一種用于基因治療的基因載體系統及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于基因治療的基因載體系統及其制備方法和應用。所述基因載體系統包括金納米顆粒和與所述金納米顆粒相連的三螺旋形成寡核苷酸，所述金納米顆粒的粒徑為1-6nm，所述三螺旋形成寡核苷酸能夠與靶基因上的序列結合而沉默所述靶基因。本發明的基因載體系統中，金納米顆粒對三螺旋形成寡核苷酸具有保護作用，能夠保護其免于DNA酶降解，因此是一種能夠用于基因治療的良好的基因載體系統，可應用于臨床基因治療。本發明還提供所述基因載體系統的制備方法和應用，其制備方法簡單易行，不涉及復雜的操作和苛刻條件，并且成本較低。
【專利說明】一種用于基因治療的基因載體系統及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因治療【技術領域】，尤其涉及一種用于基因治療的基因載體系統及其 制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 從廣義說，基因治療包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術。其中， 將特定的反義核酸（反義RNA、反義DNA)和核酶導入細胞，在轉錄和翻譯水平阻斷某些基因 的異常表達，而實現治療的目的方法，可稱為基因沉默。
[0003] 基因治療都需要將外源基因導入細胞內，其轉移方法較多，常用的要有下列幾類： 1)化學法：將正常基因 DNA(及其拷貝）與帶電荷物質和磷酸鈣、DEAE-葡萄糖或與若干脂 類混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，直接傾入培養基中與細胞接觸，由于鈣離子有促進DNA 透過細胞的作用，某些化合物可擾亂細胞膜，故可將DNA輸入細胞內，并整合于受體細胞的 基因組中，在適當的條件下，整合基因得以表達，細胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極 低，一般個細胞中只有一個細胞可結合導入的外源基因。要達到治療目的，就 需要從病人獲得大量所需的受體細胞。2)物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。①電 穿孔法：電穿孔法（electroporotion)是將細胞置于高壓脈沖電場中，通過電擊使細胞產 生可逆性的穿孔，周圍基質中的DNA可滲進細胞，但有時也會使細胞受到嚴重損傷。②顯微 注射法：顯微注射（microinjection)是在顯微鏡直視下，向細胞核內直接注射外源基因， 這種方法應是有效的。但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。此法用于生殖細胞時，有 效率可達10%。直接用于體細胞卻很困難。在動物實驗中，應用這種方法將目的基因注入 生殖細胞，使之表達而傳代，這樣的動物就稱為轉基因動物，如今成功使用得較多的是轉基 因小鼠 （transgenic mice)，它可作為繁殖大量后代的疾病動物模型。③脂質體法：脂質體 (liposome)法是應用人工脂質體包裝外源基因，再與靶細胞融合，或直接注入病灶組織，使 之表達。3)同源重組法：同源重組（homologous recombination)是將外源基因定位導入受 體細胞的染色體上，在外源基因對應的染色體座位上，因有同源序列，通過單一或雙交換， 新基因片段替換有缺陷的片段，達到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝Neo基 因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin)的培養基中生長，從而使 未插入新基因片段的細胞死亡。對于體細胞基因治療，體外培養細胞的時間不能過長，篩選 量大，故在臨床上應用也受限制難以進行。4)病毒介導基因轉移：前述的化學和物理方法 都是通過轉染方式基因轉移。病毒介導基因轉移（viral mediatedgene transfer)是通過 轉換方式完成基因轉移，即以病毒為載體（vector)，將外源目的基因通過基因重組技術，將 其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞，這種病毒稱為病毒運載體（viral vector)。然而，病毒介導基因轉移在臨床上有風險。
