專利名稱：用于治療疾病的腺病毒載體的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及基因治療領域，更具體地說涉及具有預防或治療用途的腺病毒載體。
背景技術：
腺病毒是實施基因治療的一種備選載體。參見，Jolly，D.，癌癥的基因治療(Cancer Gene Therapy)，vol.1，no.1-1994pp5 1-64。腺病毒了解透徹的分子遺傳學知識使其成為該領域中的優選載體。腺病毒是無被膜二十面體雙鏈DNA病毒，線性基因組大小約為36 kbp。該病毒基因組的每一端都帶有一段稱為末端反向重復序列(或ITR)的短序列，這段序列為病毒復制所必需。部分該病毒基因組易于用外源DNA取代，而且重組腺病毒具有穩定的結構。
腺病毒復制循環分為兩個階段即早期階段和晚期階段，在早期階段中，El、E2、E3和E4這4個轉錄單元被表達，晚期階段發生在病毒DNA合成開始之后，期間晚期轉錄本在主要晚期啟動子(MLP)調控下得以表達。晚期信息編碼大部分的病毒結構蛋白質。El、E2和E4的基因產物負責轉錄活化、細胞轉化、病毒DNA復制以及其它病毒功能并且是病毒生長所必需的。
迄今為止，多數腺病毒載體是在對病毒進行下述操作的基礎上制備而成的突變發生于El、E3或E4上游的位點以提供用于插入外源DNA的位點。可能這類載體中的絕大部分都是以缺失基因組El區域的腺病毒突變株為基礎的。通過缺失該區域，使得該病毒復制機能不全，此外得到一個可插入外源基因的區域。
有關將腺病毒用于基因治療已有大量報道。例如，Smith，等人，自然遺傳學(Nature Genetics)，Vol.5，pgs.397-402(1993)一文中公開了向小鼠施用包括人因子IX基因的腺病毒載體。這種施用導致有效的肝轉導，人因子IX的血漿水平可以有效地治療乙型血友病患者。但是，注射9周后，人因子IX水平會慢慢地衰減到基線水平，而且這種水平還不能通過第二次載體注射來重建。Smith等人還發現抗腺病毒中和抗體能阻礙腺病毒成功的重復施用。
Kozarsky，等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，Vol.269，No.18，pgs.13695-13702 (1994年5月6日)一文中公開了將一種包括編碼LDL受體的DNA的腺病毒載體輸注到兔中。發現LDL受體基因能夠在兔子體內穩定表達7～10天，在3周內減低到不能檢測的水平。抗腺病毒中和抗體的生成導致第二劑量的完全失效。
Kass-Eisler.等人，基因治療，Vol.1，pgs.395-402(1994)一文指出，腺病毒載體在成人體內表達的持續時間受到限制與T-細胞應答有關，但并非完全取決于T-細胞應答。該作者進一步指明環孢菌素A不能有效阻斷針對該載體的體液應答。
Fang，等人，細胞生物化學雜志(J.Cell.Biochem.)，增刊21 A.C6-109，pg 363(1995)一文公開了向已用免疫抑制劑環孢菌素A處理過的狗中重復注射腺病毒載體的嘗試。這種重復注射的嘗試未獲成功。
Yang，等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)，Vol.91，pgs.4407-4411(1994年5月)一文中描述了一種其中Ela和F1b區域已缺失的重組腺病毒。這類病毒還包括一種轉基因。當將這類腺病毒施用給一種動物宿主時，含有上述重組病毒基因組的細胞可表達目的轉基因，但是同時也發生病毒基因的低水平表達。
如上例示，腺病毒在體內可以有效地將基因轉移到細胞中，因此可以用作送遞載體將目的基因導入真核細胞，腺病毒從而通過結合細胞受體將這類基因送遞至真核細胞。但是，腺病毒基因轉移受到一些因素的限制，這部分來源于宿主對于腺病毒載體顆粒、該載體顆粒的分解產物或者轉導細胞的應答。這些宿主應答包括非特異性應答和特異性免疫應答。所述非特異性應答包括炎性和非炎性變化。后者的一個實例是宿主細胞基因表達的變化。特異性免疫應答包括各種細胞應答及體液抗體應答。細胞應答包括輔助T-淋巴細胞、抑制性T-淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和天然殺傷細胞所介導的應答。
盡管腺病毒載體介導的基因轉移的高效率，但是腺病毒載體介導基因轉移的瞬時性表明有必要重復注射腺病毒載體。但是，最近對棉鼠的研究表明直接針對腺病毒載體的宿主免疫應答與基因轉移效率的衰減以及重復注射后的表達相關。Yei等人，基因治療，1192-200(1994)。E3區域編碼gp 19K、10.4K、14.5K和14.7K這幾種非病毒復制所必需的免疫調節蛋白，以及一種大小為11.6K的蛋白質，這種蛋白質為感染細胞的裂解以及傳染性后代的釋放所必需。
雖然E3區域對于病毒復制并非必不可少，但是其在調控宿主對病毒的免疫應答中發揮關鍵作用。例如，已知gp 19K能夠結合內質網中的MHC I類分子，從而抑制其糖基化以及向病毒轉染細胞表面的轉運。因此，轉染后的細胞不能被細胞毒性淋巴細胞識別為外源物質。參見，Burgert.B.，等人，美國國家科學院院報1987，Vol.81356-60。
由于E3區域具有多種功能，所以希望獲得一種具有下述特性的腺病毒用于基因治療根據載體的預期用途缺失E3中的特定部分，而代之以外源的DNA。例如，描述了E3區域中可以去除Xba 1位點之間的1.88Kb片段的缺失。參見Berkner，K.Sharp，P.，(1983)核酸研究(Nucleic Acids Res.)Vol.11.6003-6020頁，及Haj-Ahmad，Y.和Graham，F.(1986)病毒學雜志(J.Virol.)Vol.57.267-274頁。另外還描述了用于構建在El和E3區域中帶有插入片段或缺失的組合物及方法。參見，Ginsberg，H.S.等人，美國國家科學院院報1989，Vol.86，pp.3823-7。
因此，盡管現在已有在E3區域突變或該區域大部分缺失的載體，但是迄今為止還沒有一種去除了該區域中的選定部分而代之以外源DNA的腺病毒載體。
發明概述本發明的第一個目的為描述具有下述特征的重組腺病毒載體即E3區域中含有可使該區域，或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點，如有必要，代之以外源基因，該外源基因表現出的表達模式在定時和表達程度上都類似于它所取代的內源腺病毒基因。
本發明的第二個目的為描述在編碼6.7K和gp19K蛋白的E3區域的早期區域基因中含有限制位點的重組腺病毒載體。
本發明的第三個目的為描述在編碼10.4k、11.6k、14.5k和14.7k蛋白的E3區域中含有限制位點的重組腺病毒載體。
本發明的第四個目的為描述具有下述特征的重組腺病毒載體即E3區域中含有可使該區域，或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點，以及用于其中取代以外源DNA的組合物和方法。
本發明的第五個目的為描述在E3區域中含有可使該區域或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點的重組腺病毒載體的制備方法。
本發明的第六個目的為描述含有重組腺病毒載體的宿主細胞，所述重組腺病毒載體E3區域或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失。
本發明的第七個目的為描述在E3區域中含有可使該區域或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點的重組腺病毒突變體。
本發明的第八個目的為描述在E3區域中含有可使該區域或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點的重組腺病毒突變體，包括病毒粒體E3SV、E3SV+V、E3SV+B以及E3SV+V+B。
本發明的第九個目的為描述在E3區域中含有可使該區域部分或全部缺失的限制位點的重組腺病毒突變體，其中所述突變體在該腺病毒基因組其它部分還有突變，優選在ElA、ElB和/或E4區域中。
本發明的第十個目的為描述用于診斷或治療疾病的方法和組合物，優選涉及不希望的細胞生長的疾病，包括瘤形成，使用在E3區域中含有可使該區域或者其中包含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點的重組腺病毒突變體，其中所述的腺病毒突變體的E3區域中替換入編碼具有醫學應用價值的蛋白質的基因。優選的替換基因包括異源基因如負選擇基因，優選胞嘧啶脫氨酶和胸腺嘧啶激酶。
本領域普通技術人員在閱讀了下面說明書中對本發明各方面所做的描述之后，就會對本發明上述的這些以及其它的目的有清楚的認識。本發明上述的這些以及其它方面在下面的附圖、發明詳述及實施例部分有更為詳細的描述。
附圖簡述

圖1給出的是腺病毒5型E3區域轉錄單位的圖譜。斷開的箭頭表示mRNAs的剪接結構(空心矩形或實線代表外顯子，虛線代表內含子)。箭頭厚度代表相對豐度。箭頭上方的陰影條表示E3蛋白，它們是根據其分子量命名的。
圖2給出的是用pNB和Ad5 TP-DNA制備重組病毒(m.u.代表圖單位)。
圖3給出的是用pSN和Ad5 TP-DNA制備重組病毒。
圖4給出的是腺病毒E3SV E3區域的限制性圖譜。
圖5給出的是腺病毒E3SV+V E3區域的限制性圖譜。
圖6給出的是腺病毒E3SV+B E3區域的限制性圖譜。
圖7給出的是腺病毒E3SV+V+B E3區域的限制性圖譜。
圖8給出的是模擬感染或用Ad5感染的A549細胞。
圖9給出的是用Onyx301、Onyx302、Onyx303和Onyx304感染的A549細胞。
圖10給出的是在感染后不同時間，從用病毒Onyx301、Onyx302、Onyx303和Onyx304感染的細胞制備溶胞產物，對其中的gP 19k進行Western印跡分析。
圖11給出的是在感染后不同時間，從用病毒Onyx301、Onyx302、Onyx303、Onyx304和Onyx305感染的細胞制備溶胞產物(0.5μg蛋白質)，對其進行CD分析。
圖12給出的是在感染后不同時間，從用病毒Onyx301、Onyx302、Onyx303、Onyx304和Onyx305感染的細胞制備溶胞產物，按0.6μg/反應的量對其進行CD分析。
圖13給出的是在感染后的不同時間，病毒Onyx305和Onyx320的致細胞病變效應。
圖14給出的是在感染后特定時間更換培養基或未更換培養基情況下，病毒320的致細胞病變效應。
圖15表示由病毒Onyx305感染的細胞在不同時間的CD表達。
圖16表示由Ad5感染的A549細胞的E3蛋白的Western印跡。每個泳道上的數字表示感染后(p.i.)的時間。
圖17表示在不存在和存在araC(一種DNA復制抑制劑)下由Ad5感染的細胞之E3蛋白的Western印跡。每個泳道上的數字表示感染后(p.i.)的時間。
圖18表示由Ad5或Onyx320感染的細胞之L4區域中的pVIII蛋白的Western印跡。每個泳道上的數字表示感染后(p.i.)的時間。
