專利名稱：基因診斷的微流控芯片電泳無膠篩分體系及其制備方法
技術領域：
本發明涉及微流控芯片電泳技術，尤其涉及一種基因診斷的微流控芯片電泳無膠
篩分體系及其制備方法。
背景技術：
毛細管電泳法已經可以實現對蛋白質、DNA片段的分離。凝膠是毛細管電泳中常用 的電泳介質，由于凝膠的粘度非常大，抗對流，能夠減小分離物質的擴散，能夠很好地限制 譜帶的展寬，分離效果很好，分離度高，柱效極高，廣泛應用在科研及醫學疾病診斷中，特別 是在基因診斷中的PCR產物檢測以及DNA的序列測定中。然而毛細管電泳消耗樣品量大使 得PCR過程變長，分離時間長使得結果分析不迅速，靈敏度也不夠高，分析一次樣品需要30 分鐘以上。而且凝膠的粘度很大使得凝膠的填充很困難。凝膠電泳時容易造成柱內氣泡， 從而使得毛細管壽命較短。 隨著微全分析系統的建立以及芯片實驗室的發展，根據毛細管中的電泳理論及技 術發展了一種微流控芯片電泳技術，同樣包括樣品的上樣與電泳分離。微流控芯片由于其 樣品消耗量小、反應快、靈敏度高、成本低和制作周期短而得到廣泛應用。針對微流控芯片 所具有的優點及毛細管凝膠電泳所存在的缺點，希望能有一種適合于微流控芯片電泳的快 速基因診斷的無膠篩分體系。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種基因診斷的微流控
芯片電泳無膠篩分體系及其制備方法。 本發明的目的是這樣實現的 1、體系 以水為溶劑； 以MES-Tris為背景電解質； 以羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯醇或聚環氧乙稀及其 2 5種的混合物為篩分介質； 以葡萄糖、甘油、甘露醇或殼聚糖及其2 4種的混合物為添加劑；MES-Tris的濃度范圍為10 300mmol/L的MES， 10 300mmol/L的Tris， pH為
5. 5 9. 0 ; 篩分介質的濃度(篩分介質的質量/體系的體積)為0. 1% 5% ;
添加劑的濃度(添加劑的質量/體系的體積)為0. 1 % 10% 。
其工作原理是MES(2-[N-嗎啉代]甲磺酸)和Tris(三羥甲基氨基甲烷)是一種很好的生物緩 沖液體系，pH范圍廣，可以從5. 5到9. O，具有很好的生物相容性。 與凝膠相比，羥丙基甲基纖維素(HPMC)等纖維素衍生物在低濃度下，O. 1% 5%
3范圍內具有較低的粘度，特別是HPMC-5， 25t:下在2%的水溶液中，其粘度只有5cP，和水的
粘度在一個數量級上。高分子聚合物溶于水中后，分子相互纏繞，形成孔徑大小一致的網狀
結構，孔徑的大小和聚合物的種類、分子的大小以及聚合物的濃度有關。在一定電場下，DNA
分子按照大小不同，在篩分介質中運行的速度不一樣，DNA分子小的運動速度快，DNA分子
大的運動速度慢，據此可以分離大小不一的PCR擴增樣品。由于DNA分子在芯片電泳中的
遷移速度只與其分子大小有關，所以可根據其遷移時間來確定DNA片段的大小，從而實現
對PCR產物分析，以便確定對疾病的診斷。然而，僅僅只有纖維素衍生物等高分子聚合物充
當篩分介質時，緩沖液體系的篩分能力，也即可分辨出兩個相差最小的DNA片段的能力有
限，所以在此基礎上添加一些低分子的多羥基有機物，比如葡萄糖、甘油、甘露醇等，可以提
高篩分介質的分離效率。纖維素衍生物具有很好的生物相容性，葡萄糖等多羥基有機物也
沒有毒性，對于PCR產物的分析檢測沒有毒性影響。 2、制備方法 本制備方法包括下列步驟 ①配制背景電解質 稱量MES和TRIS，加入去離子水中，攪拌均勻，使得MES的濃度為10 300mmo1/ L， TRIS的濃度的濃度為10 300mmol/L ;利用pH計調節背景電解質的pH，使其在5. 5
9. 0 ; ②加入篩分介質 加入稱量好的篩分介質，使篩分介質的質量/體系的體積為0. 1% 5% ; ③加入添加劑 根據需要加入添加劑，使添加劑的質量/體系的體積為0. 1 % 10% 。 3、用途 本發明所提供的基因診斷的微流控芯片電泳無膠篩分體系，適合于分離臨床疾病 的PCR產物，從而對診斷疾病做出參考。 本發明具有下列優點和積極效果 使用操作方便，篩分效果好，分離效率高。


圖1為分離100bp ladder DNA marker標準片段的微流控芯片無膠篩分電泳圖；
圖2為分離①X174-HaelIIDNA標準片段的微流控芯片無膠篩分電泳圖；
圖3為假肥大肌營養不良所對應基因的陰性樣品的PCR擴增產物的微流控芯片無 膠篩分電泳圖； 圖4為假肥大肌營養不良所對應基因的陽性樣品的PCR擴增產物的微流控芯片無
