本發明涉及核酸擴增反應方法、核酸擴增反應裝置以及核酸擴增反應用試劑。
背景技術：
：近年來，隨著基因的利用技術的發展，基因診斷、基因治療等利用了基因的醫療備受注目，除此之外在農業、畜牧業領域中，在品種辨別、品種改良中使用了基因的方法也被較多地開發。作為用于利用基因的技術，pcr(polymerasechainreaction：聚合酶鏈反應)法等技術廣泛普及。今天，pcr法在生物體物質的信息解析中成為必不可缺的技術。pcr法是對包含成為擴增的對象的核酸(靶核酸)以及試劑的溶液(反應液)實施熱循環，從而使靶核酸擴增的方法。熱循環是使兩個階段以上的溫度周期性地施加于反應液的處理。在pcr法中，通常實施兩個階段或者三個階段的熱循環的方法。例如，在專利文獻1中記載了一種核酸擴增反應裝置，其使填充有反應液(液滴)以及不與反應液混和且比重小于反應液的液體(油等)的反應容器繞旋轉軸旋轉，憑借比重差使反應液移動并進行熱循環。在專利文獻1中，為了檢測核酸擴增，而使用熒光標志探針。專利文獻1：日本特開號公報然而，要求基于pcr的產物的生成時間的縮短化。然而，在專利文獻1所記載的技術中，若使pcr的反應時間(改性反應用的時間、退火反應/伸長反應用的時間)縮短(若使pcr高速化)，則例如存在核酸與熒光標志探針不充分地混合(hybridization)，從而無法高靈敏度地檢測核酸的擴增的情況。技術實現要素：本發明的幾個方式的目的之一在于提供一種即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增的核酸擴增反應方法。另外，本發明的幾個方式的目的之一在于提供一種即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增的核酸擴增反應裝置。另外，本發明的幾個方式的目的之一在于提供一種即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增的核酸擴增反應用試劑。本發明的核酸擴增反應方法包含對包含核酸的擴增所使用的核酸擴增反應試劑的反應液施加用于使上述核酸擴增的熱循環的工序，在上述熱循環中，退火反應以及伸長反應用的加熱時間為1秒以上10秒以下，上述核酸擴增反應試劑包含正向引物、反向引物、聚合酶以及熒光標志探針，包含于上述反應液的上述正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應液的上述反向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應液的上述聚合酶的量為0.5u以上4u以下，包含于上述反應液的上述熒光標志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸擴增反應方法中，即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增(詳細參照后述的“4.實驗例”)。在本發明的核酸擴增反應方法中，上述核酸擴增反應試劑也可以包含dntp，包含于上述反應液的上述dntp的濃度為0.125mm以上1mm以下。在上述的核酸擴增反應方法中，即使使pcr高速化，也能夠更加可靠且高靈敏度地檢測核酸的擴增。在本發明的核酸擴增反應方法中，也可以是：上述正向引物的濃度為0.8μm以上3.2μm以下，上述反向引物的濃度為0.8μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量為1u以上4u以下，上述熒光標志探針的濃度為0.3μm以上1.2μm以下，上述dntp的濃度為0.25mm以上1mm以下。在上述的核酸擴增反應方法中，即使使pcr高速化，也能夠更加高靈敏度地檢測核酸的擴增。在本發明的核酸擴增反應方法中，也可以是：上述正向引物的濃度為1.6μm以上3.2μm以下，上述反向引物的濃度為1.6μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量為2u以上4u以下，上述熒光標志探針的濃度為0.6μm以上1.2μm以下，上述dntp的濃度為0.5mm以上1mm以下。在上述的核酸擴增反應方法中，即使使pcr高速化，也能夠進一步高靈敏度地檢測核酸的擴增。在本發明的核酸擴增反應方法中，也可以是：上述正向引物的濃度為2.4μm以上3.2μm以下，上述反向引物的濃度為2.4μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量為3u以上4u以下，上述熒光標志探針的濃度為0.9μm以上1.2μm以下，上述dntp的濃度為0.75mm以上1mm以下。