圖19表示由含有Onyx320和304之2CD感染的細胞之11.6K，14.5K和14.7K的E3蛋白的Western印跡。這些水平與如圖16所示的Ad5病毒產生的E3蛋白質水平相當。
圖20表示由Ad5或Onyx305感染的細胞之11.6K蛋白的Western印跡。
圖21表示由Onyx320感染的細胞合成的鼠TNF(mTNF)之26kD胞內形式的Western印跡。作為對照，模擬感染的和Ad5感染的細胞也分析mTNF存在與否。
圖22表示由Onyx320感染的細胞分泌到培養液中的17kD mTNF的Western印跡。在每一所示的時間點前一小時更換培養液，然后在所示的感染后時間提取等份樣品。在凝膠上上樣25μl并進行印跡。
圖23顯示測量存在于如圖22所述的培養液上清中的分泌的mTNF的量之ELISA分析結果。
圖24表示由Onyx320感染的A549細胞E3蛋白質gp 19K，14.5K和14.7K的Western印跡。作為對照，包括了Ad5感染的兩個時間點。每個泳道上的數字表示感染后(p.i.)的時間。
圖25表示由Onyx320感染的細胞之細胞內mTNF且在不存在或存在araC下溫育的Western印跡。
圖26表示由Ad5或Onyx304，305，和320感染的細胞之L4蛋白，pVIII，且在不存在或存在araC下溫育的Western印跡。
圖27表示由Ad5或Onyx320感染的細胞之E3蛋白gp19K，且在不存在或存在araC下溫育的Western印跡。
圖28表示由Ad5或Onyx321感染的A549細胞且在所示的感染后時間拍照的圖。
圖29表示由Ad5或Onyx321感染的A549細胞之mTNF和14.5K，14.7K的E3蛋白的Western印跡。模擬感染的(M)細胞在24小時的結果也顯示。每一泳道上所示數字為感染后小時。
圖30表示由Ad5或Onyx321感染的細胞之gp19K和11.6K E3蛋白的Western印跡。每一泳道上所示數字為感染后小時。
圖31表示由Onyx321感染的細胞之mTNF且在存在或不存在araC下溫育的Western印跡。
圖32表示在存在或不存在araC下由Onyx321感染的細胞之gp19K和11.6K E3蛋白的Western印跡。每一泳道上所示數字為感染后小時。
發明詳述本說明書中提到的包括專利和專利申請在內的所有公開出版物在此全文引入作為參考，其中每篇文獻與其在特定情況單獨所闡明的范圍相同。
定義除有特別說明外，本發明中使用的所有技術及科學術語都與本發明所屬技術領域內普通技術人員通常理解的含義相同。通常，本發明使用的命名法以及下面所述的實驗方法為本領域所熟知和常用的。
使用標準技術進行重組核酸方法、寡核苷酸合成以及微生物培養和轉化(例如，電穿孔、脂轉染)。通常，按照產品說明書進行酶促反應及純化步驟。所述的技術和操作通常按照本領域常規方法及各種常見參考文獻(一般參見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版(1989)紐約，冷泉港，冷泉港實驗室出版社)進行，這些參考文獻貫穿于本說明書全文。本發明使用的命名法以及下文提到的分析化學、有機合成化學及藥物制劑學實驗室方法都為本領域所熟知并被本領域經常使用。使用標準技術進行化學合成、化學分析、藥物制劑和送遞以及患者的治療。
本領域技術人員還應該認識到某些公開文獻有助于基因工程構建本發明的腺病毒以制備出E3區域的突變體。這些公開文獻包括McGrory，W.J等人，(1988)病毒學，vol.177，pp.437-444，此文描述了將DNA插入到E1區域；Hanke，T..等人(1990)病毒學，vol.177，PP.437-444和Bett.A.J.等人(1993)病毒學雜志，vol.67，pp.5911-5921，該文獻描述了將外源DNA插入到E3區域；以及Bett.A.J.等人(1994)美國國家科學院院報vol.91，8802-8806頁，此文描述了將DNA插入到El和E3區域。
在代表本發明選擇的具體實施方案的式子中，盡管通常不做明示，但是應該理解所述的氨基和羧基末端都以在生理pH值下所呈現的形式存在，除非另有說明。因此，在具體實施例或通式中，即使沒有特指和明示，也應該理解到N-末端的H2-和C末端的O-都為在生理pH值下存在的形式。在本發明使用的多肽表示方法中，分子的左手端為氨基末端，右手端為羧基末端，與標準用法和慣例一致。當然，包括那些在非生理pH值下形成的鹽在內的堿性及酸性加成鹽也包括在本發明所述化合物的范圍之內。本發明所述氨基酸殘基優選是“L”異構形式。但是，20種常規氨基酸的立體異構形式(例如，D-氨基酸)，a，a-分布氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸等非天然氨基酸以及其它非常見氨基酸也都可以是本發明所述多肽的合適成分，只要所述多肽能夠保留期望的功能特性。對于給出的肽而言，選用的每個編碼殘基都用三字母命名，對應于常規氨基酸的通俗名稱，與標準多肽命名法(參見生物化學雜志2433552-59(1969)并被37 CFR §1.822(b)(2)采用)一致。游離官能團，包括羧基或氨基末端的官能團，被稱為非干擾取代基，也可以通過酰胺化、酰化或其它取代進行修飾，例如，這能夠改變化合物的溶解度但不影響其活性。
本說明書使用的下列術語，除另有說明，都應當理解為具有下述含義術語“分離的蛋白質”在本發明中是指cDNA、重組RNA編碼的蛋白質或者合成的蛋白質或者它們的組合，具有下述共同的特征(1)與自然界中發現的蛋白質不相結合；(2)不含其它的同源蛋白質，例如，不含人體蛋白；(3)被不同種屬來源的細胞表達，或者(4)不存在于自然界中。
本發明使用的術語“天然存在”是指一種物體可以在自然界中發現。例如，生物體內(包括病毒)的多肽或多核苷酸序列，它們可以從自然的來源中分離出來，這些序列未經實驗人員有意修飾，是天然存在的。
術語“腺病毒”在本發明中是指從人體分離的40多個腺病毒亞型，以及從其它哺乳動物及鳥類中分離到的眾多亞型。參見，Strauss，“人體內的腺病毒感染”，《腺病毒》Ginsberg，ed.，Plenum出版社，紐約，NY，pp.451-596(1984)。優選地，該術語適用于兩個人血清型，Ad2和Ad5。
本發明使用的術語“多核苷酸”是指長度至少10個堿基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸也可以是脫氧核苷酸或者任一類型核苷酸的修飾形式。該術語包括DNA的單鏈及雙鏈形式。
本發明使用的術語“寡核苷酸”包括通過天然存在及非天然存在的寡核苷酸鍵連接在一起的天然存在的核苷酸及修飾的核苷酸。寡核苷酸長度為200個或更少堿基的多核苷酸子集。優選寡核苷酸長為10～60個堿基。寡核苷酸通常為單鏈，例如作為探針的寡核苷酸；盡管寡核苷酸可以是雙鏈形式，例如用于構建基因突變體的寡核苷酸。本發明所述的寡核苷酸既可以是有義也可以是反義寡核苷酸。本發明使用的“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本發明使用的術語“修飾的核苷酸”包括帶有修飾或取代糖基等本領域已知基團的核苷酸。
本發明使用的術語“標記”或“標記的”是指摻入一種可檢測的標記物，例如摻入一種放射性標記的氨基酸或者連接一種生物素基團的多肽，該生物素基團可以用標記親和素(例如，含有一種熒光標記物或可用光學或比色法檢測的酶促活性的鏈霉親和素)檢測。各種標記多肽及糖蛋白的方法為本領域已知，并且都可以使用。標記多肽的實例包括，但不限于下述形式放射性同位素(例如，3H、14C、35S、125I、131I)、熒光標記物(例如，FITC、羅丹明、鑭系磷光劑(lanthanidephosphors))、酶促標記物(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學發光物、生物素基團、可被二級報道分子識別的預定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈成對序列、次級抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標記)。在一些實施方案中，在標記物上連接有各種長度的間隔臂以減小潛在的空間位阻。
本發明使用的術語“序列同源性”描述的是兩段核酸序列之間堿基匹配的比例或者兩段氨基酸序列之間氨基酸匹配的比例。當序列同源性用百分比表示時，例如50％，所述的百分數表示的是在能與某一序列相比的序列的長度上相配者的比例。缺口(這兩條序列的任一條)允許實現最大限度的匹配；通常使用長度為15個或更少堿基的缺口，優選為6個或更少堿基，更優選為2個或更少堿基。
本發明使用的術語“選擇性雜交”是指可檢測并且特異性地結合。本發明所述的多核苷酸、寡核苷酸及片段在下述雜交及洗滌條件下選擇性地與核酸鏈雜交該條件可使與非特異性核酸可檢測結合的可估計的量降低到最低限度。可以使用高度嚴格條件來實現本領域已知的及本發明中討論的選擇性雜交條件。通常，本發明所述的多核苷酸、寡核苷酸及片段與目的核酸序列之間的核酸序列同源性應為至少80％，更典型地優選將同源性增至至少85％、90％、95％、99％和100％。
如果在兩個氨基酸序列之間存在部分或完全同一性，那么這兩個序列就是同源性的。例如，85％同源性是指當將兩序列對比最大限度匹配時有85％的氨基酸是相同的。允許最大限度匹配時存在缺口(在兩條匹配序列的任一條中)，優選5個或更少堿基的缺口長度，更優選2個或更少堿基。替代并優選的是，在本發明中使用這一術語時，如果采用具有突變數據矩陣的ALIGN程序兩條蛋白序列(或由它們衍生的長度至少30個氨基酸的多肽序列)具有超過5(以標準差單位表示)的對比得分和6或更大的缺口罰分，則它們是同源性的。參見，Dayhoff.M.O.，1972，第5卷，國家生物醫學研究基金會，pp.101-110.及此卷的增補本2，pp.1-10。更優選地，當用ALIGN程序進行最佳序列對比時，如果它們的氨基酸有大于或等于50％相同，那么這兩條序列或其部分是同源性的。
本發明使用的術語“相應于”是指一多核苷酸序列同源于(即，等同于，而不是在進化上嚴格地相關于)參考多核苷酸序列全長或部分，或者是指一多肽序列與參考多肽序列具有同一性。截然不同的是，本發明使用的術語“互補于”是指互補序列與參考多核苷酸序列的全長或部分之間具有同源性。舉例說明，核苷酸序列＂TATAC＂相應于參考序列＂TATAC＂，且互補于參考序列＂GTATA＂。
