本發明涉及(ji)由親(qin)脂的異喹啉-3-羧(suo)酸(suan)和(he)親(qin)水(shui)的rgdv序列肽(tai)結(jie)(jie)(jie)合形成(cheng)的新(xin)型兩親(qin)性(xing)脂質(zhi)體(ti)(ti)載體(ti)(ti)的制備，以及(ji)irv/stat3-sirna基因(yin)遞送(song)系統的構建(jian)，并且對其(qi)進行了(le)體(ti)(ti)內外抗腫瘤(liu)活性(xing)和(he)基因(yin)沉默效率的評價。本專(zhuan)利主要是通過異喹啉結(jie)(jie)(jie)構增(zeng)強抗腫瘤(liu)活性(xing)，結(jie)(jie)(jie)合rgdv序列肽(tai)增(zeng)強脂質(zhi)體(ti)(ti)的靶向性(xing)，使其(qi)在靶部位的濃度增(zeng)加，從(cong)而減小副作用，提高(gao)了(le)治(zhi)療(liao)指數(shu)。

背景技術：

基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)治療是指將發揮治療作用(yong)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)通過(guo)一定(ding)方式導入(ru)靶(ba)細(xi)胞(bao)，以糾正(zheng)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)缺陷或者沉默相(xiang)關(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表(biao)達，從而(er)起(qi)到抗腫(zhong)瘤(liu)的(de)(de)目的(de)(de)。stat基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)即信(xin)號(hao)(hao)轉導子與(yu)轉錄激(ji)活(huo)子，是一類新型的(de)(de)由細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)(yin)子、生(sheng)長因(yin)(yin)(yin)子等(deng)多肽類配(pei)體(ti)激(ji)活(huo)的(de)(de)細(xi)胞(bao)內信(xin)號(hao)(hao)傳遞和基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表(biao)達調(diao)控(kong)因(yin)(yin)(yin)子家族。其中stat3是這(zhe)個家族重(zhong)要的(de)(de)組成(cheng)，廣泛參與(yu)了多種細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)(yin)子的(de)(de)應(ying)答反應(ying)。研(yan)究(jiu)發現，對大多數成(cheng)人的(de)(de)正(zheng)常細(xi)胞(bao)、組織來說stat3并不是必須的(de)(de)，但是活(huo)化(hua)的(de)(de)stat3對腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)的(de)(de)形成(cheng)、生(sheng)長、凋亡等(deng)過(guo)程卻起(qi)著(zhu)重(zhong)要的(de)(de)調(diao)控(kong)作用(yong)，在(zai)腫(zhong)瘤(liu)轉移(yi)中是起(qi)重(zhong)要作用(yong)的(de)(de)媒介。同(tong)時stat3的(de)(de)異常激(ji)活(huo)也(ye)會導致下游基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)活(huo)化(hua)，包括vegf和survivin基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。

rna干擾技術是(shi)通過小干擾rna造成(cheng)目的(de)(de)mrna特(te)異(yi)性(xing)降解(jie),從而使(shi)基(ji)因(yin)轉(zhuan)(zhuan)錄后沉(chen)默的(de)(de)一(yi)種手段。利用stat3sirna阻斷stat3基(ji)因(yin)的(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)表達已成(cheng)為(wei)重要的(de)(de)抗癌研究。然而裸sirna在體內容(rong)易(yi)被(bei)rnase酶降解(jie)，半衰期短，轉(zhuan)(zhuan)染效率低(di)，這些(xie)缺(que)點(dian)限制(zhi)了sirna的(de)(de)活(huo)性(xing)，因(yin)而能夠穩(wen)定包裹sirna到達并轉(zhuan)(zhuan)入(ru)癌細胞的(de)(de)載體十分必要。

利用合(he)成(cheng)(cheng)的兩(liang)親性(xing)(xing)的異喹(kui)啉-3-酰基(ji)-rgdv替(ti)代磷脂(zhi)(zhi)，與(yu)膽固(gu)醇結合(he)形成(cheng)(cheng)空白脂(zhi)(zhi)質(zhi)體。再(zai)利用脂(zhi)(zhi)質(zhi)體-多聚陽離子-dna復合(he)物技(ji)術，帶正(zheng)電(dian)(dian)荷的魚精蛋白可以吸(xi)附sirna及小牛胸腺dna，形成(cheng)(cheng)一(yi)個(ge)穩定(ding)的帶負電(dian)(dian)的復合(he)物，并能(neng)最大限度壓縮sirna，此復合(he)物再(zai)與(yu)陽離子脂(zhi)(zhi)質(zhi)體復合(he)形成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體/sirna復合(he)物，形成(cheng)(cheng)一(yi)種(zhong)新型sirna遞送系統，提高(gao)了基(ji)因(yin)(yin)的轉染效(xiao)率。其中異喹(kui)啉是已被證明具有(you)抗血栓抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)等(deng)活(huo)性(xing)(xing)的結構，rgd是能(neng)夠與(yu)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)細胞中整合(he)素受體特異性(xing)(xing)結合(he)的序(xu)列肽，因(yin)(yin)此該載體還(huan)具有(you)靶向性(xing)(xing)和一(yi)定(ding)的抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)活(huo)性(xing)(xing)。

rgdv是一種含“精氨(an)(an)酸(suan)(suan)-甘氨(an)(an)酸(suan)(suan)-天(tian)冬氨(an)(an)酸(suan)(suan)”氨(an)(an)基酸(suan)(suan)序(xu)列的多肽，可識別腫(zhong)(zhong)瘤細胞(bao)表面特異(yi)表達(da)的整合素，并(bing)與其特異(yi)性結合從(cong)而來(lai)介導(dao)腫(zhong)(zhong)瘤的靶向治療。經(jing)過rgdv序(xu)列肽修飾的抗腫(zhong)(zhong)瘤藥(yao)(yao)物(wu)及其遞送(song)系統,可增加藥(yao)(yao)物(wu)的主動靶向性,從(cong)而達(da)到特異(yi)性治療的目(mu)的。

技術實現要素：

本發(fa)明的(de)目(mu)的(de)在(zai)于提供一(yi)種具有(you)靶向(xiang)性(xing)的(de)基因脂質體載體:isoquinoline-3-acyl-rgdv。

本發明所述(shu)的基因脂(zhi)質體載(zai)體的制(zhi)備方法，包括以下步驟(zou)：將(jiang)化(hua)學合(he)成(cheng)得到iq-cooh，與(yu)rgdv縮合(he)即(ji)得。

本發明的(de)(de)另一(yi)個目的(de)(de)在于提供一(yi)種基因遞(di)送(song)系統，由抗腫瘤基因治療(liao)藥(yao)物stat3-sirna，和權利要求1所(suo)述(shu)的(de)(de)基因脂質體(ti)載體(ti)isoquinoline-3-acyl-rgdv制備而(er)成。