在上述的核酸擴增反應方法中，即使使pcr高速化，也能夠進一步高靈敏度地檢測核酸的擴增。本發明的核酸擴增反應裝置包括：安裝部，其收容包含核酸的擴增所使用的核酸擴增反應試劑的反應液以及比重與上述反應液比重不同且不與上述反應液混和的液體，并能夠安裝具有供上述反應液移動的流路的核酸擴增反應用盒；溫度梯度形成部，其在上述流路形成溫度梯度；以及移動機構，其以對上述反應液施加用于使上述核酸擴增的熱循環的方式使上述反應液移動，上述移動機構在上述熱循環中，以退火反應以及伸長反應用的加熱時間成為1秒以上10秒以下的方式使上述反應液移動，上述核酸擴增反應試劑包含正向引物、反向引物、聚合酶以及熒光標志探針，包含于上述反應液的上述正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應液的上述反向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應液的上述聚合酶的量為0.5u以上4u以下，包含于上述反應液的上述熒光標志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸擴增反應裝置中，即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增。本發明的核酸擴增反應用試劑為包含于施加用于使核酸擴增的熱循環的反應液的核酸擴增反應用試劑，在上述熱循環中，退火反應以及伸長反應用的加熱時間為1秒以上10秒以下，上述核酸擴增反應用試劑包含正向引物、反向引物、聚合酶以及熒光標志探針，包含于上述反應液的上述正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應液的上述反向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應液的上述聚合酶的量為0.5u以上4u以下，包含于上述反應液的上述熒光標志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸擴增反應用試劑中，即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增。附圖說明圖1是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應用盒的剖視圖。圖2是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應用盒的剖視圖。圖3是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應用盒的剖視圖。圖4是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應用盒的剖視圖。圖5是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置的立體圖。圖6是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置的立體圖。圖7是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置的分解立體圖。圖8是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置的剖視圖。圖9是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置的剖視圖。圖10是本實施方式的核酸擴增反應裝置的功能框圖。圖11是用于對本實施方式的核酸擴增反應方法進行說明的流程圖。圖12是使核酸擴增反應用試劑的濃度變化的情況下的pcr結果。圖13是使核酸擴增反應用試劑的濃度變化的情況下的pcr結果。圖14是標準條件以及高速條件下的pcr結果。圖15是多重pcr結果。具體實施方式以下，使用附圖對本發明的優選的實施方式詳細地進行說明。此外，以下說明的實施方式適當地限定權利要求書記載的本發明的內容。另外，以下說明的構成的全部不限定于是本發明的必要構成要件。1.核酸擴增反應用試劑首先，對本實施方式的核酸擴增反應用試劑進行說明。核酸擴增反應用試劑收容于核酸擴增反應用盒。圖1是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應用盒10的剖視圖。如圖1所示，核酸擴增反應用盒10包含容器12與帽14。如圖1所示，容器12例如具有圓筒狀的側壁部12a與半球狀的底部12b。