CRISPR/Cas9靶向敲除人TCAB1基因及其特異性gRNA的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學與生物醫學技術領域，具體涉及基于CRISPR/Cas9系統的 gRNA序列在促進腫瘤細胞凋亡中的應用。
【背景技術】
[0002] CRISPR/Cas系統是從細菌和古生菌對抗外來病毒或質粒的適應性免疫系統發展 而來，包括三種不同的類型，其中Type II型的CRISPR/Cas系統的DNA內切酶Cas9只有一個 亞基，結構最為簡單，所以應用也最廣泛。除了Cas9蛋白外，該系統還包括兩條短的CRISPR RNAs (crRNAs)和trans-acti vating crRNAs (tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA復合體可 以通過堿基互補配對指導Cas9蛋白到革El序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif) 附近特異性剪切DNA雙鏈，形成DSB (doub 1 e strand break)。DSB可以通過兩種途徑被修復， 一種是非同源重組的末端接合(Non-Homologous End Joining NHEJ)DNA修復方式，另一種 是同源重組修復(Homology Directed Repair HDR)方式。NHEJ修復方式可能產生堿基的插 入或缺失，從而產生移碼突變，或者也可能突變成終止密碼子，這些突變形式都可以改變目 的基因的開放閱讀框;HDR方式需要一段與被剪切片段同源的模板片段來修復DSB，這種修 復方式可以將被用來作為模板的同源片段的序列復制到目的基因中，所以可以利用這種修 復方式將特定的基因片段引入到目的基因中。
[0003] 端粒是染色體末端的一段六核苷酸DNA重復序列，被認為是一段沉默基因，它在染 色體末端形成類似保護帽結構，避免染色體從末端雙鏈DNA被核酸酶水解，維持遺傳物質的 穩定性和干細胞及腫瘤細胞的無限增值潛能。而端粒DNA由端粒酶催化合成，合成機制涉及 一系列復雜過程，包括酶的生物合成組裝、全酶復合物核內的轉移定位和活性調控等。端粒 酶是一種具有端粒重復序列的核糖核蛋白復合物，它能夠識別端粒特定重復序列，并以自 身RNA序列為模板，以逆轉錄的形式合成新的端粒序列以補償有絲分裂過程中丟失的端粒 DNA〇
[0004] 端粒和端粒酶作為維持染色體的穩定的主要結構和細胞壽命的"生物鐘"，對于惡 性腫瘤的細胞永生化起到重要作用。當細胞發生癌變時，端粒DNA隨分裂活動發生漸進性縮 短的趨勢會啟動端粒酶，在端粒酶的作用下，正常的人體細胞可轉化成具有無限增值能力 的永生化惡性細胞，因此端粒DNA功能的異常是引起細胞衰老和癌變的重要標志之一。
[0005] 端粒酶卡扎爾體蛋白 1 (telomerase Ca jal body proteinl，TCAB1)是2009年新發 現的端粒酶關鍵核心蛋白組分，它能把端粒酶從卡扎爾體運輸到端粒末端的端粒合成目的 地，以確保端粒長度維持機制的正常啟動。TCAB1表達的缺失雖然不會影響端粒酶逆轉錄酶 (TERT)自身的活性劑對端粒酶RNA組分(TERC)的催化，但可在細胞的S期阻止端粒酶復合物 運送至端粒末端合成位點，最終導致端粒的形成和維持受到限制，引起端粒變短，這也意味 著癌細胞會更快地死亡。袁平等人(袁平.RNAi沉默TCAB1表達對肺腺癌A549細胞生物學行 為的影響[D ].浙江大學，2014)利用RNA干擾技術能顯著抑制TCAB1 mRNA和蛋白質的表達， 沉默TCAB1的表達能抑制肺腺癌細胞A549細胞中端粒酶與端粒的結合，抑制癌細胞增殖，但 是該研究結果顯示RNAi沉默并不能引起癌細胞凋亡。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于通過設計、構建、篩選，最終提供一些基于CRISPR/Cas9系統，同 時靶向人TCAB1基因的高效gRNA及其靶位點序列，并用其抑制人TCAB1基因的表達，抑制腫 瘤細胞的增殖，引起癌細胞的凋亡。
[0007] 為實現上述目的，本發明以CRISPR/Cas9系統原理及其gRNA的設計原理為基礎，軟 件設計預測出六個靶位點，并以px458為表達載體，構建了gRNA/Cas9表達系統，并在腫瘤細 胞模型中加以應用。通過篩選和一系列的分析測試，最終篩選出兩條位于第2外顯子上的有 效靶點，針對這兩個靶點設計的gRNA能使目標靶位點發生移碼突變。在人肝癌細胞株 (HepG2)中利用這兩個靶點指導的CRISPR/Cas9系統，可以有效的敲除人TCAB1基因，這一系 統易于操作，人TCAB1基因敲除效率高。本發明提供的gRNA指導的CRISPR/Cas9系統能高效、 靶向阻斷人TCAB1基因，對于CRISPR/Cas9系統充分發揮作用和腫瘤治療的靶標研究有極其 重要的作用。
[0008] 本發明申請的技術方案如下：
[0009] 1、6條靶向人TCAB1基因的高效gRNA設計合成以及gRNA/cas9表達系統構建。
[0010] 2、在腫瘤細胞模型中分析檢測gRNA對于腫瘤細胞增殖的抑制作用以及引起癌細 胞的凋亡作用，篩選到兩個有效的靶位點。