本發(fa)明所述的(de)基(ji)因(yin)遞送系統中，抗腫(zhong)瘤基(ji)因(yin)治療(liao)藥物stat3-sirna(100nm)和(he)基(ji)因(yin)脂質體(ti)載體(ti)isoquinoline-3-acyl-rgdv(100％)的(de)用量(liang)比為1:1.1(μl:μl)。

本發明(ming)所述的基因(yin)遞送(song)系統，納米結(jie)構。

本(ben)發(fa)明的另一個目的在于提供基因遞送系統的制備方法。

本發(fa)明所述的制備方法，包括以下(xia)步(bu)驟：基(ji)(ji)因(yin)脂質體載體isoquinoline-3-acyl-rgdv與魚精蛋白室(shi)溫下(xia)混(hun)合(he)，靜置，備用，取小牛胸(xiong)腺dna與抗腫瘤(liu)基(ji)(ji)因(yin)治療藥物stat3-sirna室(shi)溫下(xia)混(hun)合(he)，靜置備用，將(jiang)上述兩種溶液混(hun)合(he)后，即得基(ji)(ji)因(yin)遞送(song)系統。

其中，基因(yin)脂質體(ti)載體(ti)的制備(bei)：

irv的合(he)成(cheng)：苯丙(bing)氨酸(suan)和甲醛在hcl的催化(hua)下(xia)發生(sheng)ps縮合(he)反(fan)應得到四氫異(yi)喹(kui)啉羧(suo)酸(suan)，經過(guo)(guo)甲酯化(hua)再氧化(hua)后脫甲酯得到異(yi)喹(kui)啉-3-羧(suo)酸(suan)。iq-cooh與(yu)h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl在thf中通過(guo)(guo)dcc/hobt反(fan)應，再脫掉保護基團形成(cheng)isoquinoline-3-acyl-rgdv(irv)。

優選的，本(ben)發明所述的基(ji)因脂質體載體的制(zhi)備：

在hcl的(de)(de)催(cui)化(hua)下(xia)，5g苯丙氨酸與甲(jia)醛在80～90℃油浴下(xia)發生(sheng)ps反應，縮(suo)合生(sheng)成四氫異喹啉(lin)羧酸(4hiq-cooh)；將4hiq-cooh在socl2的(de)(de)催(cui)化(hua)下(xia)，與甲(jia)醇發生(sheng)酯化(hua)反應，得到(dao)4hiq-ome；以thf作(zuo)溶劑(ji)，用高錳酸鉀催(cui)化(hua)氧化(hua)4hiq-ome為iq-ome；以甲(jia)醇為溶劑(ji)，在2nnaoh的(de)(de)催(cui)化(hua)下(xia)，iq-ome脫去甲(jia)酯，得到(dao)iq-cooh。

h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl的合成

取6gboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置于茄瓶(ping)中，冰浴(yu)條件(jian)下(xia)緩慢加(jia)入50ml鹽酸(suan)乙酸(suan)乙酯，瓶(ping)口(kou)接干燥管后薄層色(se)譜(pu)法監測反應(ying)進(jin)程(cheng)至反應(ying)完全結束，溫水(shui)浴(yu)下(xia)用水(shui)泵抽(chou)干液體，并用干燥乙酸(suan)乙酯和無水(shui)乙醚(mi)各磨洗3遍后抽(chou)干8h以上。

isoquinoline-3-acyl-rgdv的合成

取(qu)化(hua)合物isoquinoline-3-carboxylicacid646mg溶(rong)解于少量無水thf，加(jia)(jia)入(ru)hobt605mg攪拌至溶(rong)解，冰浴(yu)條(tiao)件下(xia)加(jia)(jia)入(ru)dcc923mg，活化(hua)30min后(hou)(hou)(hou)(hou)加(jia)(jia)入(ru)3.49gh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl，用nmm調節ph至8-9，撤掉冰浴(yu)后(hou)(hou)(hou)(hou)監測反應進程。反應結(jie)束后(hou)(hou)(hou)(hou)旋除(chu)過濾(lv)(lv)得到(dao)的黃(huang)(huang)色(se)液(ye)體，用ch2cl2溶(rong)解后(hou)(hou)(hou)(hou)分(fen)別用飽和堿、鹽、酸清(qing)洗共十(shi)八次，無水na2so4干燥(zao)過濾(lv)(lv)得到(dao)的濾(lv)(lv)液(ye)4h后(hou)(hou)(hou)(hou)旋除(chu)濾(lv)(lv)液(ye)，得到(dao)淡黃(huang)(huang)色(se)固(gu)體isoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl。柱層析純化(hua)后(hou)(hou)(hou)(hou)進行結(jie)構(gou)鑒(jian)定(ding)。取(qu)300mgisoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置于茄瓶中，冰浴(yu)條(tiao)件下(xia)緩慢加(jia)(jia)入(ru)tfa4.8ml，tfoh1.2ml，30min后(hou)(hou)(hou)(hou)加(jia)(jia)入(ru)冰無水乙(yi)醚(mi)終止反應，離心(3000rpm，3min)，用無水乙(yi)醚(mi)磨洗5遍后(hou)(hou)(hou)(hou)抽干得到(dao)黃(huang)(huang)色(se)粗產(chan)物，柱層析純化(hua)后(hou)(hou)(hou)(hou)凍干得到(dao)無色(se)晶體。

本發明所(suo)述(shu)的基因納米載體irv空白脂質體的制備，包括以下步驟(zou)：

100％irv膜(mo)材，irv與ch的(de)(de)重量比(bi)為15:1，1％(g/100ml)tween-80溶液，探(tan)頭超聲(sheng)20min(130w,90％,超2s,停2s)。突出比(bi)較100％irv膜(mo)材的(de)(de)優越(yue)性，同時制(zhi)備了75％irv、50％irv和25％irv含量的(de)(de)空白脂(zhi)質體膜(mo)材進行對比(bi)。

優選(xuan)的(de)，本(ben)發明所述(shu)的(de)基因納米載體(ti)irv空白(bai)脂(zhi)質體(ti)的(de)制備(bei)，包(bao)括以(yi)下步(bu)驟：

精確稱取(qu)60mgirv，用(yong)少量(liang)甲(jia)醇(chun)溶(rong)(rong)解后(hou)(hou)轉移至(zhi)10ml容(rong)(rong)量(liang)瓶，用(yong)氯仿定(ding)(ding)容(rong)(rong)至(zhi)10ml后(hou)(hou)超聲溶(rong)(rong)解。稱取(qu)0.4gtween-80于(yu)50ml燒杯中，以40mldepc處理水超聲溶(rong)(rong)解。精確稱取(qu)38.7mgch，用(yong)少量(liang)氯仿溶(rong)(rong)解后(hou)(hou)轉移至(zhi)10ml容(rong)(rong)量(liang)瓶，用(yong)氯仿定(ding)(ding)容(rong)(rong)至(zhi)10ml。精確稱取(qu)75mgpe，用(yong)少量(liang)氯仿溶(rong)(rong)解后(hou)(hou)轉移至(zhi)10ml容(rong)(rong)量(liang)瓶，用(yong)氯仿定(ding)(ding)容(rong)(rong)至(zhi)10ml，