容器12具有流路16。流路16由容器12形成。流路16沿著圓筒狀的側壁部12a的中心軸(未圖示)延伸。帽14堵塞與容器12的底部12b對置的端部的開口。帽14相對于容器12能夠裝卸。容器12以及帽14的材質例如為玻璃、高分子、金屬等。在容器12的底部12b例如固定被凍結干燥的核酸擴增反應用試劑24。若如圖2所示卸下帽14并使用移液管2等向上述的核酸擴增反應用盒10導入模板核酸溶液22，則如圖3所示被導入的模板核酸溶液22下降至底部12b，而與核酸擴增反應用試劑24接觸。核酸擴增反應用試劑24憑借模板核酸溶液22的水分而解除凍結干燥從而被獲取至模板核酸溶液22，進而如圖4所示成為反應液20。因此，反應液20包含模板核酸以及核酸擴增反應用試劑24，從而進行核酸的擴增反應。反應液20收容于核酸擴增反應用盒10，并存在于流路16。反應液20在液體30中以液滴的狀態被保持。在圖示的例中，反應液20的形狀呈球狀。反應液20例如比重大于液體30。反應液20伴隨著核酸擴增反應用盒10的移動，而在流路16中相對于容器12相對地移動。模板核酸溶液22是包含模板核酸的溶液。在將模板核酸溶液22導入容器12內時，帽14被從容器12取下，在導入模板核酸溶液22后，再次被安裝于容器12。模板核酸溶液22例如通過如下方式獲得。即，利用棉棒等采集工具，采集人、細菌等的源自生物的細胞或者病毒等檢體，使用已知的提取方法，從檢體提取模板核酸。然后，使用已知的精制方法，以成為規定濃度的方式精制模板核酸溶液。此外，模板核酸溶液22的溶劑例如是水(蒸留水、滅菌水)、tris-edta(ethylenediaminetetraaceticacid：乙二胺四乙酸)溶液(te)。核酸擴增反應用試劑24收容于核酸擴增反應用盒10，例如在容器12的底部12b被凍結干燥(冷凍干燥)。核酸擴增反應用試劑24是使用于核酸的(靶核酸的)擴增反應的試劑。核酸擴增反應用試劑24包含引物、聚合酶、熒光標志探針以及dntp。引物設計為對模板核酸進行退火。核酸擴增反應用試劑24在雙鏈構造的模板核酸(雙鏈dna)改性后，包含對一方的單鏈構造的模板核酸(單鏈dna)進行退火的正向引物(forwardprimer)與對另一方的單鏈dna進行退火的反向引物(reverseprimer)。包含于反應液20的正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，優選為0.8μm以上3.2μm以下，更加優選為1.6μm以上3.2μm以下，進一步更加優選為2.4μm以上3.2μm以下。包含于反應液20的反向引物的濃度例如為0.4μm以上3.2μm以下，優選為0.8μm以上3.2μm以下，更加優選為1.6μm以上3.2μm以下，進一步更加優選為2.4μm以上3.2μm以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增(詳細參照“4.實驗例”)。包含于反應液20的正向引物的濃度與反向引物的濃度例如相同。作為聚合酶，雖不被特別地限定，但能夠列舉dna(deoxyribonucleicacid：脫氧核糖核酸)聚合酶。dna聚合酶在對單鏈構造的模板核酸(單鏈dna)進行退火的引物的末端聚合與模板核酸的堿基互補的核甙酸。作為dna聚合酶，優選耐熱性的酶、pcr用酶，例如，雖存在taq聚合酶、tfi聚合酶、tth聚合酶或者它們的改良型等非常多數的出售品，但優選進行熱啟動(hotstart)的dna聚合酶。包含于反應液20的聚合酶的量為0.5u以上4u以下，優選為1u以上4u以下，更加優選為2u以上4u以下，進一步更加優選為3u以上4u以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增。熒光標志探針用于使核酸的擴增量定量。熒光標志探針例如是包含指針色素以及淬滅色素的水解探針。作為水解探針的熒光標志探針在與單鏈dna混合(退火)而形成雙鏈構造的期間，指針色素因接近該指針色素的淬滅色素(因淬滅效應)，而抑制發光。但是，若通過聚合酶分解熒光標志探針，則淬滅效應消除，從而指針色素發光。通過該發光，能夠使核酸的擴增量定量。包含于反應液20的熒光標志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下，優選為0.3μm以上1.2μm以下，更加優選為0.6μm以上1.2μm以下，進一步更加優選為0.9μm以上1.2μm以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增(詳細參照“4.實驗例”)。