[0004] 在研究基因轉移方法的同時，人們也關注用于基因沉默的核酸片段的研究。其中， 三螺旋形成寡核苷酸（triplex forming oligo-deoxynucleotides，TF0)通過與雙鏈 DNA 形成Hoogsteen氫鍵，插入到雙鏈DNA的大溝（major groove)中。Hoogsteen氫鍵的形成 遵循Hoogsteen堿基配對原則，因此可以設計具有特異性的三螺旋形成寡核苷酸，結合到 靶基因的轉錄起始區域，阻止轉錄因子結合，從而抑制轉錄起始，達到基因沉默的目的。然 而，三螺旋形成寡核苷酸極不穩定，容易被DNA酶降解，因此限制了其應用。研究人員曾利 用多種方式對三螺旋形成寡核苷酸進行修飾以防止其被降解，此前也有報道稱13nm金納 米顆粒可以提高三螺旋形成寡核苷酸的穩定性，但是效果都比較有限。至今仍沒有載體能 將三螺旋形成寡核苷酸直接帶入細胞核內起作用。
【發明內容】
[0005] 據報道，細胞核孔復合物孔徑大小一般在9nm左右，細胞核一般只允許尺寸在9nm 以下的某些物質進出細胞核。結合現有技術的不足，本發明提供一種用于基因治療的基因 載體系統，其不僅能對三螺旋形成寡核苷酸具有保護作用，能夠保護其免于DNA酶降解，而 且能將三螺旋形成寡核苷酸直接帶入細胞核內發揮作用，大幅度提高效果。因此是一種能 夠用于基因治療的良好的基因載體系統，可應用于臨床基因治療。本發明還提供所述基因 載體系統的制備方法和應用，其制備方法簡單易行，不涉及復雜的操作和苛刻條件，并且成 本較低。
[0006] 為實現本發明的目的，本發明提供以下技術方案：
[0007] 在第一方面，本發明提供一種用于基因治療的基因載體系統，包括金納米顆粒和 與所述金納米顆粒相連的三螺旋形成寡核苷酸，所述金納米顆粒的粒徑為l-6nm，所述三螺 旋形成寡核苷酸能夠與靶基因上的序列結合而沉默所述靶基因。
[0008] 本發明的基因載體系統中，金納米顆粒和三螺旋形成寡核苷酸相連，能夠保護三 螺旋形成寡核苷酸免于DNA酶降解，提高基因沉默效率。
[0009] 金納米顆粒與三螺旋形成寡核苷酸的連接，可以用目前已有的金納米顆粒與核苷 酸連接的方法實現，只要能夠實現二者的連接即可。當然，未來開發出的技術也可能適用。 [0010] 作為本發明的優選實施方案，所述金納米顆粒和三螺旋形成寡核苷酸以N-(2-巰 基丙酰基）-甘氨酸為連接子互連，所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的巰基與所述金納米 顆粒形成共價鍵合，所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的羧基與所述三螺旋形成寡核苷酸的 5'端修飾的氨基形成酰胺鍵連接。
[0011] 已經證明，采用N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸作為連接子，能夠實現金納米顆粒與 三螺旋形成寡核苷酸的高效、穩定的連接，因為N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸的巰基與金納 米顆粒形成共價鍵合，N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸的羧基與三螺旋形成寡核苷酸的5'端 修飾的氨基形成酰胺鍵連接，都是非常專一和穩定的。
[0012] 本領域的技術人員能夠理解，采用N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸作為連接子只是 本發明的一種優選方式，其基于巰基與金的共價鍵合以及羧基與氨基形成酰胺鍵連接的原 理，因此其它帶有巰基端和羧基端的小分子也可以作為本發明的金納米顆粒與三螺旋形成 寡核苷酸的連接子，例如谷胱甘肽等。此外，即使沒有連接小分子，在三螺旋形成寡核苷酸 單鏈一端修飾巰基，直接與金納米顆粒表面共價鍵合連接，也可以實現本發明的目的。
[0013] 需要說明的是：針對靶基因上的序列設計與其特異性結合的三螺旋形成寡核苷酸 的技術，是本領域技術人員公知的。本領域技術人員可以根據其具備的知識和技能針對要 沉默的靶基因設計合適的三螺旋形成寡核苷酸，并通過人工方法合成。
[0014] 本發明中，所述金納米顆粒的粒徑為l_6nm，在該范圍內，金納米顆粒載運三螺旋 形成寡核苷酸進入細胞核的能力比較強，而且能夠有效保護三螺旋形成寡核苷酸免于DNA 酶降解；并且金納米顆粒與三螺旋形成寡核苷酸的比例關系比較合理，沒有金納米顆粒或 三螺旋形成寡核苷酸過量冗余的問題。