膠篩分電泳圖。
英譯漢 PCR : (Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈反應，是80年代中期發展起來的體 外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點； 能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬 倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA
4供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技 術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。
具體實施方式

—、體系 1、篩分介質可以是一種高分子聚合物，也可以是多種高分子聚合物的混合物。
2、添加劑可以是一種低分子親水有機物，也可以是多種低分子親水有機物的混合 物。 二、實施例
1、實施例1 以MES-Tris(80mM MES，40mM Tris)為背景電解質，pH為6. 12，以2%的羥丙基甲 基纖維素(HPMC-50，25°C 2%的水溶液下，其粘度為50cP)為篩分介質構成篩分體系。
實用該篩分體系成功的分離了 100bp ladder DNA marker標準片段，marker中的
六個片段都得到了基線分離，分離效果很好(圖1)。
2、實施例2 以MES-Tris(80mM MES， 40mMTris)為背景電解質，p朋.12，以3. 5%的羥丙基纖維 素(HPC)為篩分介質構成篩分體系。使用該篩分體系成功地分離了①X174-HaelIIDNA標 準片段，其中的271bp和281bP這兩個帶得到了很好的分離(圖2)。同時，利用該體系對 假肥大型肌營養不良這種疾病的PCR擴增產物進行了微流控芯片無膠篩分電泳分離。圖3 和圖4分別是利用該篩分體系對人體假肥大肌營養不良陰性樣品和陽性樣品的電泳分離。 從圖3中可以看出，正常人的外顯子47含量比外顯子6和外顯子13的含量少，而從圖4中 的陽性樣品檢測看出，外顯子47的含量比外顯子6和外顯子13的含量多，據此，根據樣品 電泳分離結果通過判斷外顯子47與外顯子6和外顯子13的含量多少就可以判斷出是否患 病。應用這一無膠篩分體系進行假肥大型肌營養不良的基因診斷，對臨床疾病診斷具有重 要意義。
權利要求
一種基因診斷的微流控芯片電泳無膠篩分體系，其特征在于以水為溶劑；以MES-Tris為背景電解質；以羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯醇或聚環氧乙稀及其2～5種的混合物為篩分介質；以葡萄糖、甘油、甘露醇或殼聚糖及其2～4種的混合物為添加劑；MES-Tris的濃度范圍為10～300mmol/L的MES，10～300mmol/L的Tris，pH為5.5～9.0；篩分介質的濃度為0.1％～5％；添加劑的濃度為0.1％～10％。
2. 按權利要求1所述體系的制備方法，其特征在于包括下列步驟① 配制背景電解質稱量MES和TRIS，加入去離子水中，攪拌均勻，使得MES的濃度為10 300mmol/L， TRIS的濃度的濃度為10 300mmol/L ;利用pH計調節背景電解質的pH，使其在5. 5 9. 0 ;② 加入篩分介質加入稱量好的篩分介質，使篩分介質的質量/體系的體積為0. 1% 5% ;③ 加入添加劑根據需要加入添加劑，使添加劑的質量/體系的體積為0. 1% 10%。
全文摘要
本發明公開了一種基因診斷的微流控芯片電泳無膠篩分體系及其制備方法，涉及微流控芯片電泳技術。本體系是以水為溶劑；以MES-Tris為背景電解質；以羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯醇或聚環氧乙烯及其2～5種的混合物為篩分介質；以葡萄糖、甘油、甘露醇或殼聚糖及其2～4種的混合物為添加劑。本制備方法是①配制背景電解質；②加入篩分介質；③加入添加劑。本發明使用安全方便，分離效率高，效果好；適合于分離臨床疾病的PCR產物，從而對診斷疾病做出參考。
文檔編號G01N27/447GK101693925SQ20091027243
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月16日 優先權日2009年10月16日
發明者劉威, 翁毅 申請人:武漢普賽微流科技有限責任公司;