dntp表示4種脫氧核苷三磷酸(deoxynucleotidetriphosphate)的混合物。即，dntp表示datp(deoxyadenosinetriphosphate：脫氧腺苷三磷酸)、dctp(deoxycytidinetriphosphate：脫氧胞苷三磷酸)、dgtp(deoxyguanosinetriphosphate：脫氧鳥苷三磷酸)以及dttp(thymidinetriphosphate：胸苷三磷酸)的混合物。dna聚合酶在退火的引物的末端接合datp、dctp、dgtp、dttp，而形成新的dna。包含于反應液20的dntp的濃度為0.125mm以上1mm以下，優選為0.25mm以上1mm以下，更加優選為0.5mm以上1mm以下，進一步更加優選為0.75mm以上1mm以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增(詳細參照“4.實驗例”)。此外，反應液20也可以進一步包含水、緩沖液(例如，mgcl2、tris-hcl以及kcl混合的液體)。液體30收容于核酸擴增反應用盒10，并配置于流路16。在圖示的例中，流路16被反應液20以及液體30填充(充滿)。液體30是不與反應液20混和，即不混雜的液體。液體30進一步也不與模板核酸溶液22以及核酸擴增反應用試劑24混和。液體30的比重與反應液20的比重不同。具體而言，液體30的比重小于反應液20的比重。因此，反應液20憑借重力的作用，向重力發揮作用的方向移動。液體30例如是二甲基硅油、石蠟油等。此外，如上，對將被凍結干燥的核酸擴增反應用試劑24固定于容器12的底部12b，將模板核酸溶液22導入容器12內，使模板核酸溶液22與核酸擴增反應用試劑24接觸從而形成反應液20的例子進行了說明。然而，也可以在容器12外調制包含模板核酸與核酸擴增反應用試劑24的溶液，將該溶液導入被液體30填充的容器12內，從而反應液20存在于容器12內。2.核酸擴增反應裝置接下來，參照附圖對本實施方式的核酸擴增反應裝置進行說明。圖5以及圖6是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置100的立體圖，圖5表示打開蓋體60的狀態，圖6表示關閉蓋體60的狀態。圖7是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置100的主體部50的分解立體圖。圖8以及圖9是示意性地表示本實施方式的核酸擴增反應裝置100的、沿圖6的a-a線剖視圖。圖10是本實施方式的核酸擴增反應裝置100的功能框圖。此外，為了方便，在圖5中，簡化圖示核酸擴增反應用盒10。另外，在圖5以及圖6中，省略熒光測定器80的圖示。另外，在圖8以及圖9中，箭頭g的方向為重力發揮作用的方向(重力作用方向)。在圖8中，加熱部52、53的配置表示作為第一配置的狀態，在圖9中，加熱部52、53的配置表示作為第二配置的狀態。另外，為了方便，在圖10中，省略主體部50以及蓋體60的圖示。如圖5～圖10所示，核酸擴增反應裝置100包含主體部50、蓋體60、移動機構70、熒光測定器80、處理部90、操作部92、顯示部94以及存儲部96。核酸擴增反應裝置100例如為升降式pcr裝置。如圖7所示，主體部50具有安裝部51、第一加熱部52、第二加熱部53、隔離件54、底板55、凸緣56以及固定板57。安裝部51具有能夠安裝核酸擴增反應用盒10的構造。具體而言，如圖5所示，安裝部51具有供核酸擴增反應用盒10插入(insert)并安裝的構造。在圖7所示的例中，安裝部51是貫通第一加熱部52的第一加熱部件52b、隔離件54以及第二加熱部53的第二加熱部件53b的貫通孔。安裝部51的個數也可以為多個，在圖示的例中為20個。第一加熱部52在將核酸擴增反應用盒10安裝于安裝部51的情況下，如圖8以及圖9所示，將流路16的第一區域16a加熱至第一溫度。在圖示的例中，第一加熱部52位于比第二加熱部53更靠蓋體60側。第一加熱部52例如具有產生熱的機構與將產生的熱傳遞至核酸擴增反應用盒10的部件。在圖7所示的例中，第一加熱部52具有第一加熱器52a與第一加熱部件52b。第一加熱器52a例如為盒加熱器，被導線58連接于未圖示的外部電源。第一加熱器52a插入設置于第一加熱部件52b的孔，第一加熱器52a發熱，從而第一加熱部件52b被加熱。第一加熱部件52b是將從第一加熱器52a產生的熱傳遞至核酸擴增反應用盒10的部件。第一加熱部件52b例如是鋁制的塊部件。流路16的第一區域16a是被第一加熱部件52b包圍的區域。第二加熱部53在將核酸擴增反應用盒10安裝于安裝部51的情況下，將流路16的第二區域16b加熱至與第一溫度不同的第二溫度。