[0015] 作為本發明的優選實施方案，所述金納米顆粒的粒徑為2nm。
[0016] 作為本發明的優選實施方案，所述靶基因為需要實施基因治療的基因，優選為原 癌基因。通過將所述基因載體系統導入特定細胞（比如腫瘤細胞）的細胞核，所述基因載 體系統上的三螺旋形成寡核苷酸通過與雙鏈DNA形成Hoogsteen氫鍵，插入到雙鏈DNA的 大溝中。如果插入位點正好位于特定基因的轉錄起始區域，那么三螺旋形成寡核苷酸結合 到靶基因的轉錄起始區域，阻止轉錄因子結合，從而抑制轉錄起始，達到基因沉默的目的， 實現基因治療。
[0017] 作為本發明的優選實施方案，所述靶基因上的序列為轉錄起始區的序列，優選為 啟動子序列。
[0018] 在第二方面，本發明提供一種制備第一方面所述的基因載體系統的方法，包括：將 粒徑為l-6nm的金納米顆粒和能夠與靶基因上的序列結合而沉默所述靶基因的三螺旋形 成寡核苷酸連接形成所述基因載體系統。
[0019] 作為本發明的優選實施方案，所述方法包括如下步驟：
[0020] (1)在還原劑的存在下，使氯金酸與N-(2-巰基丙酰基）_甘氨酸接觸，生成金納米 顆粒，所述金納米顆粒與所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的巰基形成共價鍵合；
[0021] (2)在催化劑的存在下，使步驟（1)生成的連有N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸的金 納米顆粒與5'端修飾氨基的三螺旋形成寡核苷酸接觸，形成酰胺鍵連接，得到所述基因載 體系統。
[0022] 作為本發明的優選實施方案，所述還原劑為硼氫化鈉。
[0023] 優選地，所述催化劑為1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基 琥珀酰亞胺。
[0024] 在第三方面，本發明提供一種基因治療試劑，包括第一方面所述的基因載體系統。 除所述基因載體系統以外，還可以包括緩沖液、細胞培養液或生理鹽水等其它成分。
[0025] 在第四方面，本發明提第一方面所述的基因載體系統在制備基因治療試劑中的應 用。
[0026] 本發明中，N-(2_巰基丙酰基）_甘氨酸，又稱硫普羅寧，下文出現的硫普羅寧應理 解為指N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸。
[0027] 本發明中，基因載體系統，在下文有些地方又稱為金納米顆粒-三螺旋形成寡核 苷酸復合物。
[0028] 相比現有技術，本發明的有益效果為：本發明的基因載體系統以金納米顆粒表面 載運三螺旋形成寡核苷酸的形式存在，其中金納米顆粒對三螺旋形成寡核苷酸具有保護作 用，能夠保護其免于DNA酶降解；而且能將三螺旋形成寡核苷酸直接帶入細胞核內發揮作 用，大幅度提高效果。。實驗證實，在三螺旋形成寡核苷酸濃度相同的情況下，本發明的基因 載體系統比游離三螺旋形成寡核苷酸具有更強的抑制靶基因表達的能力，因此對腫瘤細胞 等惡性細胞具有更強的毒性，因此是一種能夠用于基因治療的良好的基因載體系統，可應 用于臨床基因治療中。本發明的制備方法簡單易行，不涉及復雜的操作和苛刻條件，并且成 本較低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明實施例1制備粒徑為2nm的硫普羅寧（ΤΙ0Ρ)包被的金納米顆粒 (Au-TIOP NPs)的反應原理圖。
[0030] 圖2為本發明實施例1制備的粒徑為2nm的硫普羅寧（ΤΙ0Ρ)包被的金納米顆粒 (Au-TIOP NPs)的透射電鏡照片，標尺為20nm。
[0031] 圖3為本發明實施例1制備粒徑為2nm的金納米顆粒載P0Y2T三螺旋形成寡核苷 酸（Au-P0Y2T NPs)的反應原理圖。
[0032] 圖4為本發明實施例1制備的粒徑為2nm的金納米顆粒載P0Y2T三螺旋形成寡 核苷酸（Au-P0Y2T NPs)的透射電鏡照片，標尺為20nm。
[0033] 圖5為本發明試驗例1中乳腺癌細胞分別在不同濃度（0. 1 μ Μ、1 μ M、2. 5 μ Μ、5 μ Μ 和1(^]?)的411-1'10?咿8、游離？0￥21^11-?0￥21咿8、游離？0￥21'和411-?0￥2了咿8中處理 24小時后的細胞毒性實驗結果。
【具體實施方式】
[0034] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理 解，以下實施例僅為本發明的示例性實施例，以便于更好地理解本發明，因而不應視為限定 本發明的范圍。
