本發明屬于生物醫藥技術領域，尤其涉及lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應用。

背景技術：

胃癌是世界上最常見的消化系統惡性腫瘤之一，統計顯示70％的胃癌患者屬于發展中國家；其中，將近半數的胃癌患者屬于東亞亞國家，特別是中國。胃癌病因復雜，其涉及的因素有幽門螺桿菌感染、飲食、環境致癌物暴露和遺傳易感性等；環境致癌物被認為是導致胃癌發生最重要的因素之一。

n-亞硝基化合物(nocs)是一類與胃癌發生相關的強致癌物質，生活中主要來源于各類腌制物、煙熏物或由內源性形成。n-甲基-n′-硝基-n′-亞硝基胍(mnng)作為n-亞硝基化合物的一種，是公認廣泛存在環境中的化學誘變劑和致癌劑。雖然目前人們已構建mnng誘導胃癌的動物模型和細胞模型，使胃癌的研究取得一定的進展，但mnng涉及的胃癌機制仍需進一步明確。

過去，化學致癌物誘發胃癌的機制研究主要針對編碼基因，近年隨著高通量測序等生物技術的發展，非編碼rna與化學致癌物誘發胃癌的關聯逐漸受到人們的重視。長鏈非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)是一類長度大于200核苷酸的非編碼rna。lncrna是一類重要的基因表達調控元件，能在多種水平(表觀遺傳、轉錄和轉錄后等)調控基因的表達，且與多種疾病密切相關，如腫瘤的發生、發展、凋亡、遷移和粘附等。根據lncrna在腫瘤發生中的作用，目前分為致癌作用的lncrna和抑癌作用的lncrna。

胃癌已成為當今社會的疾病難題，早期的臨床診斷和預后有利于胃癌的治療，同時胃癌的治療藥物有待于進一步研發。因此，有必要將lncrna與胃癌相結合，為胃癌的診斷、預后以及治療提供新的治療思路。

技術實現要素：

本發明目的在于克服現有技術存在的不足，而提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應用。為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：lncrnaenst00000424523.1及其基因在篩選或制備胃癌臨床診斷或預后的芯片、制劑或試劑盒中的應用，lncrnaenst00000424523.1的基因序列號為loc101927497。

另外，本發明還提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在篩選或制備胃癌治療藥物中的應用，lncrnaenst00000424523.1的基因序列號為loc101927497。

另外，本發明還提供檢測lncrnaenst00000424523.1的試劑在篩選或制備胃癌臨床診斷或預后的芯片、制劑或試劑盒中的應用。

另外，本發明還提供一種胃癌臨床診斷或預后的芯片、制劑或試劑盒，包括測定lncrnaenst00000424523.1轉錄量的特異性引物，所述特異性引物包含如seqidno.1和seqidno.2所示的dna序列。

本發明首先通過高通量測序rna-seq證實lncrnaenst00000424523.1的基因(loc101927497)在胃癌細胞和陰性細胞中的轉錄存在差異，并制備了檢測lncrnaenst00000424523.1的特異性引物，可以用來作為胃癌的臨床診斷和預后的標記物。

另外，本發明還提供lncrnaenst00000424523.1促進劑在篩選或制備胃癌治療藥物中的應用。

作為上述技術方案的改進，所述lncrnaenst00000424523.1促進劑包含促進基因loc101927497過表達的質粒，所述質粒含有基因loc101927497的dna序列。

本發明構建基因loc101927497過表達的質粒，并設計合成出基因loc101927497的sirna，實驗發現：在ges-1-t(惡性轉化的人胃粘膜細胞)和mkn-28(胃癌細胞)兩種細胞中，上調表達lncrnaenst00000424523.1能抑制胃癌細胞增殖，下調表達lncrnaenst00000424523.1能促進胃癌細胞增殖。

另外，本發明還提供一種胃癌的治療藥物，所述治療藥物包含lncrnaenst00000424523.1促進劑。

作為上述技術方案的改進，所述lncrnaenst00000424523.1促進劑包含促進基因loc101927497過表達的質粒，所述質粒含有基因loc101927497的dna序列。

作為上述技術方案進一步地改進，所述治療藥物還包含藥學生上可接受的載體。

在上述技術方案中，“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質、包衣料、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。藥學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一個或多個以及它們的組合。在很多情況下，優選的是將等滲劑例如糖、多元醇或氯化鈉包括在組合物中。藥學上可接受的載體還可包含少量的能提高抗體或抗體部分的貨架期或有效性的輔助物質，如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。

