiCRISPR/SaCas9,該載體由本實驗室構建，具 體是將Addgene公司AAV-CRI SPR-SaCas9 (也叫PX601)載體上的SaCas9基因通過PCR擴增后 轉移到lentiCRISPR-V2載體上，取代原來的SpCas9。將PX601載體上的SaCas9對應的crRNA 通過重疊 PCR擴增后轉移到lentiCRISPR-V2載體上，取代原來的SpCas9對應的crRNA。
[0094] 該載體包含一個人的U6啟動子主要調控sgRNA的表達，還包含一個EFs啟動子來調 控SaCas9的表達。而改造的腺相關病毒載體為pAAV-CRISPR，該載體也包含著一個控制 sgRNA表達的U6啟動子，但含有一個TBG啟動子來調控SaCas9的表達。
[0095] a、化學方法合成寡核苷酸鏈，格式如下：
[0096] 有義鏈:5'-G(21N)NNGRRT-3'或者5'-ARRCNN(21N)C-3'（引物不含PAM)
[0097] PAM PAM
[0098] 反義鏈:與有義鏈互補（引物不含PAM)，在有義鏈引物的5'端加上CACC，在反義鏈 引物的5'端加上AAAC以形成BsmBI酶切位點和Bsal酶切位點的粘性末端；（注:21N代表靶位 點的21個堿基序列）
[0099] b、把有義鏈引物和反義鏈引物經過退火，形成帶有BsmB頂每切位點和Bsal酶切位 點的粘性末端和平末端的小片段；
[0100] 退火體系如下：
[0101]
[0102] 退火程序：95Γ5π?η，90Γ5π?η，85Γ5π?η，80Γ5π?η，72Γ?0π?η，65Γ5π?η，60Γ
[0103] c、將退火形成的小片段連入由BsmB頂每和Bsa頂每進行酶切的載體lentiCRISPR和 AAVCRISPR(參見圖1);
[0104] d、將連接產物轉化進大腸桿菌Stbl3感受態細胞中（Stbl3菌株購自Invitrogen公 司）；
[0105] e、挑取單克隆，經初步鑒定后把陽性結果送公司進行測序驗證。
[0106] 廠申請人將所構建的〇?15?1?/5&0&89重組慢病毒載體和腺相關病毒載體轉染了21-bl細胞(購買自ATCC)，72小時后收集細胞提取其基因組，PCR擴增CCR5基因，把回收的產物 經T7Endonuclease 1(購買自BioLabs)酶切鑒定(參見圖2)，結果表明：申請人所設