使用下列術語描述兩或多個多核苷酸之間的序列關系“參考序列”、“對比視窗(comparison window)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“實質同一性”。“參考序列”是指用作序列比較的基準的特定序列；參考序列可以是一較大序列的子集，例如，作為一全長cDNA或序列表中給定基因序列的節段可以包括完整的cDNA或基因序列。參考序列長度普遍為至少20個核苷酸，經常為至少25個核苷酸，常常至少為50個核苷酸。由于兩個多核苷酸可以每個(1)包括在這兩個多核苷酸之間相似的一段序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，以及(2)進一步還可以包括在這兩個多核苷酸之間離散的一段序列，所以典型地通過在一對比視窗上比較兩個多核苷酸的序列來進行兩(或多)個多核苷酸之間的序列比較，以鑒定并比較序列局部區域的相似性。本發明使用的“對比視窗”是指具有至少20個連續核苷酸位置的概念節段，其中可以將一多核苷酸序列與一至少20個連續核苷酸的參考序列進行比較，其中對比視窗中的多核苷酸序列部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比可以包括20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以實現兩序列的最佳對齊。用于對準對比視窗的序列最佳對齊可以通過下列方法進行局部同源性算法Smith和Waterman(1981)應用數學進展(Adv.Appl.Math.)2482，同源性對齊算法Needleman和Wunsch(1970)分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)48443，相似性檢索法Pearson和Lipman(1988)美國國家科學院院報852444，這些算法的電腦運行(威司康星遺傳學軟件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或檢驗，選擇用不同方法建立的及最優對齊(即，導致對比視窗上的最高同源性百分率)。術語“序列同一性”是指在對比視窗上兩多核苷酸序列是相同的(即，在核苷酸逐一對比的基礎上)。術語“序列同一性百分比”是通過下述方法計算而來的在對比視窗上比較兩個最佳對齊的序列、測定在兩序列中出現相同核苷酸堿基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置數目從而得到匹配位置數目、用匹配位置數目除以對比視窗中的位置總數(即，窗口大小)，把結果乘以100就得到序列同一性的百分比。術語“實質同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中該多核苷酸包括一段序列，該序列在具有至少20個核苷酸位置的對比視窗上與參考序列之間具有至少85％序列同一性，優選至少90～95％序列同一性，通常更優選至少99％序列同一性，往往在至少25-50個核苷酸的視窗上，其中所述的序列同一性百分比可以用下述方法計算出來比較參考序列與所述多核苷酸序列，對比視窗中該序列相對于參考序列可以包括20％或更少的添加或缺失。所述參考序列可以是一較大序列的子集。
本發明使用的“基本上純的”是指目的種形為占主導地位的種形(即以摩爾計量時它比組合物中任一其它種形含量都更豐富)，優選地一種基本上純化的級分是這樣一種組合物，即其中所述目的種形占所有大分子種形總量的至少約50％(以摩爾計量)。通常，一種基本上純的組合物將構成組合物中存在的所有大分子種形約80％以上，更優選約85％、90％、95％及99％以上。最優選，所述目的種形被純化至基本同質(用常規檢測方法檢測不到組合物中的污染物種形)，其中所述的組合物主要由單一的大分子種形所組成。
當用于多肽時，術語“實質同一性”是指當用GAP或BESTFIT等程序通過錯誤區間加權(default gap weights)達到最佳對齊時，兩個肽序列之間具有至少80％的序列同一性，優選具有至少90％的序列同一性，更優選具有至少95％的序列同一性，最優選具有至少99％的序列同一性。優選地，不相同的殘基位置因保守氨基酸的取代而不同。保守氨基酸取代是指具有類似側鏈的殘基之間的可交換性。例如，一組具有脂肪族側鏈的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側鏈的氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側鏈的氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香側鏈的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側鏈的氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；一組具有含硫側鏈的氨基酸為半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
本發明使用的術語“多肽片段”或“肽片段”是指氨基末端和/或羧基末端缺失，但剩余氨基酸序列與例如從全長cDNA序列中推導出的天然存在的序列相應位置相同的多肽，。典型地，片段長為8-10個氨基酸，優選至少10-20個氨基酸，甚至更優選長20-70個氨基酸。
本發明中的其它化學術語按照本領域的常規用法使用，例示參見McGraw-Hill化學名詞詞典(編者Parker，S.，1985)，McGraw-Hill，San Francisco，在此引入作為參考。
從用遺傳工程構建的克隆基因制備蛋白質已為人們所熟知，參見，例如授予Bell等人的4,761,371號美國專利中第6欄，第3行至第9欄，第65行。因此，隨后的討論目的在于概述本領域，而非打算反映本領域的全貌。
從本發明說明書可知，通過下列方法可以得到編碼蛋白質的DNA，該DNA可插入本發明所述腺病毒構建體E3區域化學合成，從合適的細胞或細胞系培養物中篩選基因組文庫，或者通過這些方法的結合，說明如下。可以利用從已知基因序列信息制備的寡核苷酸探針篩選mRNA或基因組DNA。可以按照本領域已知方法用熒光基團、放射性原子或化學發光基團等可檢測基團標記探針，并將其用于常規雜交試驗，更詳細的描述見下列實施例。
替代地，可以使用聚合酶鏈反應(PCR)方法回收基因序列。參見，授予Mullis等人的序號為4,683,195和授予Mullis的序號為4,683,202的美國專利。
載體為可復制的DNA構建體。本發明中實現腺病毒E3突變體的優選載體實例是以Promega公司的pGEM載體系列為基礎的。使用載體是為了擴增編碼目的蛋白質的DNA和/或表達編碼該蛋白質的DNA。一種表達載體就是一種可復制DNA構建體，其中編碼目的蛋白質的DNA序列優選地連接到能影響該蛋白質在合適宿主中表達的調控序列上。這類調控序列的需要因選擇的宿主及選用的轉化方法而不同。通常，調控序列包括轉錄啟動子、控制轉錄的任選操縱子序列、編碼合適mRNA核糖體結合位點的序列、以及控制轉錄和翻譯終止的序列。擴增載體不需要表達調控結構域。需要的只是在宿主中復制的能力，通常通過一復制起點和選擇基因以有助于轉化體的識別。
用于實施本發明的載體包括質粒、病毒(包括噬菌體)、及可整合的DNA片段(即，可通過同源重組整合到宿主基因組中的片段)。所述載體獨立于宿主基因組進行復制，或者在某些情況下可以整合到基因組本身中。合適載體包括來自與期望表達宿主相容的種形的復制子和調控序列。轉化的宿主細胞是那些已被用重組DNA技術構建的載體轉化或轉染的細胞。
當DNA區域功能上彼此相關時，可認為它們是可操作地連接在一起。例如，如果一個啟動子能調控編碼序列的轉錄，那么該啟動子為操作地連接到該編碼序列上，如果一核糖體結合位點的位置使得翻譯能夠實現，那么該核糖體結合位點可操作地連接到這段被翻譯的序列上。通常，可操作連接是指相鄰的，在前導序列的情況下，是相鄰的并且符合閱讀框。一個優選的實施方案中，在特定的E3區域DNA缺失并在其中取代了DNA的這些情況下，本發明所述的啟動子是組織特異性啟動子，該啟動子可操作地連接到一負選擇基因上。
合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞、或高等真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性微生物，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細胞包括按下述方法構建的哺乳動物來源的細胞系。作例證的宿主細胞有DH5a、大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)、大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC 31，537)和大腸桿菌294(ATCC 31，446)。
可以獲得多種多樣的合適微生物載體，并可以用于構建本發明所述的腺病毒載體。通常，微生物載體包括一個可被期望宿主識別的復制起點、一個能在宿主體內發揮作用的啟動子以及一個表型選擇基因，例如編碼可賦予抗生素抗性或可提供自養需要的蛋白質的基因。可以為其它宿主構建類似的構建體。典型地用pBR322轉化大腸桿菌。參見，Bolivar等人，基因2，95(1977)，pBR322中含有氨芐青霉素和四環素抗性的基因，因而提供一種易于鑒定轉化細胞的手段。表達載體應該含有一個可被宿主生物體識別的啟動子。通常這是指從期望宿主獲得的啟動子。重組微生物表達載體中最常用的啟動子包括β-內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(Chang等人，自然275，615(1978)；和Goeddel等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)8，4057(1980)和EPO專利公開36，76)以及tac啟動子(H.De Boer等人美國國家科學院院報80，21(1983))。雖然這些啟動子常用，但是其它的微生物啟動子也是合適的。關于許多啟動子核苷酸序列的詳細資料已公開，使得本領域技術人員可以將其可操作地連接到質粒或病毒載體的DNA上(Siebenlist等人細胞20，269，1980))。
來自多細胞生物的細胞培養物是重組蛋白合成的理想宿主。原則上講，任一高等真核細胞都可使用，不管是出自脊椎動物還是無脊椎動物培養物。但是，優選哺乳動物細胞。這類細胞在細胞培養物中的繁殖已是常規方法。參見組織培養，Academic Press，編者Kruse和Paterson(1973)。有用的宿主細胞系實例有VERO和HeLa細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞系、以及FL5，12、WI 138、BHK、COS-7、CV、和MDCK細胞系。這類細胞的表達載體通常包括(如果必要)復制起點、位于欲表達基因上游的啟動子、外加核糖體結合位點、RNA剪接位點(如果使用的是含內含子的基因組DNA)、聚腺苷酸化位點、以及轉錄終止序列。
復制起點可以用下述方法來提供構建一種包括一外源起點的載體，例如可來自SV40或其它病毒來源(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)，或者可利用宿主細胞染色體復制機制來提供。如果所述載體被整合到該宿主細胞染色體中，則后一種方法可能就足夠了。