取0.906ml的irv和0.094ml的ch加(jia)入(ru)到(dao)25ml茄瓶內，補氯仿至2ml。真空旋轉蒸發的條件為37℃水(shui)浴(yu)，120rpm，250mbar，30min后(hou)每5min降(jiang)低50mbar直至1mbar，得(de)到(dao)均一(yi)薄膜。真空干(gan)燥后(hou)加(jia)入(ru)適量水(shui)化(hua)溶液即不同濃度的tween-80，輕搖水(shui)化(hua)超聲10min后(hou)進(jin)行(xing)探(tan)頭超聲，冷卻后(hou)得(de)到(dao)含100％irv的空白脂質(zhi)體溶液。

本發明所述的基因遞送系統(tong)的制(zhi)備(bei)方法(fa)，包括以下步驟：

首先吸(xi)(xi)取(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)入(ru)(ru)(ru)6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)牛(niu)胸(xiong)腺(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)(xi)取(qu)1μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)入(ru)(ru)(ru)5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)(yu)精蛋(dan)白(bai)(bai)，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩(liang)(liang)種復(fu)(fu)合(he)物混(hun)合(he)后，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)入(ru)(ru)(ru)967.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水即得(de)到(dao)100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)100％irv/stat3-sirna。吸(xi)(xi)取(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)入(ru)(ru)(ru)6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)牛(niu)胸(xiong)腺(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)(xi)取(qu)14μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)入(ru)(ru)(ru)15μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)(yu)精蛋(dan)白(bai)(bai)，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩(liang)(liang)種復(fu)(fu)合(he)物混(hun)合(he)后，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)入(ru)(ru)(ru)954.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水即得(de)到(dao)100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)75％irv/stat3-sirna。吸(xi)(xi)取(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)入(ru)(ru)(ru)6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)牛(niu)胸(xiong)腺(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)(xi)取(qu)20μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)入(ru)(ru)(ru)20μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)(yu)精蛋(dan)白(bai)(bai)，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩(liang)(liang)種復(fu)(fu)合(he)物混(hun)合(he)后，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)入(ru)(ru)(ru)943.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水即得(de)到(dao)100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)50％irv/stat3-sirna。吸(xi)(xi)取(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)入(ru)(ru)(ru)6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)牛(niu)胸(xiong)腺(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)(xi)取(qu)38μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)入(ru)(ru)(ru)22.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)(yu)精蛋(dan)白(bai)(bai)，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩(liang)(liang)種復(fu)(fu)合(he)物混(hun)合(he)后，室(shi)(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)靜(jing)(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)入(ru)(ru)(ru)923μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水即得(de)到(dao)100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)25％irv/stat3-sirna。

本發(fa)明的(de)(de)(de)另一(yi)個目的(de)(de)(de)在于提供基因遞送系(xi)統在制(zhi)(zhi)備抑制(zhi)(zhi)腫瘤的(de)(de)(de)藥(yao)物中的(de)(de)(de)應(ying)用。

本(ben)發明的(de)(de)(de)另一個(ge)目(mu)的(de)(de)(de)在于涉及(ji)以肺癌a549細胞株為模型(xing)，用(yong)mtt法評價基因載體irv對a549細胞的(de)(de)(de)細胞毒性和stat3-sirna/irv的(de)(de)(de)體外抗腫(zhong)瘤(liu)(liu)活(huo)性，結果顯示100％irv和75％irv對a549細胞表現出(chu)較弱(ruo)的(de)(de)(de)抗腫(zhong)瘤(liu)(liu)活(huo)性，50％irv和25％irv在高(gao)濃(nong)度下有細胞毒性，并(bing)且100％irv/stat3-sirna具(ju)有良好的(de)(de)(de)體外抗腫(zhong)瘤(liu)(liu)活(huo)性。

本發明的(de)(de)另一個目的(de)(de)在(zai)于涉及以肺(fei)(fei)(fei)癌a549細胞(bao)(bao)株(zhu)為(wei)模型，用annexinv-fitc/pi雙染法(fa)考察irv/stat3-sirna誘導肺(fei)(fei)(fei)癌a549細胞(bao)(bao)的(de)(de)凋(diao)亡(wang)率(lv)，并且通過pi染色法(fa)考察了irv/stat3-sirna對肺(fei)(fei)(fei)癌a549細胞(bao)(bao)周期(qi)的(de)(de)影響(xiang)。annexinv-fitc/pi雙染法(fa)結(jie)果(guo)顯示irv/stat3-sirna(濃度為(wei)100nm)作用的(de)(de)a549細胞(bao)(bao)在(zai)48h的(de)(de)凋(diao)亡(wang)率(lv)為(wei)43.8％；周期(qi)實驗結(jie)果(guo)顯示100％irv/stat3-sirna具有周期(qi)依賴性，將處(chu)于有絲分裂的(de)(de)a549細胞(bao)(bao)阻(zu)滯(zhi)在(zai)g2/m期(qi)。

本發明的(de)(de)(de)另一個目的(de)(de)(de)在于涉(she)及以肺癌a549細胞(bao)株為(wei)(wei)模型，通(tong)(tong)過elisa測(ce)定(ding)蛋白(bai)水(shui)(shui)平的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因沉默(mo)效(xiao)率，通(tong)(tong)過rt-pcr測(ce)定(ding)mrna水(shui)(shui)平的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因沉默(mo)效(xiao)率。在mrna水(shui)(shui)平，100％irv/stat3-sirna能夠下調stat3-sirna相應mrna的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)，濃度(du)為(wei)(wei)100nm的(de)(de)(de)抑(yi)(yi)制(zhi)率為(wei)(wei)49.5±2.8％，同時stat3-sirna的(de)(de)(de)下調造成下游基(ji)(ji)因vegf和survivin相應mrna表(biao)(biao)達(da)的(de)(de)(de)降低，vegf的(de)(de)(de)抑(yi)(yi)制(zhi)率為(wei)(wei)66.8±4.7％，survivin的(de)(de)(de)抑(yi)(yi)制(zhi)率為(wei)(wei)51.9±11.9％；在蛋白(bai)水(shui)(shui)平，100％irv/stat3-sirna能夠下調stat蛋白(bai)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)，濃度(du)為(wei)(wei)100nm的(de)(de)(de)抑(yi)(yi)制(zhi)率為(wei)(wei)37.82±2.98％。