第二加熱部53具有第二加熱器53a與第二加熱部件53b。第二加熱部53除了加熱的核酸擴增反應用盒10的區域以及加熱的溫度與第一加熱部52不同以外，具有與第一加熱部52相同的構造以及功能。流路16的第二區域16b是被第二加熱部件53b包圍的區域。第一加熱部52以及第二加熱部53的溫度被未圖示的溫度傳感器(例如熱電偶)以及處理部90控制。例如，將第一加熱部52控制為第一溫度，將第二加熱部53控制為第二溫度，從而能夠將核酸擴增反應用盒10的第一區域16a加熱至第一溫度，將第二區域16b加熱至第二溫度。隔離件54設置于第一加熱部52與第二加熱部53之間。隔離件54具有將第一加熱部52與第二加熱部53之間隔熱的功能。底板55是保持核酸擴增反應用盒10的部件。底板55決定核酸擴增反應用盒10的高度方向的位置。即，將核酸擴增反應用盒10插入至與底板55接觸的位置，從而相對于加熱部52、53將核酸擴增反應用盒10保持于規定的位置。在底板55設置有用于供來自熒光測定器80的激勵光以及供反應液20的熒光通過的貫通孔55a。凸緣56以及固定板57是用于固定加熱部52、53以及隔離件54的部件。在圖示的例中，將兩張固定板57嵌合于凸緣56，加熱部52、53、隔離件54以及底板55固定于固定板57。蓋體60覆蓋安裝部51。在圖5所示的例中，在固定板57設置有磁鐵部62，蓋體60能夠被磁鐵部62固定于主體部50。此外，隔離件54、底板55、凸緣56、固定板57以及蓋體60的材質例如為隔熱材料。移動機構70是基于來自處理部90的輸入信號使主體部50旋轉的機構。由此，移動機構70能夠將加熱部52、53向第一配置(參照圖8)與第二配置(參照圖9)切換。其結果，移動機構70能夠以對反應液20施加用于使核酸擴增的熱循環的方式使反應液20移動。在第一配置中，第一加熱部52與第二加熱部53相比在重力作用方向位于下方。在第二配置中，第二加熱部53與第一加熱部52相比在重力作用方向位于下方。移動機構70例如具有未圖示的馬達以及驅動軸。驅動軸與主體部50的凸緣56連接。驅動軸相對于核酸擴增反應用盒10的長度方向垂直設置，若使馬達動作，則以驅動軸為旋轉的軸使主體部50旋轉。熒光測定器80是測定收容于核酸擴增反應用盒10的反應液20的熒光強度(熒光亮度)的測定器。如圖9所示，熒光測定器80在第二配置中，相對于核酸擴增反應用盒10的底部12b隔開規定距離對置地配置。熒光測定器80基于來自處理部90的輸入信號，將與包含于反應液20的熒光標志探針的熒光色素對應的激勵光向反應液20照射，來測定由反應液20發光的熒光強度。此外，熒光測定器80可以測定與一個熒光色素對應的熒光強度，也可以測定與多個熒光色素對應的熒光強度。如圖10所示，處理部90根據例如存儲于存儲部96的程序，進行用于控制移動機構70、熒光測定器80的處理。處理部90例如通過cpu(centralprocessingunit中央處理機)等的處理程序等實現。操作部92取得與用戶的操作對應的操作信號，進行將操作信號發送至處理部90的處理。操作部92例如通過按鈕、鍵、觸摸面板型顯示器、話筒等實現。顯示部94顯示由處理部90生成的圖像。顯示部94例如通過lcd(liquidcrystaldisplay液晶顯示器)、crt(cathoderaytube陰極射線管)等實現。存儲部96存儲處理部90用于進行各種計算處理、控制處理的程序、數據等。另外，存儲部96被使用為處理部90的作業區域，用于暫時存儲處理部90根據各種程序執行的計算結果等。存儲部96例如通過ram(randomaccessmemory隨機存取存儲器)等實現。3.核酸擴增反應方法接下來，參照附圖對本實施方式的核酸擴增反應方法進行說明。圖11是用于對本實施方式的核酸擴增反應方法進行說明的流程圖。以下，作為一個例子，對使用了核酸擴增反應裝置100的核酸擴增反應方法進行說明。首先，將核酸擴增反應用盒10安裝于核酸擴增反應裝置100的安裝部51(步驟s2)。具體而言，在向填充有液體30的容器12導入反應液20后，將核酸擴增反應用盒10安裝于安裝部51。例如，在向安裝部51安裝核酸擴增反應用盒10后，利用蓋體60覆蓋安裝部51。此處，如圖8所示，加熱部52、53的配置為第一配置。在第一配置中，在重力作用方向的流路16的最下部存在第一區域16a。因此，比重大于液體30的反應液20位于第一區域16a。接下來，處理部90若從操作部92接受開始熱循環處理的主旨的信號，則控制加熱部52、53，對核酸擴增反應用盒10的第一區域16a以及第二區域16b進行加熱，而在流路16形成溫度梯度(步驟s4)。