用于轉化脊椎動物細胞的表達載體中的轉錄及翻譯調控序列經常通過腺病毒等病毒來源提供。多種病毒及哺乳動物組成型啟動子元件可供使用。參見，Mittal等人，(1993)病毒研究vol.28，pp.67-90。例如，常用啟動子源自多瘤病毒、腺病毒2、以及猿病毒40(SV40)。參見美國專利4,599,308。早期及晚期啟動子都是有效的，因為二者都可以作為還含有SV40復制起點的片段從病毒中容易地獲得。參見Fiers等人，自然273，113(1978)。
腺病毒E3突變體的構建構建腺病毒突變體的方法通常已為本領域已知。參見，S.K.，病毒研究，1993，vol28，67-90頁。而且，腺病毒5基因組以Genbank登記號M73260被注冊，該病毒可從美國典型培養物保藏中心(美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland，U.S.A.)獲得，登記號為VR-5。
通常，腺病毒載體構建體包括一個用常規技術在質粒表達盒中缺失或修飾腺病毒基因組目的區域，優選Ad5基因組。
然后，將pNB中出現的對應于腺病毒E3區域的腺病毒DNA或其片段克隆到另一種質粒中，該質粒也可以是pGEM5zf+。例如，可以從pNB中切出對應于第27082-31089位堿基的腺病毒SpeI-NdeI片段，并將其克隆到pGEM5zf+多克隆位點(MCS)中的SpeI和NdeI位點。得到的這一載體命名為pSN，其中出現的腺病毒DNA第27082-31089位堿基可以用來構建到E3區域的目的預期限制性位點得到合適的E3載體、質粒及病毒，詳細討論見下。
用于構建腺病毒的特定材料及方法的描述參見，Hanke，T.，等人，(1990)病毒學vol，177.437-444頁，和Bett，A.I.，等人，(1993)病毒學雜志Vol 67，5911-5921頁，以及PCT/CA96/00375。位于341 BeringAvenue，Toronto，Ontario加拿大的Microbix Biosystems，Inc.出售用于構建腺病毒突變體的多種材料，并且提供如何制備它們的產品資料頁。此外，也參見Hermiston，T.等人，分子醫藥學方法腺病毒方法和策略，W.S.Wold編，Humang Press，1999。
值得注意的是，雖然本發明描述的是腺病毒5型，但是也可以用其它類似血清型的腺病毒來實施本發明。腺病毒基因組的總體組構在各血清型間是保守的，并且特定功能的位置類似。
可以將本發明所述的E3區域突變體引入到E3以外區域已發生突變的腺病毒突變體中。優選地，這類突變發生在腺病毒基因組的E1B和/或E1A和/或E4 or f6區域。在E1B突變的情況中，這些優選突變可賦予腺病毒與正常細胞相比優先在成瘤細胞中復制的能力，其中所述的成瘤細胞是腫瘤抑制基因p53缺陷細胞。典型地，這類突變出現在編碼55k蛋白的E1B區域。缺陷型p53可以多種方式出現，包括與p53相互作用的那些蛋白質中的缺陷；也就是說，能使p53功能失活的p53途徑中的缺陷，參見美國專利5,677,178。因此，可以將本發明所述的E3突變體與腺病毒dl 1520中的El B缺失結合。該腺病毒的描述見Barker和Berk(1987)病毒學156107。
就El A突變體而言，可賦予腺病毒與正常細胞相比優先在成瘤細胞中復制的能力，其中所述的成瘤細胞為成視網膜細胞瘤腫瘤抑制基因產物或p105 Rb功能缺陷。這類失活突變典型地發生在El a CR1區域(Ad 5的第30-85位氨基酸；第697-790位核苷酸)和/或CR2結構域(Ad 5的第120-139位氨基酸；第920-967位核苷酸)，這些結構域參與結合p105RB蛋白。優選地，腺病毒基因組CR3結構域(跨第150-186位氨基酸)保留，表達為截短的p289R多肽，并在腺病毒早期基因的反式激活中發揮作用。缺陷型Rb可以各種形式出現，包括與Rb相互作用的那些蛋白質的缺陷；也就是說，能使Rb功能失活的Rb途徑上的缺陷，參見美國專利5,677,178。因此，可以將本發明所述的E3突變體與腺病毒Ad5NT dl 1010中的El A缺失結合。
本發明另一方面為將異源基因引入到本發明所述E3突變體的ElB、EIA、或E4orf6區域。因此，這類病毒在E3區，并且任選地在E1B、E1A或E4orf6中含有外源基因。這類外源基因或其編碼生物活性肽的片段的實例包括免疫調節蛋白和前體藥物活化劑(即，胞嘧啶脫氨酶、胸腺嘧啶激酶，美國專利5,358,866和5,677,178)。前者的實例包括白介素2，美國專利4,738,927或5,641,665；白介素7，美國專利4,965,195或5,328,988；以及白介素12，美國專利5,457,038；腫瘤壞死因子α，美國專利4,677,063或5,773,582；γ干擾素，美國專利4,727,138或4,762,791或者GM-CSF，美國專利5,393,870或5,391,485。另外的免疫調節蛋白還包括巨噬細胞炎性蛋白，其中包括MIP-3，(參見，Well，T.N.和Peitsch，MC.J.Leukoc.Biol.vol 61(5)545-50頁，1997)；以及細胞自殺或凋亡誘導蛋白，其中包括BAD和BAX，參見，Yang，E.，等人，細胞vol 80.285-291頁(1995)和Sandeep，R.，等人，細胞vol.91，231-241頁(1997)。也可使用單核趨化蛋白質(MCP-3α)。異源基因的優選實例是嵌合基因，其由與一種基因融合的編碼跨膜蛋白(如VP22或TAT)的基因組成，其中前述基因編碼優選對癌癥細胞有毒而對正常細胞無毒的蛋白質。
如上所述，E3區域中含有能使該區域或其中含有的選擇基因部分或全部缺失的限制位點的重組腺病毒載體，構建這種腺病毒載體的初始步驟是用分子生物學已有技術在質粒盒中制備腺病毒基因組突變體，參見本發明。下列限制性位點被構建入腺病毒5的E3區域中PacI、ClaI、PmeI、SwaI、BamHI、BstBI、SspI、NheI、以及StuI和EcoRV。它們在E3區域中的相對位置參見圖4-7。限制性位點的位置確保不破壞關鍵剪接和聚腺苷酸化信號。另一需考慮的是蛋白質編碼序列在E3區域中的位置；多數情況下，制備突變體添加新的限制位點應不改變編碼序列；但是，當出現氨基酸變化時，它們性質上是保守的。
因此，重要的是指出，這類在E3區域中插入一個或多個外源基因的腺病毒具有下述的重大優勢這些基因表現出的表達模式在定時和表達程度上都類似于它所取代的內源性腺病毒基因。
本發明所述的腺病毒載體也可以在已缺失的部分E3區域中引入一個組織特異性啟動子，該啟動子能夠驅動另一基因，優選地為一負選擇基因的表達。組織特異性啟動子的實例包括前列腺特異性抗原啟動子，參見，PCT/US95/14461。某些負選擇基因的實例包括胞嘧啶脫脫氨酶和胸腺嘧啶激酶。有關胞嘧啶脫氨酶，參見，美國專利5,358,866和5,677,178。
例如，可以將HSV tk基因表達盒任選地連接到E3啟動子的下游。經常，期望缺失非必要部分(即，病毒復制及包裝相關部分)以容納所述的負選擇基因，因此可以缺失E3基因的必要區域并用一負選擇基因表達盒取代，例如任選連接到一組織特異性啟動子(及增強子)或其它合適啟動子/增強子上的HSV tk基因。替代地，可以將負選擇基因任選可操作地連接到腺病毒晚期區域啟動子以便在表達復制表型的細胞中提供足夠表達量的負選擇基因產物，所述復制表型的特征在于自晚期基因啟動子轉錄。
HSV tk基因在一種細胞中的表達對該細胞并沒有直接毒性，除非該細胞暴露于鳥嘌呤或FIAU等負選擇試劑。表達復制表型的感染細胞中負選擇基因基本上得到表達，直到加入有效量的負選擇試劑(如甘昔洛韋)之前，這類感染細胞可以基本不產生任何附加細胞毒性，當加入負選擇試劑時，表達tk基因的感染細胞將被選擇性地的溶解；因此，負選擇可以用來使致細胞病變的殺傷增強和/或通過表現復制表型的殺傷細胞來抑制病毒進一步復制。
一個優選的實施方案是將HSV tk基因表達盒(Zjilstra等人(1989)自然342435；Mansour等人(1988)自然336348；Johnson等人(1989)科學2451234；Adair等人(1989)美國國家科學院院報864574；Capecchi，M.(1989)科學2441288；在此引入作為參考)可操作地連接到一帶有聚腺苷酸化位點的合適啟動子和/或增強子上形成tk表達盒。將該tk表達盒(或其它負選擇表達盒)插入腺病毒基因組，例如取代E3區域的實質缺失。
可以用本發明所述的編碼目的蛋白質的腺病毒載體來轉化合適的哺乳動物宿主細胞。可以采用本領域任一已知方法實施轉化而將多核苷酸導入到宿主細胞中，包括，例如把多核苷酸包裹到病毒中，再用該病毒轉導宿主細胞或者用本領域已知方法進行轉染，例示參見美國專利4.399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455。根據要轉化的宿主來決定使用的轉化方法。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法為本領域已知，其中包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導的轉染、電穿孔、將多核苷酸封裝入脂質體、以及將DNA直接微注射到細胞核中。
治療方法通過向患者施用含本發明腺病毒的組合物，可以治療疾病，優選治療腫瘤疾病，該組合物進一步還包括一種負選擇基因。后者的實例包括胞嘧啶脫氨酶和胸腺嘧啶激酶。
本發明所述的腺病毒構建體可以用來治療各種人類腫瘤，具體地說是這樣的腺病毒構建體，它們的E3區域編碼一種能夠用于疾病的基因治療的蛋白質。一個實例是細胞因子，優選為一種白介素。通過施用抗腫瘤有效量的適當腺病毒，可以治療，例如但不限于，患有下列疾病的患者或非人哺乳動物支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、小細胞及非小細胞肺癌、肺腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、結腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、或淋巴細胞性白血病。可以通過各種途徑將感染性腺病毒粒體的懸液施用于腫瘤組織，包括靜脈內的、腹膜內的、肌內的、皮下的、以及局部的途徑。每ml含約103～1012或更多個病毒粒體的腺病毒懸液可以作為細霧吸入(例如，肺部傳輸治療支氣管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、或喉癌)或者直接拭抹到腫瘤部位治療腫瘤(例如，支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、宮頸癌)或者可以通過輸注(例如，輸注到腹腔治療卵巢癌，輸注到門靜脈治療肝癌或其它非肝原發性腫瘤引發的肝轉移)或以其它合適途徑給藥，包括向腫瘤組織直接注射(例如，乳腺癌)、灌腸劑(例如，結腸癌)，或導管(例如，膀胱癌)。
通過與移植了腫瘤細胞但未經處理的小鼠相比，進一步評定本發明所述腺病毒突變體在減小荷載移植腫瘤細胞的nu/nu小鼠體內腫瘤發生機率或降低腫瘤細胞數目方面的能力。