本(ben)發明的(de)另一個目(mu)的(de)在(zai)于(yu)涉及以荷s180腹水瘤小(xiao)(xiao)鼠(shu)模型進行(xing)體內抗腫(zhong)瘤活性(xing)評價(jia)，irv/stat3-sirna復合物中stat3-sirna的(de)給藥(yao)劑量為(wei)0.3mg/kg，其抑瘤率為(wei)52.73％；并且通過(guo)對(dui)小(xiao)(xiao)鼠(shu)各(ge)臟器進行(xing)勻漿處(chu)理后測(ce)定ft-ms，結果顯示在(zai)腫(zhong)瘤部位能夠檢(jian)測(ce)到rgdv分子，說明irv/stat3-sirna具有腫(zhong)瘤靶(ba)向性(xing)。

對說(shuo)明書中(zhong)出(chu)現的以下詞語作(zuo)進(jin)一步的解釋(shi)：

rgdv：arg-gly-asp-val，精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-纈氨酸

stat：信號轉(zhuan)導子與轉(zhuan)錄激活子

dmf：n,n-二甲基甲酰胺

dcc：二環己(ji)基碳(tan)二亞胺(an)

hobt：1-羥基苯(ben)并三(san)唑

tfa：三氟乙酸

tfoh：三(san)氟甲磺酸

od值：光密度值

depc：焦碳酸二乙酯

nc：非同(tong)源-sirna

fbs：胎牛血清

fam：羥基熒光素

mtt:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮(dan)唑溴鹽

dmso：二甲基(ji)亞砜(feng)

ns：生理鹽水

elisa：酶聯免疫吸附(fu)測定

rt-pcr：逆轉錄-聚合酶鏈(lian)式反應

附圖說明

附圖1為(wei)irv/stat3-sirna在a549細胞(bao)的轉染效果(guo)圖。

注：irv為“isoquinoline-3-acyl-rgdv”的縮寫，lipo2000為“lipofectamine^tm2000”的縮寫。

附圖2為irv對a549細胞(bao)的細胞(bao)毒性。

附圖3為irv/stat3-sirna的體(ti)外(wai)抗(kang)腫瘤活性。

注：irv為“isoquinoline-3-acyl-rgdv”的縮寫，lipo為“lipofectamine^tm2000”的縮寫；▲表示與(yu)stat3-sirna/100％irv組相(xiang)比p＜0.05，有(you)統計學差異。

附圖(tu)4為100％irv/stat3-sirna對a549細胞的凋(diao)亡作(zuo)用。

a:空白對照組24h內對a549細胞(bao)的凋亡作用

b:裸sirna對照組(zu)24h內對a549細胞(bao)的凋亡作用(yong)

c:100％irv/stat3-sirna組24h內(nei)對a549細(xi)胞的凋亡作用

d:空白對(dui)(dui)照(zhao)組48h內對(dui)(dui)a549細胞的凋(diao)亡作(zuo)用

e:裸sirna對(dui)照組24h內對(dui)a549細胞的凋亡作用(yong)

f:100％irv/stat3-sirna組24h內對(dui)a549細胞的(de)凋亡作用

附圖5為100％irv/stat3-sirna對a549細胞周期的影(ying)響。

a:24h內各組(zu)藥物對細胞(bao)周期的影響

b:48h內(nei)各組藥物對細胞周期的影響

附圖6為(wei)各(ge)組stat3蛋白的含量。

注：irv為“isoquinoline-3-acyl-rgdv”的縮(suo)寫(xie)，lipo2000為“lipofectaminetm2000”的縮(suo)寫(xie)。

附(fu)圖7為各組stat3-mrna的含量。

注：irv為“isoquinoline-3-acyl-rgdv”的縮寫，lipo2000為“lipofectaminetm2000”的縮寫。

附圖8為各組vegf-mrna和survivin-mrna的含量。

注：irv為“isoquinoline-3-acyl-rgdv”的(de)縮(suo)寫(xie)。

附圖9為ns、100％irv/stat3-sirna、stat3-sirna、100％irv和dox組的臟(zang)體比。

附圖(tu)10為ns、100％irv/stat3-sirna、stat3-sirna、100％irv和dox組的瘤重。

附(fu)圖11為ns組和100％irv/stat3-sirna組臟器(qi)勻(yun)漿(jiang)液的ft-ms圖。

a:100％irv/sirna組(zu)腫瘤(liu)組(zu)織(zhi)液的(de)ft-ms圖

b:100％irv/sirna組(zu)心臟組(zu)織液的(de)ft-ms圖

c:100％irv/sirna組腎臟(zang)組織液的ft-ms圖

d:100％irv/sirna組脾臟組織液(ye)的ft-ms圖

e:100％irv/sirna組腦(nao)組織液的(de)ft-ms圖(tu)

f:100％irv/sirna組肝臟組織液的ft-ms圖

g:生理鹽水組腫(zhong)瘤組織液的ft-ms圖

h:生理鹽水(shui)組心臟組織液的ft-ms圖(tu)

i:生理鹽水組(zu)腎臟組(zu)織液的ft-ms圖

j:生理鹽水組(zu)脾臟組(zu)織液的ft-ms圖

k:生理鹽(yan)水組腦組織液的ft-ms圖

l:生理鹽水組(zu)肝臟組(zu)織液的ft-ms圖

具體實施方式

實施例1.irv/stat3-sirna的制備

isoquinoline-3-carboxylicacid的(de)合成

在hcl的催化(hua)(hua)下，5g苯丙氨(an)酸與甲(jia)醛在80～90℃油浴(yu)下發(fa)生ps反應，縮合生成四氫異喹(kui)啉羧酸(4hiq-cooh)；將4hiq-cooh在socl2的催化(hua)(hua)下，與甲(jia)醇發(fa)生酯化(hua)(hua)反應，得到4hiq-ome；以thf作溶劑，用高錳(meng)酸鉀催化(hua)(hua)氧化(hua)(hua)4hiq-ome為iq-ome；以甲(jia)醇為溶劑，在2nnaoh的催化(hua)(hua)下，iq-ome脫(tuo)去甲(jia)酯，得到iq-cooh。

h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl的合成

取6gboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置于茄瓶中(zhong)，冰(bing)浴(yu)條件下緩慢加入50ml鹽酸(suan)(suan)(suan)乙酸(suan)(suan)(suan)乙酯，瓶口接干(gan)燥管(guan)后薄層色譜法(fa)監測反(fan)應進程至反(fan)應完全結束，溫水浴(yu)下用水泵抽干(gan)液體，并用干(gan)燥乙酸(suan)(suan)(suan)乙酯和無(wu)水乙醚各(ge)磨洗3遍(bian)后抽干(gan)8h以上。