具體而言，第一加熱部52將第一區域16a加熱至第一溫度，第二加熱部53將第二區域16b加熱至低于第一溫度的第二溫度。由此，在流路16的第一區域16a與第二區域16b之間形成有溫度在第一溫度與第二溫度之間逐漸變化的溫度梯度。此處，加熱部52、53是形成溫度從第一區域16a朝向第二區域16b降低的溫度梯度的溫度梯度形成部。第一溫度是適于雙鏈dna的解離(改性反應)的溫度，例如，為95℃以上110℃以下。第二溫度是適于退火反應以及伸長反應的溫度，例如，為50℃以上75℃以下。加熱部52、53的配置為第一配置，因此若對核酸擴增反應用盒10進行加熱，則反應液20被加熱至第一溫度。接下來，處理部90若第一加熱部52到達第一溫度經過第一時間(第一期間)，則控制移動機構70，而將加熱部52、53的配置從第一配置向第二配置切換(步驟s6)。處理部90也可以內置計時器。第一時間是改性反應用的加熱時間，例如，為1秒以上10秒以下。移動機構70被處理部90控制，以第一時間成為1秒以上10秒以下的方式使反應液20移動。具體而言，處理部90對移動機構70進行控制而使主體部50旋轉180°。由此，加熱部52、53的配置從第一配置被切換成第二配置。如圖9所示，第二配置是使第二區域16b在重力作用方向位于流路16的最下部的配置。在第二配置中，第一區域16a與第二區域16b的重力作用方向的位置關系與第一配置相反。因此，反應液20通過重力的作用從第一區域16a向第二區域16b移動。處理部90在將加熱部52、53的配置設為第二配置后，使移動機構70的動作停止第二時間(第二期間)。由此，加熱部52、53的配置被保持于第二配置。第二時間是退火反應以及伸長反應用的加熱時間，為1秒以上10秒以下。移動機構70被處理部90控制，以第二時間成為1秒以上10秒以下的方式使反應液20移動。接下來，處理部90判定從第一配置向第二配置切換的次數(循環數)是否到達預先存儲于存儲部96的規定的次數(步驟s8)。每當進行從第一配置向第二配置的切換，處理部90均使循環數存儲于存儲部96，而將該循環數與預先存儲于存儲部96的規定的次數進行比較。處理部90在步驟s8中判定為循環數到達規定的次數的情況下(在圖11中，為“是”的情況下)，結束處理。另一方面，處理部90在步驟s8中判定為循環數未到達規定的次數的情況下(在圖11中為“否”的情況下)，移至步驟s10。在步驟s10中，處理部90控制移動機構70，將加熱部52、53的配置從第二配置向第一配置切換。處理部90在將加熱部52、53的配置設為第一配置后，使移動機構70的動作停止第一時間。然后，處理部90再次移至步驟s6，而將加熱部52、53的配置從第一配置向第二配置切換。如以上所述，處理部90更換第一配置與第二配置的位置并且使加熱部52、53(使主體部50)旋轉直至循環數成為規定的次數，從而使反應液20在流路16中往復運動。由此，核酸擴增反應裝置100能夠對反應液20施加用于使核酸擴增的熱循環。處理部90進一步與上述的熱循環處理同時期地進行擴增解析處理。由此，在核酸擴增反應裝置100中，能夠實時進行pcr。具體而言，每當將加熱部52、53的配置保持于第二配置，處理部90均相對于熒光測定器80輸入用于給予測定指示的信號。然后，處理部90作為熒光測定器80的測定結果，從熒光測定器80取得熒光強度，并將該熒光強度存儲于存儲部96。另外，處理部90也可以基于從操作部92被輸入的信號，從存儲部96讀出作為應該反復的循環數被設定的次數對應的熒光強度，基于該熒光強度，生成表示熒光強度相對于循環數的推移的擴增曲線。處理部90也可以基于該擴增曲線對相對于核酸的擴增效率的優劣進行判定，并使判定結果、擴增曲線顯示于顯示部94。此外，如上所述，在步驟s8中，處理部90雖對循環數是否到達規定的次數進行判定，但處理部90也可以對取得的熒光強度是否到達預先存儲于存儲部96的規定值進行判定。然后，處理部90也可以在判定為取得的熒光強度到達規定值的情況下，結束處理，在判定為取得的熒光強度未到達規定值的情況下，移至步驟s10。另外，如上，雖將第二溫度設為退火反應以及伸長反應用的溫度，但也可以將第二溫度設為退火反應以及伸長反應中的任意一方的反應用的溫度，也可以將第二時間設為退火反應以及伸長反應中的任意一方的反應用的加熱時間。在該情況下，雖未圖示，但核酸擴增反應裝置100具有將流路16的第三區域(與第一區域以及第二區域不同的區域)加熱至第三溫度(與第一溫度以及第二溫度不同的溫度)的第三加熱部。第三溫度是退火反應以及伸長反應中的另一方的反應用的溫度，第三時間是退火反應以及伸長反應中的另一方的反應用的加熱時間。但是，為了實現pcr的高速化，優選將第二溫度設為退火反應以及伸長反應用的溫度。4.