一種可用于艾滋病基因治療的CRISPR/SaCas9系統的制作方法
【技術領域】
[00011本發明屬于基因工程領域，更具體地說涉及CRISPR/SaCas9特異性敲除人CCR5基 因的方法以及用于特異性靶向CCR5基因的sgRNA。
【背景技術】
[0002] 人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)歸屬于逆轉錄病毒科 慢病毒屬中的人類慢病毒組，其感染引起的獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是目前威脅全球人類健康的主要疾病之一。人類免疫 缺陷病毒通常也俗稱為"艾滋病毒"，截止到2014年底，艾滋病毒攜帶者多達3690萬人。自 1981年發現第一例由HIV引起的艾滋病的25年以來，盡管對艾滋病的臨床治療已有了很大 進展，但是仍無有效治愈手段攻破此科學難題。
[0003] 病毒特異的⑶4+T細胞是針對HIV免疫應答的重要組成部分，也是HIV-1感染過程 的首要靶點。自1984年發現HIV-1通過與⑶4結合感染宿主細胞，隨后研究又發現僅有⑶4分 子并不能介導HIV-1的侵入，同時還需要一種或幾種輔助受體。1996年證實，趨化因子受體 CXCR4和CCR5是HIV-1感染的輔助受體。其中，趨化因子CCR5,作為G蛋白偶聯因子超家族 (GPCR)成員的細胞膜蛋白，是HIV-1入侵機體細胞的主要輔助受體之一。一個接觸HIV但未 檢測到HIV感染的個人，帶有CCR5編碼基因32個核苷酸缺失，表明了 CCR5影響HIV病毒入侵 細胞。因而以CCR5為靶點的HIV-1受體拮抗劑越來越受關注，主要有趨化因子衍生物、非肽 類小分子化合物、單克隆抗體、肽類化合物等。這些抗病毒活性強、親和力高的CCR5拮抗劑， 已有一部分進入了臨床試驗階段。
[0004] 盡管輔助受體拮抗劑可有效預防HIV-1感染，遏制艾滋病的流行，但是此類抑制劑 的發展也面臨著挑戰。長期使用一種抑制劑，最終會使HIV-1產生耐藥性。隨著耐藥性的不 斷出現，使得現有的抗HIV-1藥物難以達到理想的治療效果。因此，從基因組層面失活CCR5 具有重要的治療價值，這樣，特異性靶向CCR5引起了人們的廣泛關注。
[0005] 2008年，Sangamo成功的利用Engineered zinc finger nucleases(ZFNs)在CD4+T 細胞上實現CCR5的敲除，如今這項名為SB-728-T的項目已被嘗試應用于HIV感染人群的基 因治療，并已進入臨床二期階段。這一基因編輯產品通過敲除分離到的病人的CD4+T細胞的 CCR5，然后自體回輸到病人，可以用于HI V感染的治療。越來越多的實驗結果表明CCR5基因 是一個可靠、高效和安全的治療HIV的靶點，能夠實現CCR5在基因組層面上的敲除也是可 靠、高效和安全的治療方法。然而，即使在經過真核抗性篩選之后，ZFN祀向敲除CCR5的效率 也只有大約為30%。很明顯，這個效率還是差強人意。
[0006] 1987年，日本研究員在試驗中發現大腸桿菌中存在串聯間隔重復序列DNA，但是并 不知道它們具體的功能。經過深入的研究發現，這是廣泛存在于細菌和古生菌中的一種序 列，最終在2002年將其正式命名為規律成簇間隔短回文重復系統CRISPR(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)。在2007年，研究者發現細菌可以 利用CRISPR系統抵抗噬菌體的入侵，接著又有研究發現細菌的CRISPR系統能夠阻止外源質 粒的侵入，由此可見這種存在于大多數細菌和所有古生菌中的特殊的DNA重復序列在獲得 性免疫系統發揮著重要的作用。
[0007] CRISPR主要有3部分組成，其包括一個前導區（Leader)、多個短而保守的重復序列 區（Repeat)和多個間隔區（Spacer)。前導區是位于CRISPR簇的上游，是富含AT長度300-500bp的區域，被大多數人認為是啟動子序列；重復序列區是長度為21-48bp為的含有回文 序列的堿基，其可形成發卡結構，而重復序列間又被26-72bp間隔區堿基序列隔開；間隔區 主要有外源的DNA序列組成，其類似于記憶性的免疫，當含有相同序列的外源DNA再次入侵 機體時，就可被自身機體識別，然后對外源DNA進行切割使之不能表達，以保護自身不被外 源病毒或細菌所侵害，因此，正是這些間隔序列發揮著對靶基因的識別作用。研究人員對 CRISPR進一步研究發現，其側翼序列附近存在一個多態性家族基因，該基因編碼的蛋白質 存在能與核酸相互作用的功能域，此功能域具有整合酶、核酸酶、聚合酶等酶活性，與 CRISPR區域共同起作用，被命名為CRISPR關聯基因（CRISPR-associated)，縮寫為CasXas 系統有type I，II，III型，其中typell中含有一個特殊的蛋白Cas9，Cas9靶向切割DNA是通 過CRISPR系統中的兩種小RNA-crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activatig crRNA) 和靶序列互補識別的原理實現的。現在已經把兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA (single guide RNA) <Xas9和CRISPR形成復合體識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造 成雙鏈DNA斷裂，在沒有模板的條件下，發生非同源重組末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)，造成移碼突變，導致基因敲除（Wiedenheft，Sternberg et al · 2012，Cong， Ran et al.2013，F.Ann Ran et al.2015)。