使用本發明所述E3病毒實施的腺病毒治療可以與其它抗腫瘤方法，例如傳統的化療方法相結合。另外，當本發明所述的E3腺病毒載體或病毒能激發免疫應答從而減弱它們在宿主體內的作用時，可以將它們與一種適當的免疫抑制藥物聯合使用。
腺病毒突變體的繁殖典型地，將本發明所述的腺病毒突變體作為病毒原液在細胞系中繁殖(例如，293細胞系ATCC #CRL 1573，美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD；Graham等人(1977)病毒遺傳學雜志3659，或A549細胞)，所述細胞系應能提供某種期望的病毒功能，如果需要，運輸中應能保證感染性突變體病毒粒體的復制和形成。
制劑腺病毒E3突變體可以配制成針對患者的治療性和診斷性給藥形式。就治療或預防性用途而言，可以向患者或患病的非人脊椎動物施用一種含有藥理學上有效量的一種或多種腺病毒突變體的無菌組合物，來治療例如腫瘤疾病。通常，所述組合物在含水懸液中包含約103～1015或更多個腺病毒粒體。經常，向這類無菌組合物中加入一種藥物學上可接受的載體或賦形劑。多種水溶液都可以使用，例如，水、緩沖水溶液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。這些溶液是無菌的并且一般不含除預期腺病毒粒體以外的任何其它顆粒狀物質。當需要近似生理條件時，該組合物可以包含藥物學上可接受的輔助物質，例如pH調節及緩沖劑、毒性調節劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。還可以包括能夠增強腺病毒對細胞感染的賦形劑。
本發明的腺病毒或其中包含的DNA可以通過脂質體或免疫原性脂質體輸送；這種輸送可以根據腫瘤細胞群落上存在的細胞表面特性選擇性地以腫瘤細胞為目標(例如，存在能夠結合免疫原性脂質體中的免疫球蛋白的細胞表面蛋白質)。典型地，將含有病毒粒體的水懸液封裝在脂質體或免疫原性脂質體中。例如，可以用常規方法，將腺病毒粒體懸液封裝于微膠粒中形成免疫原性脂質體(美國專利5,043,164、4,957,735、4,925,661；Connor和Huang(1985)細胞生物學雜志101582；Lasic DD(1992)自然355279新的藥物輸送(編者Prescott LF和Nimmo WSWiley，紐約1989)Reddy等人(1992)免疫學雜志(J.Immunol.)1481585頁)。免疫原性脂質體中含有一種能夠特異性結合所述個體癌細胞上存在的癌細胞抗原(例如，CALLA、CEA)的抗體，這樣的免疫原性脂質體可以用來靶向所述細胞上的病毒粒體或病毒粒體DNA。
含有本發明腺病毒或其雞尾酒組合的組合物可以用來預防和/或治療腫瘤疾病。在治療應用中，向已患有特定腫瘤疾病的患者施用組合物，其用量足以治愈或至少部分抑制病情及其并發癥。足以實現這一目的的用量被定義為“治療有效量”或“有效劑量”。對于這種用途有效的用量取決于病情的嚴重程度、患者總體狀況、以及給藥途徑。
在預防應用中，向尚未出現腫瘤病情的患者施用含有本發明腺病毒或其雞尾酒組合的組合物，以增強患者對于腫瘤復發的抗性或者延長緩解時間。這一用量被定義為“預防有效量”。對于這種用途，確切用量還取決于患者的健康狀況以及一般免疫水平。
所述組合物可以單一或復合給藥，劑量水平及給藥方式由臨床醫師來選定。無論怎樣，所述藥物制劑都應該能保證本發明所述抗腫瘤腺病毒的量足以有效治療患者。
本發明所述的抗腫瘤腺病毒治療方法可以與其它抗腫瘤方法，例如與傳統的化療方法聯用。
本發明的用途從以上討論明顯地可以看出，本發明所述的腺病毒載體/病毒具有包括基因治療在內的多種用途。例如，在本發明的一個實施方案中，可以將編碼一種醫學上有用的蛋白質的基因克隆到本發明所述病毒粒體的E3區域中，然后可以將該病毒粒體直接用于基因治療方法來治療疾病。在本發明的另一實施方案中，如上討論，所述E3突變體病毒粒體還可以在腺病毒基因組其它區域(包括E1B區域)中具有缺失/突變，并代之以一種具有期望特性的基因。無論是在E3還是El B區域，這類基因都可以編碼細胞因子，包括白介素、細胞周期調控蛋白、包括p16，或ras，或者能誘導細胞自殺或凋亡的蛋白、前體藥物活化劑，包括胞嘧啶脫氨酶或胸腺嘧啶激酶。另外，還可以使用腫瘤壞死因子α、干擾素γ以及mip-3。
也可以使用本發明所述腺病毒載體表達可作為有效免疫原或疫苗的蛋白質，并且轉化通常不表達特定蛋白質的細胞從而使之隨后表達該蛋白。表達這些分子的細胞可以用作中間體制備用于結合試驗的細胞膜制劑，其反過來可以用于藥物篩選。
下列實施例目的在于說明本發明的具體實施方案及其各種用途。給出這些實施例只是為了說明的目的，而非限制本發明。
實施例1一般方法及工作載體構建及繁殖人腺病毒載體的方法為本領域已知，本領域普通技術人員明白如何將這些方法用于下列實施例。這類方法包括下列文獻中的操作方法Hitt，M.，等人構建及繁殖腺病毒的方法。見細胞生物學實驗室手冊；J.Celis(Ed)，Academic Press，N.Y.(1996)；Graham，F.L.和Prevec，L.以腺病毒為基礎的表達載體和重組疫苗。見疫苗解決免疫學問題的新方法。R.W.Ellis(ed)Butterworth.Pp.363-390；以及Graham，F.L.和Prevec，L.腺病毒載體的操作。見分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)，Vol.7基因轉移和表達技術E.J.Murray和J.M.Walker(eds)Humana Press Inc.，Clifton，N.J.pp109-128，1991。下面用到了這些文獻中描述的材料和方法。也參見Hermisto，T.等人，分子醫藥學方法腺病毒方法和策略，W.S.M Wold編，Humana Press，1999。
腺病毒載體對以pGEM(Promega Corp.)為基礎的載體進行修飾，并將其用于克隆、亞克隆、以及使Ad5合適的E3區域發生突變。該操作利用的是E3區域中的現有位點，這些位點見表1。
Table IAd5中存在的限制位點NdeI 19549和31089SpeI 27082EcoRI27295和30049SunI 28390EcoRV27295KpnI 28787MunI 29355NotI 29510Xhol 29791HpaI 30569通過把Ad5中的 SpeI(27082)～NdeI(31089)片段克隆到pGEM5Zf多克隆位點(MCS)中的SpeI和NdeI位點，進一步亞克隆，得到的質粒命名為pSN。
由于載體pGEM5中含有3個SspI位點(2199，2384，2408)，所以對其做了進一步的修飾；SspI是E3穿梭載體中的構建位點之一。缺失載體中的SspI位點后，由于不涉及部分限制性消化，所以有助于將基因插入到E3 SspI位點。為了缺失載體位點，用SspI和EcoRV(位于多克隆位點(MCS)中第51位堿基)切割質粒pGEM5，并重新連接。不幸的是，第2199位上的SspI缺失了，在得到的改變的載體中已發現。所以得到的載體缺失范圍為從第2384位的SspI到第51位EcoRV。盡管缺失這些位點中的兩個就可以簡化目的片段的分離，但是由于這一額外SspI位點的存在，所以當在E3區域中使用SspI時，仍還需要進行部分限制性消化。另外值得注意的是在E3區域第30172位有一SspI位點，當要使用構建SspI位點時，該位點存在于將被切除的同一區域中。因此，這是無足輕重的。這種改變的pGEM載體用作載體將Ad 5中的SpeI～NdeI區域插入，并且用于隨后E3區域中的操作，并用pG指示。
實施例2E3穿梭載體的構建使用上述載體，將下列限制位點構建到腺病毒5的E3區域PacI、ClaI、PmeI、SwaI、BamHI、BstBI、SspI、NheI、以及StuI和EcoRV。它們在E3區域中的相對位置見圖7。仔細排列這些限制性位點，以便不有意地破壞關鍵的剪接和聚腺苷酸化信號(參見，圖1)。另外對于蛋白質的編碼序列要注意的是大多數情況下都不要改變編碼的氨基酸，當必須改變時，這些改變應是保守性的。
由于構建位點位置的限制，一些突變不得不循序進行。用于誘變的所有寡核苷酸序列以及確切位置(在Ad5中的位置序號)列于表中。所有突變都用限制性消化來確證，并對所有構建體測序。表2中概括了加入到Ad5的E3區域中的限制位點。
表2加入到Ad5 E3中的限制位點 在Ad5基因組中的位置序號PacI 28497NheI 28532PmeI 29310BstBI 29484
StuI 29718EcoRV*29781ClaI 29862SspI 30377BamHl**30467SwaI 30830*這一突變使得10.4K的起始密碼子被改變**這一突變使得14.7K的起始密碼子被改變按照廠商提供的方法，利用Transformer定點誘變試劑盒(Clonetech #K 1600-1)，通過分別用突變寡核苷酸PacC加PacNC以及ClaC加ClaNC，同時創建出Pacl和ClaI位點。完全按照廠商提供的方法，利用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene #200518)，分別用突變寡核苷酸PmeC加PmeNC以及SwaC加SwaNC，單獨創建PmeI和SwaI位點。將含有KpnI-XhoI(天然的Ad5位點)片段插入到含有Pacl/ClaI的質粒中從而將PmeI位點克隆到該質粒中。用Hpal～NdeI片段將SwaI位點插入此構建體中。得到的構建體命名為pG-PPCS，用于下一輪的誘變。BamHI下列的所有突變都是利用一種高保真的酶-Pfu聚合酶，通過以PCR為基礎的誘變方法(參見核酸研究175404-1989，以及授予Mullis等人的序號為4,683,195和授予Mullis的序號為4,683,202的美國專利)來創建的，然后對用PCR制備的所有片段測序并確定無誤。將該方法用于兩個連續PCR反應，然后切割最終產物，以便插入期望質粒。簡言之，該技術采用兩個PCR和三個引物，一個含有目標突變。在第一個反應中，利用模板和兩個引物，其中一個引物帶有期望的突變。在第二個反應中，來自第一反應的擴增產物用作引物，與第三個引物一起使用。消化最終產物，利用標準方法純化插入到期望質粒中的插入片段。
使用上述質粒pG-PPCS作模板，通過在第一輪PCR中使用寡核苷酸BamC和SwaNC以及在第二輪PCR中使用該產物和PmeC，創建出BamHI位點。將該片段(第二輪PCR的產物)用PmeI和SwaI消化，插入到pG-PPCS，并將其命名為pG-PPCS+B。值得注意的是，這種突變還改變了14.7K的起始密碼子以防止該位點中任一插入基因的超前啟動，而且在E3穿梭載體最終的4個版本中，只有2個帶有BamHI位點。當不希望14.7k表達時，或當用外源基因替換14.7k時使用具有此BamHI位點的載體。BstBI、NheI和Stul在第一輪PCR中使用寡核苷酸BstBC和SwaNC以及第二輪PCR中使用PmeC加上第一輪產物，創建BstBI位點。使用的模板為pG-PPCS。用MunI和SwaI消化第二輪PCR的產物，并插入到pG-PPCS得到pG-PPBCS。為了制備出該構建體一種含有BamHI位點的版本，將帶有該位點的ClaI-HpaI片段插入制備出pG-PPBCS+B。