另外，本發明還提供一種基因loc101927497的sirna，所述sirna為sirna-1、sirna-2或sirna-3，所述sirna-1由如seqidno.3和seqidno.4所示的rna序列組成，所述sirna-2由如seqidno.5和seqidno.6所示的rna序列組成，所述sirna-3由如seqidno.7和seqidno.8所示的rna序列組成。

本發明的有益效果在于：本發明提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應用，本發明首先通過高通量測序rna-seq證實lncrnaenst00000424523.1的基因(loc101927497)在胃癌細胞和陰性細胞中的轉錄存在差異；并制備了檢測lncrnaenst00000424523.1的特異性引物，可以應用于胃癌的臨床診斷和預后；rna-seq數據及qrt-pcr數據都顯示：lncrnaenst00000424523.1在惡性轉化的胃粘膜細胞ges-1-t和胃癌細胞(mkn-28、mgc-803)中均表達下調，上調表達lncrnaenst00000424523.1能抑制胃癌細胞增殖，下調表達lncrnaenst00000424523.1能促進胃癌細胞增殖；由此可見，lncrnaenst00000424523.1及基因可應用于胃癌的臨床診斷、預后和治療。

附圖說明

圖1為ges-1-t細胞和ges-1-n細胞的高通量rna-seq測序結果圖；圖1a顯示兩種細胞差異表達的lncrna，圖1b顯示兩種細胞差異表達的mrna；圖中，差異表達lncrna和mrna用圓圈標出；

圖2為驗證lncrna的差異表達的統計圖；圖2a顯示ges-1-t細胞和ges-1-n細胞中lncrna表達量，en～452050.1為enst00000452050.1的縮寫，en～435695.1為enst00000435695.1的縮寫，en～424523.1為enst00000424523.1的縮寫；圖2b顯示ges-1細胞、mkn-28細胞和mgc-803細胞中lncrnaenst00000424523.1相對水平；圖中，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

圖3顯示上調lncrnaenst00000424523.1的表達對胃癌細胞增殖的影響；圖3a顯示導入過表達載體pcdna-loc101927497的ges-1-t細胞和mkn-28細胞中lncrnaenst00000424523.1的相對表達量；圖3b顯示導入過表達載體pcdna-loc101927497的ges-1-t細胞和mkn-28細胞的增殖得到抑制；圖中，pcdna-lncrna為導入基因loc101927497的過表達載體，pcdna3.1為陰性對照；

圖4顯示顯示下調lncrnaenst00000424523.1的表達對胃癌細胞增殖的影響；圖4a顯示轉染sirna的ges-1-t細胞和mkn-28細胞中lncrnaenst00000424523.1的相對表達量；圖4b顯示轉染sirna的ges-1-t細胞和mkn-28細胞的增殖得到促進；圖中，sirna為陰性對照。

具體實施方式

為更好地說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例、附表和附圖對本發明作進一步說明。

實施例1高通量rna-seq測序結果分析，mnng處理的ges-1-t細胞會產生差異表達的lncrna

方法：以mnng誘導的惡性轉化人胃粘膜細胞ges-1-t(t：轉化)及dmso處理的陰性對照細胞ges-1-n(n：正常)為實驗對象，通過高通量rna-seq測序技術，分析兩種細胞中lncrna及mrna的表達差異。分析ges-1-t和ges-1-n細胞中的lncrna表達量，以表達差異倍數在2倍以上或0.5倍以下、p<0.05為標準確定差異表達的lncrna，以同樣的標準確定差異表達的mrna。

結果：通過分析發現，ges-1-t細胞中檢測出lncrna17626個，ges-1-n細胞中檢測出lncrna17916個。ges-1-t細胞中較ges-1-n細胞中具有表達差異的lncrna有253個，其中表達上調的lncrna有94個，表達下調的lncrna有159個(如圖1a所示)；同時也發現，兩種細胞中有表達差異的mrna共751個，其中表達上調的mrna有244個，表達下調的mrna有507個(如圖1b所示)。如表1所示，列出ges-1-t細胞中下調最明顯的3個lncrna。