[0008] 這一技術由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關 注，在2012年開始像爆炸一般流行開來。研究人員優先選擇改造了來自化膿鏈球菌的Cas9 酶(SpCas9)來改變高等生物的DNA，并已成為一系列高度通用的基因組修飾技術的基礎。之 前的一些研究利用CRISPR/SpCas9系統在CD4+T細胞或者CD34+干細胞對艾滋病毒的輔助受 體CCR5進行基因修飾，在一定的程度上可以抑制HIV-1病毒的侵入，但是也存在著一定的脫 革巴率（Cradick，Fineet al.2013，Ye，Wang et al.2014)〇
[0009] 最近發現了一種新的CRISPR/Cas9系統，它是一種是來自金黃色葡糖球菌的Cas9 酶(SaCas9)，其基因敲除效率與之前的CRISPR/SpCas9系統相當，但是其大小卻減少了 25% (F.Ann Ran et al.2015)。腺相關病毒(AAV)是基因治療的最佳載體，但是由于其負載能力 有限，使其包裝SpCas9酶和其他必須的基因元件進入單個病毒顆粒存在一定的難度，而 SaCas9的出現為這一問題的解決帶來了新的希望。
[0010] SaCas9與SpCas9存在著不同之處，SaCas9主要識別5'-NNGRRT-3'特征區域的 NGGRRT位點，然后對與sgRNA互補的DNA序列進行剪切，被剪切后斷裂的DNA雙鏈通過非同源 末端直接連接（non-homologous end joining，NHEJ)或者同源重組（homology-directed repair，HDR)的修補方法進行修復，修復后的DNA會由于某些堿基的隨機插入、缺失、突變等 使基因的序列發生改變從而抑制了基因的表達，由此在DNA水平上對基因進行定向敲除。而 SpCas9的識別位點為PAM序列5' -NGG-3'，然后再對靶位點進行剪切。
[0011] 新發現的SaCas9與之前的SpCas9相比具有很多優點：l)SaCas9在哺乳動物體內具 有很高的剪切效率，其所帶有的sgRNA的長度范圍為21-23個堿基，其本身的大小比SpCas9 小25%，更有利于AAV載體攜帶其它相關基因進入單個病毒顆粒，經驗證其與SpCas9可以達 到相當的效率。2)在SaCas9系統中，把其sgRNA的第一個堿基替換成鳥嘌呤，使得SaCas9酶 的活性大大提高，從而提高了其在機體內的剪切效率。3)SaCas9在靶向精確性上效率更高。 [0012]目前還沒有針對HIV-ι的輔助受體CCR5進行特異性敲除的CRISPR/SaCas9系統。 [0013] 參考文獻：
[0014] 1·Yuan，J·，J·Wang，K·Crain，C·Fearns，K.A.Kim，K.L.Hua，P·D·Gregory， M.C.Holmes and B·E·Torbett(2012)·〃Zinc_finger nuclease editing of human cxcr4promotes HIV-1CD4( + )T cell resistance and enrichment."Mol Ther 20(4): 849-859
[0015] 2.Ye,L.,J.ffang,A.I.Beyer,F.Teque,T.J.Cradick,Z.Qi,J.C.Chang,G.Bao, M.0.Muench，J.Yu，J.A.Levy and Y.W.Kan(2014),Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32mutation confers resistance to HIV infection.〃Proc Natl Acad Sci USA
[0016] 3.Tebas，P.，D.Stein，W.W.Tang，I.Frank，S·Q·Wang，G·Lee，S·K·Spratt， R.T.SuroskyjM.A.GiedlinjG.Nichol,M.C.Holmes ,P.D.Gregory,D.G.Ando,M.Kalos, R.G.Collman,G.Binder-Scholl,G.Plesa,ff.T.Hwang,B.L.Levine and C.H.June(2014).^ Gene editing of CCR5 in autologous CD4T cells of persons infected with HIV.〃N Engl J Med 370(10):901-910.
[0017] 4.Hsu，P.D.，E.S.Lander and F.Zhang(2014)."Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering."Cell 157(6):1262-1278
[0018] 5.Mitsuyasu，R.T.，T.C.Merigan，A.Carr，J.A.Zack，M.A.Winters，C.Workman， M.Bloch，J.Lalezari，S.Becker，L.Thornton，B.Akil，H.Khanlou，R·Finlayson， R. McFarlane,D.E. Smith,R.Garsia,D.Ma,M.Law,J.M.Murray,C. von KallejJ.A.Ely, S. M. Patino , A.E.Knop,P. Wong , A.V. Todd,M.Haughton,C.Fuery,J.L.Macpherson, G.P.Symonds,L. A. Evans ,S.M.Pond and D. A.Cooper(2009).^Phase 2gene therapy trial of an anti-HIV ribozyme in autologous CD34+cells."NatMed 15(3):285-292.
[0019] 6·Cong，L·，F·A·Ran，D.Cox，S.Lin，R.Barretto，N·Habib，P·D·Hsu，X·Wu， ff.Jiang,L.A.Marraffini and F.Zhang(2