在第一輪PCR中使用NheC和PmeNC以及第二輪PCR中使用SunC加上第一輪產物，創建NheI位點，在這兩個獨立的反應中分別使用pG-PPBCS+/-B為模板。用PacI和PmeI消化該片段，并插入到上述構建體PPBCS+/-B的兩個版本中。該構建體稱為PG-PNPBCS+/-B。用pG-PPBCS+/-B為模板，通過在第一輪PCR中使用StuC和SwaNC以及第二輪PCR中使用PmeC和第一輪產物，添加入StuI位點。用MunI和SwaI消化該片段，并插入上文(-或+BamHI)所述質粒的兩個版本，分別命名為pG-PPBSCS或pG-PPBSCS+B。通過用PacI和PmeI消化兩質粒并將含有NheI位點的片段(源自pG-PNPBCS)插入到含StuI的質粒(pG-PPBSCS)，將新的StuI和NheI位點添加在一起。在含有和不含BamHI位點的質粒中進行該項操作，得到的質粒分別命名為pG-PNPBSCS+B和pG-PNPBSCS。SspI和EcoRV用上述的質粒pG-PNPBSCS和pG-PNPBSCS+B作模板，制備后兩個突變體。在第一輪PCR反應中使用EcoRVC和HpaNC引物以及在第二輪PCR中使用NheC和第一輪產物，創建SspI位點。用XhoI和HpaI消化該片段插入含有或不含BamHI位點的親代質粒。在第一輪PCR反應中使用EcoRVC和HpaNC引物以及在第二輪PCR中使用NheC和第一輪產物，創建EcoRV位點。用XhoI和HpaI消化該片段插入上文所述質粒。通過用PmeI和ClaI消化含有和不含BamHI位點的質粒并將含有EcoRV位點的片段插入到親代質粒，從而將SspI和EcoRV位點添加在一起。值得注意的是，這種EcoRV還改變了10.4K的起始密碼子以防止插入到5′末端ClaI位點的基因超前啟動。由于含有EcoRV位點的區域也參與剪接，所以使用ClaI位點代替EcoRV位點插入基因。該區域的缺失可能會破壞這一事件。
E3穿梭載體最終的這些版本示于圖4～圖7。它們稱為pE3SV、pE3SV+V、pE3SV+B和pE3SV+V+B，差別之處在于EcoRV和BamHI位點的存在與否。這些穿梭載體被用來構建隨后的所有質粒，這些質粒或插入了外源基因或缺失了Ad5 E3基因。
用于誘變目的E3區域的寡核苷酸示于表3。
表3用于誘變腺病毒5中E3區域的寡核苷酸的序列
所有序列均按5′～3′的順序書寫。所有發生變化的堿基用下劃線顯示，插入的堿基用粗體表示。
實施例3病毒對照及用于病毒產生的優化質粒的構建就對照而言，用構建的位點缺失掉所有的E3基因。為了實現這一目標，用下列成對的酶切割穿梭載體，并用T4DNA聚合酶補平，然后重新連接PacI和PmeI、SunI和MunI、NheI和PmeI、BstBI和StuI(全部位于pG-E3SV)、ClaI和SwaI(全部位于pG-E3SV+V)、ClaI和SspI(位于pG-E3SV+V)、以及BamHI和SwaI(位于pG-E3SV+B)。
除了上述pG質粒可用于產生本發明的病毒，圖2顯示可使用的另一種質粒，稱為pNB。pNB含有兩個SpeI位點一個位于Ad5插入片段中，一個位于pGEMS MCS。來自pNB的片段中含有MCS的一部分和NdeI 19549～SpeI27082，將該片段插入SpeI切割的pG-PPCS質粒。確證方向的正確性，得到的質粒命名為pNB-PPCS。通過將較小質粒中的PacI～SwaI區域插入到較大的pNB-PPCS，將E3穿梭載體的所有最終版本克隆到該質粒中。得到的質粒命名為pNB-E3SV、pNB-E3SV+V、pNB-E3SV+B和pNB-E3SV+V+B，然后可以利用pG家族質粒類似的方法產生病毒。
空白對照的構建實施例4CD質粒的構建為了測試穿梭載體系統的治療作用，使用大腸桿菌基因胞嘧啶脫氨基酶(CD)因為它具有前藥功效。從ATCC獲得CD(#40999，質粒pCD2)，并用下述方法從中擴增出CD基因。另外值得注意的是，CD基因中含有一個NdeI限制性位點，并且我們打算用這種特定的酶切割穿梭質粒中的NdeI位點，因此有必要用PCR誘變的方法除去CD中的NdeI位點。該技術與在E3區域中構建新的限制性位點的方法相同，使用高保真的Pfu聚合酶。表4給出的是用于擴增CD基因的寡核苷酸。
簡要地說，在NdeI位點進行保守突變，將堿基T變為C。第一輪PCR反應所用引物為CD-NdeC和SwaCDNC。用質粒pCD2作模板。用該產物加上同樣的模板和引物CD-PacC進行第二輪PCR反應。這樣可以實現兩個目標改變了NdeI位點，并且分別在5’和3’末端添加了位點PacI和SwaI。用PacI和SwaI切割該PCR終產物；再用PacI和SwaI切割切割穿梭載體pGE3SV。用Qiagen凝膠提取試劑盒凝膠純化上述片段，然后用NEB T4 DNA連接酶將其連接在一起。用連接混合物轉化大腸桿菌的XL-1菌株，并用含氨芐青霉素的平板進行鋪板篩選，挑取克隆并培養。分離DNA，然后限制性消化篩選驗證插入和缺失的正確性。然后通過完整的CD基因和周圍載體對表現出正確性的克隆進行測序，核實沒有發生任何不期望的突變。這種正確的并經過核實的克隆命名為pG-CDpacSwa，用于隨后的擴增插入其它區域的CD基因的PCR擴增反應中。值得注意的是，CD基因中含有一個細菌起始密碼子GTG。在所有引物中，該起始密碼子都被收入并被改變成真核密碼子ATG。
通過設計在5’和3’末端含有期望限制性位點的引物制備另一種含有CD的載體5’端引物總是含有ATG起始密碼子。利用下列限制性位點將該CD基因插入E3區域BstBI-StuI、NheI-MunI、NheI-PmeI、PacI-PmeI、SunI-MunI、ClaI-SwaI、以及BamHI-SwaI。這些質粒分別命名為pG-CDBstStu、pG-CDNheMun、pG-CDNhePme、pG-CDPacPme、pG-CDSunMun、pG-CDClaSwa、pG-CDBamSwa。使用的所有引物都列于表3，模板都是經確證的質粒pG-CDPacSwa。將ClaI-SwaI區域中的CD基因插入E35V+V質粒；將BamHI-SwaI區域中的CD基因插入E3SV+B質粒。對所有插入片段都完整測序以保證沒有不期望的突變發生而且CD正確的插入。
應注意到對于5’插入位點有三個，對3’插入位點有兩個可用于將基因插入6.7-gp19k區域。它們是SunI、PacI和NheI用于5’端，PmeI和MunI用于3’端。PacI和SunI位點與y先導序列重疊，y先導序列是用于晚期基因產物翻譯的重要序列。此序列的破壞可消除其對某些應用的作用。因此，將另一位點NheI插入，其不與y先導序列重疊。如果未見不利影響，則天然存在于Ad5中的SunI和MunI位點可使用，因為它們允許更大的克隆能力。
從用上述E3插入得到的病毒中可以預見出下述幾點。首先，如上所述，除去了y-前導序列部分的構建體，例如pG-CDSunMun，可能會對感染過程產生副作用。盡管y-前導序列幾乎沒有缺失，但是對于插入到PacI位點的基因確實也是這樣。另一點可以預見的是，11.6K區域中的插入片段，例如pG-CDBstStu，會使感染大大弱化。如公開文獻中所述，與野生型的感染不同，11.6K蛋白(ADP或腺病毒死亡蛋白)的缺失使得感染后的細胞不能在適當的時刻裂解。這種情況下，細胞繼續代謝，細胞中的病毒產物增高，細胞基本上已變成外源基因的工廠。另外，由于在感染晚期用主要晚期啟動子能夠大量合成ADP，所以希望插入到該區域中的外源基因也具有同樣的特性。用這些病毒得到的結果將在下文討論。
實施例5TNF質粒的構建含有鼠腫瘤壞死因子的質粒來源于ATCC(#63169)。該序列中含有包括編碼原序列的區域在內的完整mTNF基因。用PCR從該質粒中擴增出mTNF基因，并用凝膠純化。用BstBI和StuI切割pGE3SV，并用凝膠純化。同時，用ClaI和SwaI切割另一載體pG-E3SV+V，并用凝膠純化。將純化后的PCR產物插入到各自對應的載體中，由于末端匹配所以這種操作切實可行。這些構建體分別命名為pG-mTNFBstStu和pG-mTNFClaSwa。
再用ATCC質粒為模板，PCR擴增mTNF基因。用BarnH I和SwaI切割質粒pG-E3SV+B和PCR產物，凝膠純化，然后將它們連接在一起。該構建體命名為pG-mTNFBamSwa。對所有構建體進行粗略測序，檢查不期望的突變。
實施例6CD和TNF病毒的構建為了將上述構CD建體引入Ad5基因組，使用Ad5 TP-DNA。對于含有的TNF的病毒，使用BstLink TP-DNA，由于它具有某些優勢。用于這項操作的質粒載體Bstlink的有關描述參見實施例11。需要指出的是，所有轉染都使用6cm平板，而且一式兩份；本發明所述的量都是每個6cm平板的用量。
方法用下述方法制備病毒E3-CD-Pacpme(Onyx 301)、E3-CD-NhePme(Onyx 302)、E3-CD-SunMun(Onyx 303)、E3-CD-NheMun(Onyx 304)、E3-CD-BstStu(Onyx 305)以及E3-mTNF-BstStu(Onyx 320)首先，取0.5μg TP-DNA(對于CD病毒為Ad5，對于mTNF病毒為Bstlink)和10μg質粒，37℃下用EcoRI(20單位)切割5小時。(使用過量的質粒DNA以確保每次轉染都約有5μg真正的插入DNA)在這一點上，留下TP-DNA室溫過夜消化，切割后的質粒1％瓊脂糖凝膠電泳過夜。用Qiagen凝膠提取試劑盒凝膠純化上述插入片段。取用切割后的TP-DNA和純化后的片段，用高濃度的T4DNA連接酶(Boehringer Mannheim)16℃下過夜連接。將該反應混合物直接用于轉染。
對于構建病毒CDPacSwa、mTNFClaSwa、CDBamSwa、mTNFBamSwa、而言，由于E3區域中的這些突變位于EcoRI限制位點之外，所以使用同源重組的方法。DNA和TP-DNA的用量同上所述。用BstBI切割TP-DNA BstLink用于轉染。用SpeI和NdeI切割含CD的質粒，用PacI和Nde切割含mTNF的質粒。凝膠純化這些片段，并用水洗脫。就轉染而言，不進行任何處理，直接使用切割后的TP-DNA和純化后的片段。
轉染方法就轉染而言，在試驗前一天，用A549細胞在6cm平板上鋪板，以便在轉染當天細胞能夠鋪滿約70～80％。為了轉染這些細胞，制備兩種溶液并混合。溶液A含有連接混合物以及300μl OptiMEM(Life Technologies)/6cm平板。溶液B含有300μl OPtiMEM和13μl脂轉染胺試劑(Life Technologies)。將這兩種溶液加到一起，輕輕混合，然后室溫溫育30～45分鐘。溫育接近結束時，用溫的OptiMEM洗滌細胞，并向每種細胞中各加入2.4ml的OptiMEM。然后將這種最終的3ml混合物直接加入洗滌后的細胞單層，37℃下溫育5小時。然后，在不除去轉染混合物的情況下向每個平板中加入3ml含20％PBS的DME，使得最終的血清濃度為10％。37℃下溫育過夜。用8ml DME/2％FBS/1.0％優質瓊脂(agar noble)(Difco)覆蓋細胞。這次覆蓋5天后，加入另一層覆蓋物，這層覆蓋物中含有0.3％中性紅(Lifetechnologies)幫助顯色噬菌斑。