[0035] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無 特殊說明，均為自常規生化試劑廠商購買得到的。
[0036] 硼氫化鈉（彡98. 0%，NaBH4)、三水氯金酸鹽（彡99. 9%，HAuC14 · 3Η20)、檸檬酸 三鈉（>99.0 %，trisodium citrate tribasic dihydrate)、Ν_ (2-疏基丙醜基）-甘氨酸 (N-(2_mercapt〇-propionyl)glycine，硫普羅寧，tiopronin)、Ν-輕基琥拍酰亞胺（98%, N_hydroxysuccinimide,NHS,C4H5N03)和 1-(3-二甲氨基丙基）-3_ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-G-DimethylaminopropylJ-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC,C8H17N3 *HC1)均購 自Sigma-Aldrich(St Louis,美國）公司；實驗中用到的DNA單鏈（三螺旋形成寡核苷酸） 均由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，純度均大于95% ;所有化學試劑用之前均 未經過其他處理，整個實驗使用的超純水采用密理博公司的Milli-Q三蒸水（18. 2ΜΩ ·_， Millipore System Inc)〇
[0037] 實施例1
[0038] 本實施例以 2nm 的金納米顆粒載 P0Y2T(TGGGTGGGTGGTTTGTTTTTGGG，SEQ ID NO :1)三螺旋形成寡核苷酸（Au-P0Y2T NPs)為例說明基因載體系統的制備。其 中P0Y2T具有特異性下調原癌基因 c-myc表達的功能；以將P0Y2T序列打亂設計的 P0Y2M(GGTGTGTTGTTGGTGGTGTGTTG，SEQ ID N0:2)無意義寡核苷酸序列作為對照。
[0039] 首先，介紹2nm硫普羅寧包被的金納米顆粒（2nm Au-TIOP NPs)的制備，以硼氫化 鈉（NaBH4)作為還原劑，硫普羅寧（Tiopronin)作為穩定劑，制備2nm的金納米顆粒，反應 原理如圖1所示。
[0040] 具體實驗步驟如下：
[0041] (1)分別量取18mL甲醇和3mL乙酸于50mL錐形瓶，緩慢攪拌均勻；
[0042] (2)分別移取15mLl % HAuC14加入到以上溶液中，并稱取191. 3mg硫普羅寧 (tiopronin)溶于lmL三蒸水緩慢滴加至其中，攪拌約30min ;
[0043] (3)稱量0· 3g NaBH4溶于2mL冰水，在劇烈攪拌下緩慢滴加至錐形瓶中，隨著NaBH4 溶液的加入，溶液顏色逐漸加深，同時伴隨放熱，滴加完畢，室溫繼續攪拌2h ;
[0044] (4)將所得溶液經過旋轉蒸發掉溶劑，透析除去多余的保護劑，得到深色均質溶 液，即得到2nm表面硫普羅寧包被的金納米顆粒Au-TIOP NPs，其透射電鏡照片如圖2所示。
[0045] 后續實驗中使用到的金納米顆粒溶液中金元素濃度由電感耦合等離子體發射光 譜儀（ICP-0ES)測得。
[0046] 然后，介紹2nm的金納米顆粒載P0Y2T三螺旋形成寡核苷酸（Au-P0Y2TNPs)的制 備，反應原理如圖3所示。
[0047] 具體實驗步驟如下：
[0048] (1)材料準備：2nm Au-TIOP NPs(濃度為 25μΜ)、合成的 NH2-P0Y2T 和 NH2-P0Y2M(5'端氨基修飾，濃度均為ΙΟΟμΜ)和催化劑EDC/NHS ;
[0049] (2)在含有200 μ L三蒸水的玻璃試管中加入30 μ L2nm Au-TIOP NPs溶液，緩慢攪 拌 10min ;
[0050] (3)在以上溶液中加入10 μ L濃度為100 μ Μ的EDC溶液，緩慢攪拌15min ;
[0051] (4)在以上溶液中加入10 μ L濃度為100 μ Μ的NHS溶液，緩慢攪拌15min ;
[0052] (5)加入 250 μ L NH2-P0Y2T 或 NH2-P0Y2M，濃度均為 100 μ M，避光緩慢攪拌 24h ;
[0053] (6)反應得到的液體裝于透析袋內（MWC0 = 1000)放于裝有三蒸水的大燒杯中避 光透析2d,每8h更換透析外液；