實驗例以下，表示實驗例，對本發明更加具體地進行說明。此外，本發明不限定于以下的實驗例。4.1.樣品的調制作為模板核酸，使用a型的流感(infa)病毒的質體dna100復印品(1反應管)。此外，100復印品是lamp法(榮研化學)的lod(limitofdetection檢測極限)。將上述模板核酸添加于核酸擴增反應用試劑而調制了下述的混合試劑溶液。具體而言，調制了“1倍”、“2倍”、“4倍”、“6倍”、“8倍”、“10倍”、“12倍”7種混合試劑溶液。例如“2倍”的混合試劑溶液使聚合酶、dntp、引物、熒光標志探針的每一個相對于“1倍”的混合試劑溶液包含2倍。此外，下述的各試劑的液量(體積)是相對于混合試劑10μl的值。即，例如在“1倍”的混合試劑溶液中，聚合酶在混合試劑容器10μl中包含0.1μl。＜“1倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“2倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“4倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“6倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“8倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“10倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“12倍”的混合試劑溶液的組成＞此外，在上述的混合試劑溶液中，聚合酶使用了lifetechnologies社制。dntp使用了roche社制。正向引物以及反向引物使用了sigmaaldrich社制。熒光標志探針使用了sigmaaldrich社制的taqman(注冊商標)探針。水使用了roche社制。緩沖液的組成如下所述。mgcl2：25mmtris-hcl(ph9.0)：250mmkcl：125mm正向引物、反向引物、熒光標志探針的序列如下述表1所述。此外，在表1中，“fam”是指針色素，“bhq1”是淬滅色素。表1infa檢測用正向引物5’gaccratcctgtcacctctgac3’infa檢測用反向引物5’agggcattytggacaaakcgtcta3’infa檢測用熒光標志探針5’fam-cacaaatcctaaaattccct-bhq13’4.2.pcr結果從上述混合試劑溶液的每一個作為反應液提取1.6μl，注入填充有硅油的核酸擴增反應用盒。此外，從“1倍”的混合試劑溶液獲得的包含于反應液的聚合酶的量相當于0.5u。即，從“2倍”、“4倍”、“6倍”、“8倍”、“10倍”、“12倍”的混合試劑溶液獲得的包含于反應液的聚合酶的量分別相當于1u、2u、3u、4u、5u、6u。將第一溫度(改性反應用的溫度)設為105℃，將第一時間(改性反應用的期間)設為4秒，將第二溫度(退火反應以及伸長反應用的溫度)設為60℃，將第二時間(退火反應以及伸長反應用的期間)設為6秒，相對于各反應液，使用核酸擴增反應裝置100那樣的升降式pcr裝置進行pcr。此外，pcr以105℃加熱10秒進行熱開始。圖12是表示從“1倍”～“6倍”的混合試劑溶液獲得的反應液的pcr結果的圖表。圖13是表示從“8倍”～“12倍”的混合試劑溶液獲得的反應液的pcr結果的圖表。如圖12以及圖13所示，pcr相對于各反應液各進行了兩次。在圖12以及圖13中，橫軸表示熱循環的循環數，縱軸表示由熒光測定裝置測定出的熒光強度。如圖12以及圖13所示，在“1倍”～“8倍”的范圍內，能夠確認熒光強度的增加。熒光強度在“2倍”～“8倍”的范圍內進一步增加，在“4倍”～“8倍”的范圍內更進一步增加，在“6倍”～“8倍”的范圍內更加進一步增加。因此，將包含于反應液的正向引物以及反向引物的濃度設為0.4μm以上3.2μm以下，將包含于反應液的聚合酶的量設為0.5u以上4u以下，將包含于反應液的熒光標志探針的濃度設為0.15μm以上1.2μm以下，將包含于反應液的dntp的濃度設為0.125mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增。另外，將正向引物以及反向引物的濃度設為0.8μm以上3.2μm以下，將聚合酶的量設為1u以上4u以下，將熒光標志探針的濃度設為0.3μm以上1.2μm以下，將dntp的濃度設為0.25mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠更加高靈敏度地檢測核酸的擴增。