病毒突變體的繁殖和驗證當噬菌斑出現時(轉染后10～20天)，用無菌的巴斯德吸管吸取含有噬菌斑的瓊脂栓。為了繁殖上述瓊脂栓中的病毒，在前一天用DME/10％ FBS將A549細胞接種于3.5cm的平板上。感染的當天，培養基換成DME/2％FBS，將分離到的噬菌斑加到細胞上。每天檢查感染的CPE(細胞病變效應，即由于病毒的感染細胞變圓并從平板上脫落下來)，這種現象通常發生在感染后第3～5天。收集全部培養基及細胞，-20℃凍存。為了查實病毒的突變，取用200μl細胞及培養基的混合物，用Qiagen Blood試劑盒分離病毒DNA(以及細胞DNA)。使用對應于CD基因本身或側翼E3區域的引物，用PCR方法驗證純化的DNA。一旦重組病毒DNA的PCR反應生成大小正確的片段，另外的特征包括用限制位點切割PCR片段顯示出與CD或mTNF相同的模式，另外還對PCR產物測序。另外為確證收獲病毒的正確性，還進行了Hirt分析。
用從3.5cm平板上獲得500μl病毒懸液感染A549細胞的T150，擴大培養正確的病毒。大約3天后出現完整的CPE(此時約有75％以上的細胞不再貼附培養瓶表面)。然后，用這種細胞及培養基混合物7.5ml感染一3升轉瓶的KB細胞，產生的病毒進行CsCl分帶純化。進行噬斑試驗測定單位體積的感染顆粒。
采用這樣的方式命名病毒，即讓人們明顯地看出加入了什么樣的插入片段以及插入片段的位置。為了方便引用，還用數字來命名并置于括號中。它們的名稱為E3-CD-PacPme(Onyx 301)、E3-CD-NhePme(Onyx 302)、E3-CD-SunMun(Onyx 303)、E3-CD-NheMun(Onyx304)、E3-CD-BstStu(Onyx 305)、以及E3-mTNF-BstStu(Onyx 320)和E3-mTNF-ClaSwa(Onyx321)。
CD試驗為了檢驗胞嘧啶脫氨基酶(CD)的活性，進行類似Rogulski等人1997一文中描述的試驗。簡言之，用A549細胞接種10cm平板，以使得感染當天細胞達70～80％的融合度(每塊板上約2～4百萬個細胞)。每種E3-CD病毒，均按每個細胞10個pfu(噬斑形成單位)的MOI(感染復數)感染細胞。引入Ad5和感染模擬物作為對照。就感染而言，針對每個平板將適當體積的病毒懸于2ml DME，然后加到細胞單層上。1小時后，向每個平板加入8ml DME/2％ FBS培養基。感染后的不同時刻(4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、120小時)，清洗細胞，加入1ml預冷PBS，搗碎細胞(使用一次性細胞搗碎器)，于1.5ml微量離心管中沉淀。除去所有的PBS，用干冰/乙醇急驟-冷凍細胞沉淀，保存于-80℃。向每管沉淀中加入200μl試驗緩沖液(100mM TrisHCl(pH 8.0)、1 mM EDTA，1mM β-巰基乙醇)，凍融4個循環裂解細胞。4℃全速離心5分鐘，澄清溶胞產物。用Bio-rad試劑，通過Bradford試驗測定蛋白含量。就酶分析而言，從每個樣品中取5μg或0.6μg測定蛋白含量，使用2.5mM[2-14C]-胞嘧啶(1微居里；5微升；Moravek Biochemicals，#MC 131)并用試驗緩沖液使反應體積達到10μl。讓反應在37℃繼續進行1小時。為了使反應淬火，加入10μl冷的胞嘧啶/尿嘧啶(每份用量為0.4mg/ml)。每份樣品取10μl滴加到薄層層析板(Baker #7009-04)上，然后置于裝有1-丁醇-水(86％/14％)的平衡槽中。讓溶劑的前沿接近平板頂部(約2小時)后，干燥平板，然后曝光于膠片。然后將該放射自顯影圖掃描成圖形。鼠TNFα試驗用A549細胞接種6cm平板，以使得感染當天細胞達約80％的融合度。按上述方法以10 MOI的量實施感染。在感染后的不同時刻，除去培養基代之以3ml新鮮的DME/2％ FBS。讓反應在37℃繼續進行1小時。該間隔后，取出1ml的等分培養基，保存于-80℃直到所有樣品被收集。將培養基置于每個平板上以使在下一個時間點之前終體積為4ml。用ELISA試驗(Biosource #KMC3O12)測試分泌到培養基中的mTNF。每種樣品一式兩份進行測定，每個時間點從兩個不同平板的感染細胞中收集。Western 印跡分析就western印跡分析而言，用10 M.O.I.的量感染生長于6cm平板上的A549細胞。感染后的不同時刻，搗碎細胞并照上法收集。細胞沉淀凍存于-80℃。向每份樣品加入300ml裂解緩沖液，凍融3次，并通過一22號針頭。用Bradford試驗測定蛋白含量。將10μg的總蛋白上樣于14％ SDS凝膠，電泳。將蛋白轉印到PVDF轉印膜上，用3％脫脂乳PBS溶液封閉，加入適當抗體。抗E3蛋白和抗pVIII(一種在感染后期生成的蛋白質)的抗體是多克隆鼠抗體。抗體的使用濃度為1∶400。抗鼠TNF抗體來自R和D系統，使用濃度為0.1μg/ml。使用合適的二級抗體，用ECL系統(Amersham)顯色。
除對細胞溶胞產物進行western分析外，對每小時間隔收集的培養基也進行Western印跡分析，使用同樣的抗-mTNF抗體，每個泳道培養基的負載量為25μl。表4用來擴增CD和mTNF基因的寡核苷酸(5’→3’方向)。
實施例7CD或mTNF的病毒表達含CD的病毒E3-CD-PacPme(Onyx 301)、E3-CD-NhePme(Onyx302)、E3-CD-SunMun(Onyx 303)、E3-CD-NheMun(Onyx 304)也分別稱為301、302、303和304。取病毒301、302、303和304，各以10M.O.I.(感染復數)的量感染A549細胞系。在感染后(p.i.)的指定時間按照方法部分的描述收集樣品用于CD活性的分析。另外，在每個時間點，制備細胞圖片顯示表型差異。
圖8顯示的是模擬感染的對照物及Ad5-感染細胞，圖9顯示的是用帶有插入到gp19K區域的CD的病毒，即病毒301、302、303和304感染的細胞。野生型感染進展正常，在感染后48小時表現出近乎完整的CPE。304病毒感染后48小時表現出接近野生型水平的CPE，而303表現出些微的溫和感染。另兩個病毒301和302表現出中間表型。有趣的是，303是用SunI位點實施的CD取代，正如所料，該病毒的感染較野生型慢，這是由于y-前導序列的部分缺失，廢除了其中晚期信號的添加從而可能減弱其感染效力。病毒301和302較Ad5只是輕微滯后，這是由于y-前導序列在301病毒中大部分或者在302病毒中完全完整。
實驗表明插入到本發明所述E3病毒構建體中的外源基因的表達時間近似于它們所取代的內源基因。病毒301，302，303和304是gp19K的取代物。如圖10所示，Western印跡試驗表明，gp19K的合成開始于感染后4～8小時之間。這接近于公開的數值。Western印跡試驗顯示感染后48小時顯而易見。圖10還表明CD病毒不生成gp 19K，與預料符合，這是由于該基因被缺失。
為了核對CD首次表達時間，每個反應使用5μg總蛋白。結果見圖11。與gp19K一樣，病毒301～304中的CD活性都一樣早在感染后的8小時。這驗證了內源表達時間與插入的CD基因近似。
為了查明各個位置CD蛋白的合成量，每個反應使用0.6μg，結果見圖12。為了查明病毒之間相比底物的不完全轉化，使用更少量的蛋白質。圖12表明301，302和304合成了類似量的CD。另一方面，在約24小時Onyx303表現了底物的完全轉化，這表明出現了成比例增多的CD。因此，我們認為該病毒可能生成了較其它病毒更多的CD。為了確證剩余E3基因仍表達它們相應的蛋白質，以10個MOI用Ad5、Onyx303或Onyx304分別感染A549細胞，在多個感染后時間收集細胞。從細胞沉淀中收集蛋白質，凝膠電泳，轉染且利用合適的抗體以Westeon印跡分析。結果見圖16和19，分別對應于Ad5、和Onyx303和Onyx304。Onyx304產生野生型水平的E3蛋白質，即11.6k，14.5k和14.7k。有趣的是，Onyx303幾乎不產生11.6k，這可能是由于其減弱的表型。不拘泥于任何理論，我們認為由于y前導序列幾乎完全缺失(由于CD插入)，11.6k的信息不能充分翻譯。盡管Onyx303似乎合成Ad5野生型水平的14.7k，但是14.5k的水平和加工均改變。ADP疊換CD和mTNF如上所述，用CD或mTNF替換E3-腺病毒死亡蛋白(ADP)基因。現已知道，與野生型相比，ADP缺失后的病毒不能在預期時間裂解細胞。因此，認為該基因在病毒釋放中發揮重要作用。與ADP缺失病毒一樣，本發明所述的取代了該區域其它基因的病毒表現出類似的表型。結果見圖13和圖14。在感染后的72小時，當野生型感染表現出完整CPE時，病毒Onyx305(CD插入)和病毒Onyx320(mTNF插入)與Ad5相比，表現出明顯的減弱的CPE。但是該感染直到感染后的96小時仍不能達到完整的CPE(圖14)。如果每隔24小時更換一次培養基，所述細胞繼續吸附，并且甚至在感染后的120小時仍表現出幾乎完全正常的表型。直到感染后的164小時(7天)以后，細胞才明顯地表現出典型的CPE，脫離玻壁。這是一個重要的觀察結果，在治療觀念上很有意義，因為即使感染細胞不立即溶解，然而它們繼續表達目的性的異源基因。
ADP是一種由主要晚期啟動子合成的晚期蛋白，在晚期，也就是說，DNA復制后高水平表達。為了測定插入的外源基因是否表現類似動力學，用Onyx305進行CD試驗，用Onyx320測試mTNF。如圖11所示，直到感染后的12小時，Onyx305才表現出基本的CD活性，此時以后病毒已進入了晚期。圖11還對照了與早期區域gp19K中的CD對比的結果。很顯然在蛋白合成時間上存在著差異。
為了比較CD活性的量，用0.6μg的總蛋白在每一反應中進行CD試驗(圖15)。當用視覺檢查并與圖12(同一時間未作試驗)相比時，可以看出Onyx305合成的量根本不及Onyx301～304那么多。但是應該注意的是，Onyx305感染的細胞具有溫和的感染過程。因此重要地，將在相當長的時期內合成CD。
為了檢查晚期感染，用細胞裂解物進行western印跡分析，使用的抗體為抗一種晚期結構蛋白的抗體，pVIII和ADP(11.6K)。感染后的24小時，Ad5感染的細胞中可觀察到11.6K(圖16)和pVIII(圖18)這兩種蛋白的表達，也在Onyx320感染24小時后中觀察到pVIII表達(見圖18)。這表明該病毒在感染后12和24小時之間已進入晚期。另外還觀察到Onyx305不生成ADP，這在意料之中，因為它不含該基因(圖20)。
插入到ADP位置的CD表現出與ADP類似的時間。用Onyx 320進行類似觀察，Onyx 320在ADP位置中插入了mTNF。簡言之，感染細胞，并在感染后的不同時間制備溶胞產物。對這些溶胞產物進行Western印跡分析，用模擬感染的和Ad5-感染的細胞作對照。發現細胞內的mTNF表達直到感染后的24小時才被觀察到(圖21)。這與我們以前的下述發現一致取代內源性腺病毒基因的外源基因表現出類似的表達模式。