isoquinoline-3-acyl-rgdv的合成

取(qu)化(hua)合物isoquinoline-3-carboxylicacid646mg溶解(jie)于少量無(wu)(wu)水(shui)thf，加(jia)入hobt605mg攪(jiao)拌(ban)至(zhi)溶解(jie)，冰(bing)浴(yu)條件下加(jia)入dcc923mg，活化(hua)30min后(hou)(hou)加(jia)入3.49gh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl，用(yong)nmm調節ph至(zhi)8-9，撤掉冰(bing)浴(yu)后(hou)(hou)監測反應進程。反應結束后(hou)(hou)旋除(chu)過濾得(de)(de)到的黃(huang)色(se)液(ye)體，用(yong)ch2cl2溶解(jie)后(hou)(hou)分別(bie)用(yong)飽和(he)堿、鹽、酸清洗共十八次(ci)，無(wu)(wu)水(shui)na2so4干燥過濾得(de)(de)到的濾液(ye)4h后(hou)(hou)旋除(chu)濾液(ye)，得(de)(de)到淡黃(huang)色(se)固體isoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl。柱(zhu)層析純化(hua)后(hou)(hou)進行結構(gou)鑒定。取(qu)300mgisoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置于茄(qie)瓶中，冰(bing)浴(yu)條件下緩慢加(jia)入tfa4.8ml，tfoh1.2ml，30min后(hou)(hou)加(jia)入冰(bing)無(wu)(wu)水(shui)乙(yi)醚終(zhong)止(zhi)反應，離(li)心(xin)(3000rpm，3min)，用(yong)無(wu)(wu)水(shui)乙(yi)醚磨洗5遍(bian)后(hou)(hou)抽(chou)干得(de)(de)到黃(huang)色(se)粗(cu)產物，柱(zhu)層析純化(hua)后(hou)(hou)凍干得(de)(de)到無(wu)(wu)色(se)晶(jing)體。

結構鑒定結果：[m-h]⁺＝599.51，[m+h]⁺＝601.13；

¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.430(s,1h),9.391(s,1h),9.129(d,j＝8hz,1h),8.915(t,1h),8.847(d,j＝8hz,1h),8.554(s,1h),8.247(d,j＝8hz,1h),8.186(d,j＝8hz,1h),7.874(m,1h),7.807(m,1h),7.241(s,2h),7.014(d,j＝8.5hz,1h),4.704(m,1h),4.337(m,1h),4.112(dd,j＝10hz,j＝8hz,1h),3.934(dd,j＝8hz,

j＝4.5hz,1h),3.516(dd,j＝17hz,j＝5hz,1h),3.194(m,1h),2.974(m,1h),2.621(dd,j＝16hz,j＝3.5hz,1h),2.252(dd,j＝11hz,j＝5.5hz,1h),2.195(m,1h),2.028(m,1h),1.911(m,1h),1.583(m,2h),0.812(d,j＝3.5hz,6h)；

¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ/ppm＝175.90,174.07,172.43,170.62,168.80,164.03,158.09,152.20,143.59,135.83,131.91,129.78,129.72,128.48,128.36,120.27,58.61,52.55,50.67,42.91,41.07,38.02,31.67,31.36,24.72,19.72,18.26；

uv檢測到化合物的最大吸收波(bo)長為275.5nm；

在275.5nm波長下進行hplc檢測，純度＝98.08±1.2％，分離條件(jian)為(wei)色譜柱(zhu)4.6mm×5.0um×250mmsymmetryc185um4.6×250mmcolumn，甲醇：水(0.1％冰醋(cu)酸)＝45:55，流速1ml/min，時間20min；

ir：νn-h3293cm^-1,3204cm^-1,δn-h1625cm^-1；νc＝o1650cm^-1；ν＝c-h3064cm^-1；νc-h2967cm^-1,2933cm^-1,2831cm^-1,δc-h1468cm^-1,1390cm^-1；νc＝c1514cm^-1,1468cm^-1,δc＝c746cm^-1。

irv空白脂質體的制(zhi)備

精確(que)稱取60mgirv，用(yong)(yong)少(shao)量(liang)(liang)甲(jia)醇溶解后(hou)轉移至(zhi)(zhi)10ml容(rong)(rong)量(liang)(liang)瓶(ping)，用(yong)(yong)氯(lv)仿定(ding)容(rong)(rong)至(zhi)(zhi)10ml后(hou)超聲(sheng)溶解。稱取0.4gtween-80于50ml燒杯中(zhong)，以40mldepc處理水超聲(sheng)溶解。精確(que)稱取38.7mgch，用(yong)(yong)少(shao)量(liang)(liang)氯(lv)仿溶解后(hou)轉移至(zhi)(zhi)10ml容(rong)(rong)量(liang)(liang)瓶(ping)，用(yong)(yong)氯(lv)仿定(ding)容(rong)(rong)至(zhi)(zhi)10ml。精確(que)稱取75mgpe，用(yong)(yong)少(shao)量(liang)(liang)氯(lv)仿溶解后(hou)轉移至(zhi)(zhi)10ml容(rong)(rong)量(liang)(liang)瓶(ping)，用(yong)(yong)氯(lv)仿定(ding)容(rong)(rong)至(zhi)(zhi)10ml。

取0.906ml的(de)(de)irv和0.094ml的(de)(de)ch加(jia)入(ru)到25ml茄瓶內(nei)，補氯仿(fang)至(zhi)2ml。真空旋(xuan)轉蒸發的(de)(de)條件為37℃水(shui)(shui)浴，120rpm，250mbar，30min后(hou)每5min降低50mbar直至(zhi)1mbar，得(de)到均一薄膜。真空干燥(zao)后(hou)加(jia)入(ru)適(shi)量(liang)水(shui)(shui)化溶液即不同(tong)濃(nong)度的(de)(de)tween-80，輕搖水(shui)(shui)化超(chao)聲10min后(hou)進行(xing)探頭超(chao)聲，冷卻后(hou)得(de)到含100％irv的(de)(de)空白脂(zhi)質體(ti)溶液。用同(tong)樣的(de)(de)方法制備(bei)75％irv,50％irv和25％irv。

irv/stat3-sirna的(de)制備

根(gen)據電(dian)泳篩選(xuan)結(jie)果(guo)，首先吸(xi)取(qu)(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)(jia)(jia)入6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)牛(niu)(niu)胸腺(xian)(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)取(qu)(qu)1μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)(jia)(jia)入5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)精(jing)蛋(dan)(dan)白，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩種(zhong)復合物(wu)(wu)混合后(hou)(hou)，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)(jia)(jia)入967.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水(shui)(shui)即得到100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)100％irv/stat3-sirna。吸(xi)取(qu)(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)(jia)(jia)入6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)牛(niu)(niu)胸腺(xian)(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)取(qu)(qu)14μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)(jia)(jia)入15μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)精(jing)蛋(dan)(dan)白，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩種(zhong)復合物(wu)(wu)混合后(hou)(hou)，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)(jia)(jia)入954.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水(shui)(shui)即得到100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)75％irv/stat3-sirna。吸(xi)取(qu)(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)(jia)(jia)入6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)牛(niu)(niu)胸腺(xian)(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)取(qu)(qu)20μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)(jia)(jia)入20μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)精(jing)蛋(dan)(dan)白，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩種(zhong)復合物(wu)(wu)混合后(hou)(hou)，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)(jia)(jia)入943.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水(shui)(shui)即得到100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)50％irv/stat3-sirna。吸(xi)取(qu)(qu)10μlstat3-sirna，加(jia)(jia)(jia)入6.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)牛(niu)(niu)胸腺(xian)(xian)dna，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；吸(xi)取(qu)(qu)38μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)irv加(jia)(jia)(jia)入22.5μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)魚(yu)精(jing)蛋(dan)(dan)白，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)10min；將(jiang)兩種(zhong)復合物(wu)(wu)混合后(hou)(hou)，室(shi)(shi)(shi)溫(wen)(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)靜(jing)(jing)置(zhi)(zhi)15min。加(jia)(jia)(jia)入923μl的(de)(de)(de)(de)(de)(de)depc水(shui)(shui)即得到100nm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)