表1

實施例2lncrnaenst00000424523.1在ges-1-t細胞和胃癌細胞中低表達

方法：為了進一步尋找在mnng誘導ges-1細胞惡轉中可能發揮作用的lncrna，我們從具有表達差異性的lncrna中選取變化差異較顯著的3個lncrna，用qrt-pcr的方法在ges-1-t細胞與ges-1-n細胞中檢測其表達水平。此外，我們還通過qrt-pcr檢測了胃癌細胞mkn-28和mgc-803中lncrnaenst00000424523.1的表達。qrt-pcr所使用的lncrna以及內參gapdh引物序列如表2所示，表2中forward為正向引物，reverse為反向引物；lncrnaenst00000424523.1的cdna引物序列forward-aatgcttggaatgtgggagc(如seqidno.1所示)，reverse-ggcagctttcaggggtttta(如seqidno.2所示)。

結果：分析變化差異較顯著的3個lncrna，從檢測結果中我們發現lncrnaenst00000424523.1，其ncbi基因號為loc101927497，是一個未曾被研究的lncrna。與ges-1-n細胞相比，lncrnaenst00000424523.1在ges-1-t中的表達明顯下調(foldchange＝0.3974799±0.26，p<0.05)(如圖2a所示)；lncrnaenst00000424523.1在mkn-28、mgc-803這兩種胃癌細胞中同樣表現為低表達水平(如圖2b所示)。這些結果表明，lncrnaenst00000424523.1在mnng誘導的惡轉細胞ges-1-t和胃癌細胞株中均表達下調，基因loc101927497有可能作為抑癌基因在mnng誘導胃癌過程中發揮重要作用。

表2

實施例3上調lncrnaenst00000424523.1的表達抑制胃癌細胞的增殖

方法：為了探討基因loc101927497在mnng誘導胃癌過程中的功能，通過構建過表達載體pcdna-loc101927497，研究基因loc101927497在惡性轉化胃癌細胞ges-1-t和胃癌細胞系mkn28中的作用。用pcdna-loc101927497分別轉染ges-1-t和mkn-28細胞，48小時后，用qrt-pcr法檢測lncrnaenst00000424523.1的過表達效果，并用cck-8試劑盒檢測過表的lncrnaenst00000424523.1對胃癌細胞增殖的影響。

結果：轉染pcdna-loc101927497后，lncrnaenst00000424523.1的表達水平在ges-1-t和mkn-28細胞均有明顯上調(如圖3a所示)；其次，過表達的lncrnaenst00000424523.1明顯削弱ges-1-t細胞和mkn-28細胞的增殖(如圖3b所示)。該結果表明上調lncrnaenst00000424523.1的表達水平對胃癌細胞的增殖能力有明顯抑制作用。

實施例4下調lncrnaenst00000424523.1的表達促進胃癌細胞的增殖

方法：用sirna干擾lncrnaenst00000424523.1的表達，檢測對ges-1-t細胞和mkn-28細胞增殖的情況。合成了3條特異性sirna：sirna-1、sirna-2、sirna-3(如表3所示)，用3條sirna分別轉染ges-1-t細胞和mkn-28細胞，48小時后，用qrt-pcr檢測lncrnaenst00000424523.1的表達水平以驗證sirna的干擾效果，并進一步用cck-8試劑盒檢測下調表達的lncrnaenst00000424523.1對胃癌細胞增殖的影響。

結果：轉染3條sirna后，lncrnaenst00000424523.1的表達水平在ges-1-t細胞和mkn-28細胞中均有明顯下降(如圖4a所示)；敲低lncrnaenst00000424523.1的表達后，ges-1-t和mkn-28細胞增殖能力顯著增強，且mkn-28細胞較為明顯(如圖4b所示)。

表3

最后所應當說明的是，以上實施例用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者同等替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。

序列表

<110>廣州醫科大學附屬第五醫院

<120>lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應用

<130>2017.7.3

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aatgcttggaatgtgggagc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggcagctttcaggggtttta20

<210>3

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>3

ccuaggagauuucaguaaauu21

<210>4

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>4

uuuacugaaaucuccuagguu21

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>5

gccugccacuuaccuuaaauu21

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>6

uuuaagguaaguggcaggcuu21

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>7

ccugccacuuaccuuaaauuu21

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>8

auuuaagguaaguggcagguu21