另外，將正向引物以及反向引物的濃度設為1.6μm以上3.2μm以下，將聚合酶的量設為2u以上4u以下，將熒光標志探針的濃度設為0.6μm以上1.2μm以下，將dntp的濃度設為0.5mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠更進一步高靈敏度地檢測核酸的擴增。另外，將正向引物以及反向引物的濃度設為2.4μm以上3.2μm以下，將聚合酶的量設為3u以上4u以下，將熒光標志探針的濃度設為0.9μm以上1.2μm以下，將dntp的濃度設為0.75mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠更加進一步高靈敏度地檢測核酸的擴增。此外，在上述的實驗例的pcr中，將第二時間設為6秒，但若將引物、熒光標志探針以及dntp的濃度和聚合酶的量設為上述范圍內，則第二時間只要為1秒至10秒，則能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增。若將第二時間設為不足1秒，則核酸擴增反應裝置、核酸擴增反應用盒的設計變得困難。即，將第二時間設為1秒以上，從而核酸擴增反應裝置、核酸擴增反應用盒的設計變得容易，從而能夠提高設計的自由度。圖14是表示將第一時間設為5秒，將第二時間設為20秒的條件(標準條件)下的pcr結果與將第一時間設為3秒，將第二時間設為6秒的條件(高速條件)下的pcr結果的圖表。如圖14所示，在高速條件下，熒光強度降低。這被考慮為在高速條件下，核酸與熒光標志探針無法充分地混合是重要因素。上述的熒光強度的降低被確認為是在將第二時間設為10秒以下后。若將引物、熒光標志探針以及dntp的濃度和聚合酶的量設為上述范圍，則即使使pcr高速化，核酸與熒光標志探針也充分地混合，從而能夠高靈敏度地檢測核酸的擴增。圖15是表示將第一時間設為4秒，將第二時間設為6秒時的多重(multiplex)pcr(多項目同時pcr)結果的圖表。在圖15中，將b型的流感(infb)病毒100復印品設為模板核酸時，作為核酸擴增反應用試劑，使用僅能夠檢測infb的試劑、能夠檢測infb以及infa的試劑、能夠檢測infb、infa以及噬菌體ms2的試劑進行了pcr。如圖15所示，pcr相對于各反應液各進行兩次。如圖15所示，在多重pcr中，熒光強度降低。將引物、熒光標志探針以及dntp的濃度和聚合酶的量設為上述范圍內，從而能夠使熒光強度增加，因此在pcr的高速化、進行多重pcr的情況下，能夠稱為特別地有效。本發明包含與在實施方式中說明的構成實際相同的構成(例如，功能、方法以及結果相同的構成，或者目的以及效果相同的構成)。另外，本發明包含置換在實施方式中說明的構成的非本質的部分的構成。另外，本發明包含能夠起到與在實施方式中說明的構成相同的作用效果的構成或者實現相同的目的的構成。另外，本發明包含對在實施方式中說明的構成附加了公知技術的構成。符號說明2…移液管；10…核酸擴增反應用盒；12…容器；12a…側壁部；12b…底部；14…帽；16…流路；16a…第一區域；16b…第二區域；20…反應液；22…模板核酸溶液；24…核酸擴增反應用試劑；30…液體；50…主體部；51…安裝部；52…第一加熱部；52a…第一加熱器；52b…第一加熱部件；53…第二加熱部；53a…第二加熱器；53b…第二加熱部件；54…隔離件；55…底板；55a…貫通孔；56…凸緣；57…固定板；58…導線；60…蓋體；62…磁鐵部；70…移動機構；80…熒光測定器；90…處理部；92…操作部；94…顯示部；96…存儲部；100…核酸擴增反應裝置。【序列表自由文本】序列編號1是infa的正向引物的序列。序列編號2是infa的反向引物的序列。序列編號3是infa的熒光標志探針的序列。【序列表】請參照附頁序列表<110>精工愛普生株式會社<120>核酸擴增反應方法、核酸擴增反應裝置以及核酸擴增反應用試劑<130>j018697301<160>3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>infa正向引物<400>1gaccratcctgtcacctctgac22<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>infa反向引物<400>2agggcattytggacaaakcgtcta24<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>infa熒光探針<400>3cacaaatcctaaaattccct20當前第1頁12