25％irv/stat3-sirna。

實施例2.irv/stat3-sirna的體外(wai)抗腫瘤活性評價

激光共聚焦顯微鏡考察(cha)sirna的轉(zhuan)染效果

人類肺癌細胞系a549細胞是貼壁生長的細胞，以適量濃度接種于培養瓶中,加入含10％胎牛血清,100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的1640完全培養液，置于37℃恒溫、5％co2飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期a549細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶,消化1min30s后，離心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至1.5×10⁵個/ml，每個激光共聚焦培養小皿中加入2ml細胞液，共六組，37℃恒溫、5％co2培養過夜。小心棄掉上清液，pbs洗一次，分別加入2ml含有100nm的100％irv/stat3-sirna、75％irv/stat3-sirna、50％irv/stat3-sirna、25％irv/stat3-sirna和裸stat3-sirna的無血清1640培養基，以及2ml含有100nmirv/lipofectamine^tm2000的無血清(qing)1640培養基，轉染4h。吸去上清(qing)液，1mlpbs洗(xi)3次，每個培養皿加(jia)1mlhochest染液(pbs稀釋，工作濃度為4μg/ml),染色15min。吸去上清(qing)液，用1mlpbs洗(xi)3次，最后加(jia)入1mlpbs。置(zhi)于激光共聚焦顯微(wei)鏡下觀察。

實驗結果

本實驗中(zhong)，irv包載的(de)(de)(de)sirna是fam標(biao)記的(de)(de)(de)stat3-sirna，從圖1中(zhong)我們(men)可(ke)以(yi)(yi)看(kan)出100％irv/stat3-sirna組(zu)和lipo2000/stat3-sirna的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)核(he)(被(bei)hochest33342染(ran)成藍色(se)(se))周(zhou)圍(wei)有(you)大部分(fen)綠(lv)色(se)(se)熒光(guang)(fam),75％irv/stat3-sirna組(zu)細(xi)胞(bao)核(he)周(zhou)圍(wei)小(xiao)部分(fen)綠(lv)色(se)(se)熒光(guang)，50％irv/stat3-sirna組(zu)、25％irv/stat3-sirna組(zu)細(xi)胞(bao)核(he)周(zhou)圍(wei)有(you)少量(liang)或幾乎沒(mei)有(you)綠(lv)色(se)(se)熒光(guang)，而裸stat3-sirna組(zu)細(xi)胞(bao)核(he)周(zhou)圍(wei)沒(mei)有(you)綠(lv)色(se)(se)的(de)(de)(de)熒光(guang)，可(ke)以(yi)(yi)得出結(jie)論：stat3-sirna被(bei)100％irv、75％irv以(yi)(yi)及市(shi)售轉染(ran)載體試劑lipo2000成功遞(di)送進(jin)a549細(xi)胞(bao)內，并(bing)且分(fen)布(bu)在細(xi)胞(bao)核(he)周(zhou)圍(wei)。

irv的細胞毒作用

將a549細胞以適量濃度接種于培養瓶中，加入含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的1640完全培養液,置于37℃恒溫、5％co2飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期a549細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶，消化1min30s后,離心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至1.5×10⁵個/ml。取96孔培(pei)(pei)養(yang)板，pbs液封(feng)，設(she)空(kong)白培(pei)(pei)養(yang)基組，其余(yu)每孔加入100μl細(xi)胞(bao)懸液，在(zai)37℃，5％co2的培(pei)(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)中培(pei)(pei)養(yang)過(guo)夜。小心棄(qi)去培(pei)(pei)養(yang)液，加入含100％irv、75％irv、50％irv、25％irv的1640培(pei)(pei)養(yang)基100μl，濃度(du)依次(ci)為(wei)(wei)40nm、60nm、80nm、100nm、120nm。每個濃度(du)設(she)置五個復孔。置于(yu)培(pei)(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)內培(pei)(pei)養(yang)24h。每孔加入20μl新鮮配(pei)制的濃度(du)為(wei)(wei)5mg/ml的mtt，37℃，5％co2培(pei)(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)繼續培(pei)(pei)養(yang)4h。離(li)心后小心棄(qi)去上清液，并加入150μldmso，用微型振蕩(dang)器震(zhen)蕩(dang)700r，10min。混勻(yun)后，在(zai)酶標儀上以檢(jian)測(ce)波長為(wei)(wei)490nm測(ce)定(ding)吸光度(du)(od)值(zhi)，計算細(xi)胞(bao)存活(huo)率。細(xi)胞(bao)存活(huo)率(％)＝[(實(shi)驗組od值(zhi)-空(kong)白組od值(zhi))/(對照組od值(zhi)-空(kong)白組od值(zhi))]×100％。上述實(shi)驗重復三次(ci)。

實驗結果

從圖2中我(wo)們(men)可以看出隨著濃度的增加(jia)，與(yu)空(kong)白組相比較(jiao)，100％irv和75％irv組細(xi)胞存活率(lv)沒有明顯性(xing)差異(yi)(p>0.05)，產生抗腫瘤活性(xing)較(jiao)弱。50％irv和25％irv在高濃度下產生較(jiao)強(qiang)的細(xi)胞毒性(xing)，說明irv有抗腫瘤作用。