實施例8在Onyx320中mTNF表達與內源晚基因表達相應進行了額外的實驗以定量Onyx320的mTNF表達，并證實mTNF顯示了與11.6K類似的晚表達模式。
mTNF定量A549細胞用Onyx320以10個m.o.i.感染，在所示感染后時間收獲細胞。為測量mTNF的分泌，在所示時間前1小時更換培養液，并用5毫升新鮮培養替換。然后將新加入的等份在該小時之后移出，以獲得表示每小時產生的mTNF量的數據。作為對照，也進行了Ad5和模擬感染。圖20表示內源性E3基因11.6K的表達之時間和相對水平的Western印跡。基于這種分析的檢測極限以及在前公開的數據，在晚期感染開始后11.6K被大量合成。圖21表示胞內mTNF的Western印跡。這是該分子的27kD未切割形式。見Kriegler等，細胞，1988，4月8日，53(1)45-53。就11.6K蛋白而言，由此區域表達的mTNF被優勢合成且在感染晚期被檢測。
圖22所示的時間點前一小時中間分泌到培養液中的mTNF的Western印跡分析。在凝膠上上樣25微升得到此結果。這再次表明mTNF的可檢測水平在感染后的晚期產生。此外產生的mTNF適當地被切割如其在凝膠中顯示的具有預期的分子量17kD。此印跡也顯示從頭(de novo)合成在高達感染后144小時仍產生。
為確定分泌的mTNF的量，在1小時時間點收集樣品等份，利用市售ELISA試劑盒可定量mTNF。圖23顯示4個不同試驗的結果，結果表示為每百萬細胞每小時產生的mTNF的量。如圖所示，感染的細胞表達最高量的mTNF實際上，在最高的產生期間檢測到約43-68納克。
為解決其余的E3蛋白質表達的問題，進行了Western印跡分析以檢測Onyx320和Ad5感染的細胞之gp19K，14.5K和14.7K。如圖24所示，Onyx320合成了與E3基因的Ad5類似水平的gp 19K，14.5K和14.7K；但是，14.5K的加工不同。
作為晚期蛋白質表達的mTNF腺病毒晚期蛋白質表達的一個重要特征是其依賴于病毒DNA合成。因此，經典的實驗顯示真正的晚期蛋白質表達以證實在存在araC(DNA復制抑制劑)下是否表達。圖17顯示在用Ad5感染的細胞中存在或不存在araC時gp19K，14.5K和14.7K的表達。注意到晚期蛋白質11.6K不表達或幾乎沒有可檢測的表達。因此，為鑒定當插入11.6K處mTNF是否顯示晚期蛋白表達模式，進行如下實驗以測量在araC存在下的表達。圖25顯示，在araC存在下胞內mTNF不表達，相反地不存在時表達，這表明mTNF實際上顯示晚期蛋白質表達模式。作為對照，圖27顯示早期蛋白質gp19K在存在araC時均由Ad5(也見圖17)和Onyx320(感染的細胞)合成。最后，進行了另一組對照實驗，以證實Onyx320感染在不存在araC時真正到達晚期。再次利用Western印跡分析對另一種已知晚期蛋白進行分析。圖26顯示在存在araC時pVIII不表達，而在不存在時表達。這進一步支持了mTNF作為真正的晚期蛋白表達。注意到圖26也顯示了在Onyx304和Onyx305中的pVIII表達模式，用這些病毒的結果與用Onyx320觀察到的類似。
實施例9Onyx321的E3B區域的mTNF表達如上述，Onyx321具有完整的利用構建的位點ClaI和SwaI用mTNF替換的E3B區域。進行實驗以確定由病毒的此區域之mTNF的表達性質。以MOI為10感染A549細胞，在所示的感染后時間照相(圖28)。在48小時時間點，Onyx321顯示比在相同感染后時間點的野生型的CPE較高。
此外，用其余E3蛋白質分析mTNF表達。這些印跡顯示于圖29和30。圖29中，mTNF的表達直到感染后24小時方可檢測到，與其中兩個基因(即14.7K，14.5K)被替換的不同，它們在大約感染后8-12小時出現。在這種情況中，可檢測的mTNF表達比內源基因表達晚，因為有3個基因與內源剪接信號一起被移出。圖30顯示盡管gp19K表達仍保持與Ad5類似，由Onyx321的11.6K之表達大大增強。不寄希望于借助任何具體理論，可推測這正是圖28中所見的CPE增強之表現的原因。
由于mTNF在感染后24小時以后出現，引起了它是否是作為晚期蛋白質表達的疑惑。為證明這一點，將araC加入培養液中，利用Western印跡分析細胞裂解物。結果顯示于圖31和32。位于E3B的鼠mTNF似乎是真正的晚期蛋白質，因為其表達依賴于DNA復制。作為對照，gp19K的表達在存在araC時可繼續，而11.6K的表達不行。這代表了另一個用于插入轉基因的區域，我們希望其在感染晚期呈優勢表達。
實施例10含有用于趨化因子基因之病毒的制備趨化因子hMCP3-α和hMIP3α的基因被插入到6.7K/gp19K區域，制備病毒。具體的，用于PCR擴增這些基因的寡核苷酸列于表4；每一這些基因均用在5’端的NheI位點和在3’端的MunI位點擴增。MCP3-α基因從ATCC以EST形式獲得(EST #113153)，和MIP3α的EST從Genome Systems(Image #485989)獲得。用于插入的質粒為pG-E3SV；將質粒和PCR產物均用NheI和MunI切割。所有片段凝膠純化。然后將每一趨化因子插入各個載體中。利用這些構建體如上述制備病毒。將病毒噬斑純化，并用上述方法證實。
實施例11BstLink病毒/TP-DNA的構建將目標基因插入腺病毒基因組是個復雜的方法。其包括首先克隆入較小的質粒，然后將其加入較大的基于pNB的載體。理想地，可直接使用較小的質粒。但是，將其用于病毒構建的共轉染是困難的，因為它僅允許有限量的同源重組所必需的重疊序列。例如，當用EcoRI(標準方法)切割TP-DNA時，在質粒pSN和基因組病毒DNA的5’末端之間僅有240堿基對序列上的重疊。因此，為增加重疊區域，如下產生了一種稱為BstLink的病毒。利用質粒pG-Bst-Stu是因為其缺失了11.6K的死亡基因，如果用于產生病毒，該基因會導致產生非常小的噬斑。因此，用MunI消化該質粒，用T4 DNA聚合酶填平，然后通過連接加入BstBI接頭。選擇限制酶切位點BstBI是因為其在Ad5基因組的任何其他地方均不存在。將E3區域不帶有11.6K且含有額外位點BstBI的片段構建入Ad5基因組(此方法適用于任何腺病毒，或其他存在死亡基因的病毒)。從病毒制備的TP-DNA可用于病毒構建。這是通過用BstBI切割TP-DNA，并與帶有期望的改變之E3質粒共轉染完成的。因此，當選擇應當含有11.6K基因(或其他死亡基因)的重組病毒噬斑時，野生型(小噬斑)和重組體(大噬斑)的表型差異可方便篩選重組體。此外，這使在5’末端的同源性增加到2273堿基對；因此可利用重疊重組產生E3病毒突變體。同樣，重組體病毒基于表型差異更容易篩選。仍舊需要篩選噬斑中的突變體，但是由于篩選正確構建體的便利使得推定為正確的病毒克隆的比例較高。
本發明在此完全公開，對于本領域普通技術人員而言任何不偏離本發明所附權利要求的精神和范圍之對本發明的修飾或改變均是顯而易見的。
權利要求
1.一種含有重組腺病毒載體的物質組合物，所述腺病毒載體在E3區域中含有可促使E3區域或其中所含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點。
2.權利要求1中所述的物質組合物，其中所述的重組腺病毒載體在編碼6.7k和gp 19k蛋白的E3區域早期區域基因中含有限制位點。
3.權利要求1中所述的物質組合物，其中所述的重組腺病毒載體在編碼10.4k、14.5k、14.7k和11.6k蛋白的E3區域早期區域基因中含有限制位點。
4.一種含有重組腺病毒的物質組合物，所述腺病毒在E3區域中含有可促使E3區域或其中所含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點。
5.一種含有重組腺病毒的物質組合物，所述腺病毒在E3區域中含有可促使E3區域或其中所含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點，所述選擇基因編碼6.7k和gp19k蛋白。
6.一種含有重組腺病毒的物質組合物，所述腺病毒在E3區域中含有可促使E3區域或其中所含的選擇基因部分或全部缺失的限制位點，所述選擇基因編碼10.4k、14.5k、14.7k和11.6k蛋白。
7.一種含有重組腺病毒載體的物質組合物，所述腺病毒載體選自pE3SV、pE3SV+V、pE3SV+B和pE3SV+V+B。
8.一種含有腺病毒的物質組合物，所述腺病毒選自E3SV、E3SV+V、E3SV+B和E3SV+V+B。
9.權利要求1中所述的物質組合物，其中所述的部分或全部缺失的E3區域被編碼異源蛋白的基因所取代，并且所述基因任選地可操作地連接到組織特異性啟動子上。
10.權利要求1中所述的物質組合物，其還在所述腺病毒載體的E1A或E1b區域中包含一處缺失，其中所述的E1b區域編碼一55k蛋白質。
11.權利要求10中所述的物質組合物，其中所述的Elb或E1A區域缺失被編碼異源蛋白的基因所取代。
12.權利要求9或11中所述的物質組合物，其中所述的異源蛋白選自腫瘤壞死因子α、干擾素γ、白介素、細胞自殺蛋白以及mip-3。
13.權利要求9中所述的物質組合物，其中所述的異源蛋白是一種負選擇基因。
14.權利要求13中所述的物質組合物，其中所述的負選擇基因選自胞嘧啶脫氨基酶和胸腺嘧啶激酶。
15.含有權利要求7中所述腺病毒載體的細胞。
16.含有權利要求8中所述腺病毒的細胞。
17.一種用于治療哺乳動物癌癥的方法，所述治療方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的權利要求9或11所述的組合物，其中所述的異源蛋白具有抗腫瘤活性。
18.權利要求17中所述的方法，其中所述的異源蛋白選自腫瘤壞死因子α、干擾素γ、白介素、細胞自殺蛋白以及mip-3。
19.權利要求18中所述的方法，該方法進一步還包括將所述組合物用于化療或免疫抑制。
20.一種含有重組腺病毒載體的物質組合物，其中所述腺病毒載體在E3區域中含有可促使在該E3區中所含的選擇基因缺失的限制性位點，并由此替換與該缺失的基因顯示類似的表達模式之異源基因。
全文摘要
本發明公開了腺病毒載體,包括突變腺病毒,所述腺病毒載體的E3區域中含有可使該區域,或者其中含有的選擇基因部分或全部缺失的限制位點,以及如有必要,取代外源基因的組合物和方法,該外源基因將會表現出在時間的選擇和表達程度方面都類似于其所取代的內源腺病毒基因的表達模式,并且進一步可任選地包括該腺病毒基因組中其它部分的突變,包括E1B或E1A區域,所述腺病毒載體可以用于診斷或治療疾病,優選涉及多余細胞生長的疾病,包括癌癥。
文檔編號A61K35/76GK1357050SQ00809311
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月28日 優先權日1999年7月2日
發明者T·赫米斯頓, L·K·豪金斯, L·約翰遜 申請人:昂尼克斯藥物公司