[0054] (7)收集透析袋內溶液，得到2nm金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合物（分 別為Au-P0Y2T NPs和Au-P0Y2M NPs)的溶液，用于后續細胞毒性試驗，其中，Au-P0Y2T NPs 的透射電鏡照片如圖4所示。
[0055] 最后，進行細胞毒性試驗，具體實驗步驟如下：
[0056] 分別以本實施例制得的不同濃度（0. 1 μ Μ、1 μ M、2. 5 μ Μ、5 μ Μ和10 μ M)的 Au-TIOP NPs、游離 P0Y2M、Au-P0Y2M NPs、游離 Ρ0Υ2Τ 和 Au-P0Y2T NPs 中處理乳腺癌細胞 MCF-724小時，統計不同濃度的上述物質處理后的細胞活性（即細胞存活率），結果如圖5 所示。
[0057] 結果顯示：游離P0Y2T對MCF-7細胞孵育24h后，在2. 5 μ Μ、5 μ Μ和10 μ Μ游離 Ρ0Υ2Τ的濃度下，細胞存活率顯著下降，而1 μ Μ沒有影響。文獻報道無意義的寡核苷酸序 列也對細胞有一定毒性，所以將Ρ0Υ2Τ序列打亂設計的游離Ρ0Υ2Μ，處理細胞后發現也有一 定毒性，但是遠沒有Ρ0Υ2Τ顯著，說明Ρ0Υ2Τ的細胞毒性來自于對c-myc轉錄起始位點的特 異性識別。對應濃度下的2nmAu-P0Y2T NPs對MCF-7細胞具有明顯的殺傷效果，在濃度為 1 μ Μ時，細胞存活率僅為60%左右，而1 μ Μ的游離P0Y2T對細胞存活率幾乎沒有影響。
[0058] 由于AU-P0Y2T中使用的是氨基修飾的寡核苷酸鏈，為排除氨基修飾的干擾，又測 試了游離ΝΗ 2-Ρ0Υ2Τ的毒性，結果顯示氨基修飾不會提高寡核苷酸鏈的毒性。此外，對應濃 度的單純硫普羅寧包被的金納米顆粒（Au-TIOP NPs)對細胞存活率影響很小，可忽略。
[0059] 上述結果說明：金納米顆粒（Au NPs)提高了三螺旋形成寡核苷酸的穩定性，使原 本在低濃度時無細胞增殖抑制效果的P0Y2T三螺旋形成寡核苷酸產生了明顯的細胞增殖 抑制效果。
[0060] 實施例2
[0061] 本實施例與實施例1的差別在于將實施例1中191. 3mg硫普羅寧改為382. 6mg，制 備得到粒徑為lnm的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合物（分別為AU-P0Y2T NPs和 Au-P0Y2M NPs)。
[0062] 以本實施例制得的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合物（分別為AU-P0Y2T NPs和Au-P0Y2M NPs)進行的細胞毒性試驗結果與實施例1的相似。
[0063] 實施例3
[0064] 本實施例與實施例1的差別在于將實施例1中191. 3mg硫普羅寧改為20. 73mg，制 備得到粒徑為6nm的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合物（分別為AU-P0Y2T NPs和 Au-P0Y2M NPs)。
[0065] 以本實施例制得的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合物（分別為AU-P0Y2T NPs和Au-P0Y2M NPs)進行的細胞毒性試驗結果與實施例1的相似。
[0066] 實施例4
[0067] 本實施例以文獻（Karen M. Vasquez等人，Science, 290, 530 (200))報道的三螺旋 形成寡核苷酸 AG30(5' -AGGAAGGGGGGGGTGGTGGGGGAGGGGGAG-3'，SEQ ID N0:3)為例，按照 實施例1的方法制備得到2nm金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合（Au-AG30NPs)。
[0068] 以本實施例制得的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復合物（Au-AG30NPs)進行 的細胞毒性試驗結果顯示：AG30濃度相同的Au-AG30NPs對supFGl基因的沉默效果明顯高 于游離AG30對supFGl基因的沉默效果，說明金納米顆粒（AuNPs)提高了三螺旋形成寡核 苷酸AG30的穩定性，使其基因沉默能力增強。