[0011] 3、在腫瘤細胞模型中分析檢測本發明gRNA指導的CRISPR/Cas9系統對于腫瘤細胞 增殖的抑制作用以及引起腫瘤細胞凋亡的作用。
【附圖說明】
[0012]附圖 1為T7Endonucl ease I酶切結果(其中1泳道為對照組，2泳道為實驗組）；
[0013] 附圖2為細胞克隆結果圖；
[0014] 附圖3為測序結果圖；
[0015] 附圖4為Western-blot檢測TCAB1蛋白表達結果圖；
[0016] 附圖5為流式檢測細胞凋亡圖（其中:A為對照組;B為實驗組）。
【具體實施方式】
[0017]實施例!靶向人TCAB1基因的gRNA合成及載體構建
[0018] 1、靶向人TCAB 1基因的gRNA的選擇和設計
[0019] 在Genebank中找到人TCAB1基因的序列，在人TCAB1基因的外顯子區域設計潛在靶 位點。通過在線設計工具(//crispr .111；[1:.6(111/)及81?嫩的設計原則，評估人11^131基因 序列上得分較高的靶位點設計gRNA，靶位點序列為SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.6,并設計對應 的寡核苷酸。
[0020] 2、靶向人TCAB1基因的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表達載體的構建
[0021] 將pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)質粒（Addgene plasmid ID:48138,以下簡稱 pSpCas9(BB))，用BbS頂每切，37°C水浴1小時后，1 %的瓊脂糖電泳，回收酶切產物(TAKARA膠 回收試劑盒）。
[0022] 酶切體系如下：
[0023]
[0024]將靶位點序列為SEQ ID NO. 1的兩寡核苷酸退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈 DNA，反應體系如下：
[0025]
[0026] 將上述反應體系在200ul PCR管中混合均勻，然后將PCR管在37°C水浴鍋中處理 30min，再放入500ml沸水中，自然冷卻至室溫。
[0027]連接體系：
[0028]
[0029]將帶有粘性末端的雙鏈短DNA產物連入酶切后的pSpCas9(BB)線性片段，將連接產 物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞(Takara Code:D9057A)，并涂布于Ampicillin濃度為100μ g/ml的LB固體平板上培養過夜，挑取生長良好的單克隆，于15ml Ampicillin濃度為100yg/ ml的LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜，提取質粒，命名為px458-TCABl-l。
[0030] 3、無內毒素質粒DNA的制備
[0031] A、取px458-TCABl-l質粒lyL加入100yL DH5a感受態細胞中吹勻，冰中靜置20min， 再放入42°C水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500yL LB液體培養基，放置搖床180rpm37 °Clh，取菌液100yL均勻涂布于Ampicillin濃度為100μg/ml的LB固體培養基37°C培養過夜。 [0032] B、取單菌落于3ml Ampicillin濃度為100μg/ml的LB液體培養基中，250rpm、37°C 振蕩培養8小時;從中取300yL菌液接種于300ml Ampici 11 in濃度為100μg/ml的LB液體培養 基中，并于250rpm、37°C振蕩培養12~16小時；
[0033] C、收集菌液，然后在4°C、4000rpm條件下離心15min，棄上清，收集菌體，然后按照 QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒說明書操作步驟提取質粒，得無內毒素的 px458-TCABl-l 質粒。
[0034]實施例2脂轉染HepG2細胞
[0035]轉染前3天，復蘇人肝癌細胞(HepG2細胞，中科院上海細胞庫），將細胞放入加有 10%的FBS+DMEM培養瓶中，于37°(3、5^^02的培養箱中培養，轉染前一天，傳代培養復蘇細 胞。
[0036] 將培養HepG2細胞T75瓶中的培養基吸凈，加入2ml 4°C冰箱取出的0.25 %胰酶，使 其均勻覆蓋瓶底，置于37°C培養箱中3-5min，取出，搖晃可發現細胞于底部脫離，將其全部 晃下，加入3ml 37°C水浴中預熱的10 %DMEM，用10ml移液管進行吹打，吹打6-8次，不留死 角，瓶口處較難吹打可將移液管對準培口，小力將培養基打出即可覆蓋到接近瓶口的細胞。 之后，將所有細胞吸出，置于15ml離心管中，取50ul混勾后的細胞于1.5ml eppendorf管中， 加入450ul 10%DMEM，即為10倍稀釋，混勻，取10ul細胞于計數板中計數。傳代當天記為第 一天，若第二天進行轉染，鋪900-1000萬/T75;若第三天轉染，鋪350-400萬/T75。每瓶T75加 10ml 10