irv/stat3-sirna的體外抗腫瘤活性

取對數生長期的a549細胞，胰酶消化后,用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至1.5×10⁵個(ge)/ml。每孔(kong)種100μl細(xi)胞(bao)懸(xuan)液于96孔(kong)培(pei)(pei)養(yang)板內，37℃，5％co2培(pei)(pei)養(yang)過夜。小心棄去培(pei)(pei)養(yang)液，加入(ru)100μl含40nm，60nm，80nm和100nm，120nm的(de)(de)stat3-sirna，100％irv/nc，lipo2000/stat3-sirna的(de)(de)無血清1640培(pei)(pei)養(yang)基，以及(ji)100％irv/stat3-sirna,75％irv/stat3-sirna，50％irv/stat3-sirna和25％irv/stat3-sirna的(de)(de)無血清1640培(pei)(pei)養(yang)基。每組(zu)每個(ge)濃(nong)度(du)(du)設置五(wu)個(ge)復(fu)孔(kong)。轉染4h，棄掉(diao)上(shang)清液，每孔(kong)加入(ru)100μl含10％fbs的(de)(de)1640培(pei)(pei)養(yang)基，然后(hou)繼(ji)續培(pei)(pei)養(yang)20h。每孔(kong)加入(ru)20μl新(xin)配(pei)制的(de)(de)濃(nong)度(du)(du)為(wei)5mg/ml的(de)(de)mtt，37℃、5％co2繼(ji)續培(pei)(pei)養(yang)4h。離心后(hou)小心棄去上(shang)清液，并加入(ru)150μldmso，用微型振蕩器震蕩700r，10min。混(hun)勻后(hou)，在酶標儀上(shang)以檢(jian)測波長(chang)為(wei)490nm測定吸(xi)光度(du)(du)(od)值(zhi)，計算(suan)細(xi)胞(bao)存(cun)活率。細(xi)胞(bao)存(cun)活率(％)＝[(實驗(yan)組(zu)od值(zhi)-空(kong)白(bai)組(zu)od值(zhi))/(對(dui)照組(zu)od值(zhi)-空(kong)白(bai)組(zu)od值(zhi))]×100％。上(shang)述(shu)實驗(yan)重復(fu)三次。

實驗結果

從圖3中可以得出以下結論：

(1)空白組(zu)相比，stat3-sirna和100％irv/nc各濃度組(zu)均無統(tong)計(ji)學(xue)差(cha)異(yi)，stat3-sirna和nc-sirna的各濃度組(zu)之間也(ye)沒有統(tong)計(ji)學(xue)差(cha)異(yi)，說明nc-sirna沒有細胞毒(du)性(xing)，游離的stat3-sirna也(ye)不(bu)能進入細胞產生細胞毒(du)性(xing)。

(2)lipo2000/stat3-sirna與100％irv/nc組相比，40、60、80nm濃度組之(zhi)間p＜0.05，100、120nm濃度組之(zhi)間p＜0.01，均有(you)統計(ji)學(xue)差異，說明stat3-sirna被市售(shou)轉染試劑成功載入(ru)細胞(bao)而產生細胞(bao)毒性。

(3)100％irv/stat3-sirna與(yu)(yu)100％irv/nc組(zu)(zu)(zu)相(xiang)(xiang)比(bi)，各濃度組(zu)(zu)(zu)之(zhi)間(jian)(jian)p＜0.01，均(jun)有(you)(you)顯著性(xing)統(tong)計(ji)學差異(yi)，說(shuo)(shuo)明(ming)100％irv/stat3-sirna能有(you)(you)效(xiao)將sirna組(zu)(zu)(zu)攝(she)入細(xi)胞(bao)而(er)產(chan)(chan)生(sheng)細(xi)胞(bao)毒性(xing)。100％irv/stat3-sirna與(yu)(yu)lipo2000/stat3-sirna組(zu)(zu)(zu)相(xiang)(xiang)比(bi)，120nm組(zu)(zu)(zu)之(zhi)間(jian)(jian)p＞0.05，沒有(you)(you)統(tong)計(ji)學差異(yi)，說(shuo)(shuo)明(ming)此(ci)濃度與(yu)(yu)lipo2000組(zu)(zu)(zu)效(xiao)果相(xiang)(xiang)同(tong)。40、60、80nm組(zu)(zu)(zu)之(zhi)間(jian)(jian)p＜0.05，有(you)(you)統(tong)計(ji)學差異(yi)，說(shuo)(shuo)明(ming)這幾個濃度組(zu)(zu)(zu)產(chan)(chan)生(sheng)的細(xi)胞(bao)毒性(xing)優于(yu)(yu)lipo2000組(zu)(zu)(zu)。100nm組(zu)(zu)(zu)之(zhi)間(jian)(jian)相(xiang)(xiang)比(bi)，p＜0.01，有(you)(you)顯著性(xing)統(tong)計(ji)學差異(yi)，說(shuo)(shuo)明(ming)在此(ci)濃度下載(zai)(zai)體載(zai)(zai)入sirna而(er)產(chan)(chan)生(sheng)的細(xi)胞(bao)毒性(xing)最強，顯著優于(yu)(yu)lipo2000組(zu)(zu)(zu)。

(4)75％irv/stat3-sirna與(yu)100％irv/nc組(zu)(zu)相(xiang)比(bi)(bi)，40、60、80、100nm組(zu)(zu)之間(jian)p＜0.05，120nm組(zu)(zu)p＜0.01，有統(tong)計學差(cha)異(yi)，說明(ming)此組(zu)(zu)亦有細(xi)胞毒性。50％irv/stat3-sirna與(yu)nc/100％irv組(zu)(zu)相(xiang)比(bi)(bi)，60、80nm組(zu)(zu)之間(jian)p＜0.05，40、100、120nm組(zu)(zu)之間(jian)p＜0.01，有統(tong)計學差(cha)異(yi)。25％irv/stat3-sirna與(yu)nc/100％irv組(zu)(zu)相(xiang)比(bi)(bi)，40、60nm組(zu)(zu)之間(jian)p＞0.05，沒有統(tong)計學差(cha)異(yi)，80、100、120nm組(zu)(zu)之間(jian)p＜0.01有顯著性統(tong)計學差(cha)異(yi)。

根(gen)據圖(tu)1，圖(tu)2和圖(tu)3的結果，100％irv/stat3-sirna組的細胞毒性大(da)部分由基因沉(chen)默引起，轉(zhuan)染效率(lv)最好。75％irv/stat3-sirna組作用次之。50％irv/stat3-sirna組和25％irv/stat3-sirna組的細胞毒性大(da)部分是載體毒性造(zao)成的。

實(shi)施例3.100％irv/stat3-sirna作(zuo)用機(ji)制研(yan)究

annexinv-fitc/pi雙染法考察100％irv/stat3-sirna誘導肺癌細胞a549的凋亡率

細胞培養

取對數生長期的a549細胞，先用pbs洗三遍，加1ml胰酶，消化1min30s后，3000rpm離心3min。用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×10⁵個(ge)/ml，每(mei)孔加(jia)(jia)2ml于六孔板中(zhong)，設(she)三個(ge)復孔，培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)24h后，棄去培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基，分(fen)別(bie)加(jia)(jia)入2ml含(han)有100nm100％irv/stat3-sirna和stat3-sirna的不(bu)含(han)血清(qing)的1640培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基,空白組加(jia)(jia)入2ml的不(bu)含(han)血清(qing)的1640培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基，轉染4h，棄去培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基，每(mei)孔加(jia)(jia)2ml含(han)有10％fbs的新鮮培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基。繼續在37℃，5％co2條件下(xia)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)20h或(huo)44h。