[〇〇69] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及詳細方法，但 本發明并不局限于上述詳細特征以及詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征 以及詳細方法才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發 明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍 和公開范圍之內。 序列表 一種用于基因治療的基因載體系統及其制備方法和應用-序列表206. txt SEQUENCE LISTING <110 國家納米科學中心 <120 一種用于基因治療的基因載體系統及其制備方法和應用 <130 2014 <160 3 <170 PatentIn version 3.3 <210' 1 <211 23 <212 DNA <213-人工序列 <400 1 tgggtgggtg gtttgttttt ggg 23 <210 2 <211 23 <212. DNA <213 人工序列 <400 2 ggtgtgttgt tggtggtgtg ttg 23 <210 3 <211' 30 〈212. DM <213 人工序列 <400 - 3 aggaaggggg gggtggtggg ggagggggag 30
【權利要求】
1. 一種用于基因治療的基因載體系統，包括金納米顆粒和與所述金納米顆粒相連的三 螺旋形成寡核苷酸，所述金納米顆粒的粒徑為l-6nm，所述三螺旋形成寡核苷酸能夠與靶基 因上的序列結合而沉默所述靶基因。
2. 根據權利要求1所述的基因載體系統，其特征在于，所述金納米顆粒和三螺旋形成 寡核苷酸以N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸為連接子互連，所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸 的巰基與所述金納米顆粒形成共價鍵合，所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的羧基與所述三 螺旋形成寡核苷酸的5'端修飾的氨基形成酰胺鍵連接。
3. 根據權利要求1或2所述的基因載體系統，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為 2nm〇
4. 根據權利要求1-3任一項所述的基因載體系統，其特征在于，所述靶基因為需要實 施基因治療的基因，優選為原癌基因。
5. 根據權利要求1-4任一項所述的基因載體系統，其特征在于，所述靶基因上的序列 為轉錄起始區的序列，優選為啟動子序列。
6. -種制備權利要求1-5任一項所述的基因載體系統的方法，包括：將粒徑為l-6nm 的金納米顆粒和能夠與靶基因上的序列結合而沉默所述靶基因的三螺旋形成寡核苷酸連 接形成所述基因載體系統。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 在還原劑的存在下，使氯金酸與N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸接觸，生成金納米顆 粒，所述金納米顆粒與所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的巰基形成共價鍵合； (2) 在催化劑的存在下，使步驟（1)生成的連有N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸的金納米 顆粒與5'端修飾氨基的三螺旋形成寡核苷酸接觸，形成酰胺鍵連接，得到所述基因載體系 統。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述還原劑為硼氫化鈉； 優選地，所述催化劑為1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀 酰亞胺。
9. 一種基因治療試劑，包括權利要求1-5任一項所述的基因載體系統。
10. 如權利要求1-5任一項所述的基因載體系統在制備基因治療試劑中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104083773SQ201410184248
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月4日 優先權日:2014年5月4日
【發明者】梁興杰, 霍帥東, 金叔賓 申請人:國家納米科學中心