染色

用不含edta的胰酶消化洗脫并與培養基上清的懸浮細胞合并，2000rpm離心3min,然后用預冷的pbs洗滌2次，將離心的細胞團塊完全懸浮在200μl的bindingbuffer(1×)中，然后稀釋至5×10⁵個(ge)/ml,至(zhi)少50μl，加入5μlannexinv-fitc和1μlpi，避光，室溫孵育(yu)15min。上機檢(jian)查。

實驗結果

如圖4所示,100％irv/stat3-sirna對a549細(xi)胞(bao)(bao)的凋亡(wang)率與空(kong)白組和stat3-sirna組相(xiang)比較，有明(ming)顯區別。在48h時100％irv/stat3-sirna組的細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)率可(ke)達到(dao)(dao)43.8％(早調：23.8％；晚調：20.0％)。我們可(ke)以(yi)得出(chu)結論：100％irv/stat3-sirna能(neng)夠成功將stat3-sirna遞送到(dao)(dao)a549細(xi)胞(bao)(bao)內，并且(qie)能(neng)誘導(dao)a549細(xi)胞(bao)(bao)的凋亡(wang)。

pi染色法考察(cha)100％irv/stat3-sirna對細胞周期的影響

細胞培養

取對數生長期的a549細胞，先用pbs洗三遍，加1ml胰酶，消化1min30s后，2000rpm離心3min。用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×10⁵個/ml，每(mei)孔(kong)(kong)加2ml于(yu)六(liu)孔(kong)(kong)板中(zhong)，設(she)三個復孔(kong)(kong)，培養(yang)(yang)24h，棄(qi)掉培養(yang)(yang)基，加入2ml含有(you)100nm100％irv/stat3-sirna和(he)stat3-sirna的不含血清的1640培養(yang)(yang)基,空白組加入2ml的不含血清的1640培養(yang)(yang)基，轉染4h，棄(qi)去培養(yang)(yang)基，每(mei)孔(kong)(kong)加2ml含有(you)10％fbs的新鮮(xian)培養(yang)(yang)基。繼續在(zai)37℃，5％co2條件下培養(yang)(yang)。

細胞的固定

分別于(yu)12h，24h，48h收集(ji)細(xi)胞。用不含(han)edta的(de)(de)(de)胰(yi)酶消化洗脫(tuo)并(bing)與培(pei)養基上清(qing)的(de)(de)(de)懸(xuan)浮細(xi)胞合并(bing)，2000rpm離心(xin)3min,然后用預(yu)冷的(de)(de)(de)pbs洗滌三次，將離心(xin)細(xi)胞團塊完全懸(xuan)浮在0.5mlpbs中，逐漸(jian)滴(di)入(ru)于(yu)已準備好的(de)(de)(de)9.5ml80％的(de)(de)(de)乙醇溶液中，4℃保存待用。

染色

將(jiang)上(shang)(shang)一步收集到的(de)各個時間段的(de)細胞離心(8000rpm)，棄(qi)去(qu)上(shang)(shang)清液(ye)，并且用(yong)冷的(de)pbs洗三遍,將(jiang)細胞分散在500μlpbs里(含5μlrnase原液(ye)和濃度為1mg/ml的(de)pi染液(ye))，37℃避(bi)光染色30min,上(shang)(shang)機檢測。

實驗結果

從圖5中我們可以看出(chu)，與空白組和裸stat3-sirna組相比較，100％irv/stat3-sirna組隨時間增(zeng)(zeng)加，g2/m期的(de)細(xi)胞(bao)數目增(zeng)(zeng)多(duo),而(er)g1期的(de)細(xi)胞(bao)數目減少，表現(xian)出(chu)g2/m期阻滯現(xian)象。可以看出(chu)stat3-sirna被(bei)irv成功遞送進入細(xi)胞(bao)，將細(xi)胞(bao)阻滯在g2/m期，抑制細(xi)胞(bao)增(zeng)(zeng)殖，進而(er)誘(you)導(dao)細(xi)胞(bao)凋亡。

實(shi)施例4100％irv/stat3-sirna的蛋白(bai)水平沉默效率評(ping)價

細胞培養

取對數生長a549細胞，胰酶消化后,用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×10⁵個(ge)/ml，每孔(kong)加(jia)2ml于(yu)24孔(kong)板(ban)中(zhong)，設三個(ge)復孔(kong)，培養(yang)(yang)(yang)24h，當細胞密度長至(zhi)80％左(zuo)右時，棄去上清液，加(jia)入2ml含(han)有100nmstat3-sirna,100％irv/nc,100％irv/stat3-sirna,lipo2000/stat3-sirna和lipo2000/nc的(de)無血清1640培養(yang)(yang)(yang)基，空(kong)白組加(jia)入2ml無血清1640培養(yang)(yang)(yang)基，轉染4h后換成新鮮的(de)含(han)10％fbs的(de)1640培養(yang)(yang)(yang)基，繼續(xu)培養(yang)(yang)(yang)44h。

提取蛋白

冰(bing)上操作：棄(qi)掉上清液，然后每(mei)孔用(yong)pbs洗3次，棄(qi)去上清液，加入500μl蛋白裂解液，冰(bing)浴中裂解30min，提取到離心管中，離心(10000rpm，10min)取上清即(ji)可。

bcaproteinassaykit定量裂解液(ye)中蛋(dan)白濃度

將上(shang)一步提取的蛋(dan)白裂解液(ye)稀釋十倍，每(mei)組(zu)設置三個復孔,根(gen)據bca工作液(ye)試劑盒操作步驟(zou),測定每(mei)組(zu)蛋(dan)白濃(nong)(nong)度，做下記錄,求每(mei)組(zu)樣(yang)品總(zong)蛋(dan)白濃(nong)(nong)度平均值。

humanstat3elisa試劑(ji)盒測定樣品蛋(dan)白(bai)中stat3的含(han)量

蛋白上(shang)樣(yang)量為(wei)20μg，根(gen)據蛋白濃(nong)度，加入相(xiang)應體積的蛋白提取(qu)液(ye)并用depc水定(ding)容到50μl,根(gen)據試劑盒步驟操作(zuo)最后在450nm下測定(ding)od值。上(shang)述實驗重復三次。

實驗結果

蛋白定量結果

繪制標準曲線

不(bu)同濃度的(de)標準(zhun)蛋白的(de)od值

標準方程為y＝0.01x+0.215。r²＝0.992

各組(zu)蛋(dan)白(bai)(bai)樣(yang)品中(zhong)總蛋(dan)白(bai)(bai)量

elisa

各組(zu)蛋白樣(yang)品中stat蛋白的相對含(han)量

從圖6中我們可以看出，裸stat3-sirna組(zu)與空白(bai)(bai)(bai)組(zu)相(xiang)比，沒(mei)有(you)明顯性(xing)差異(yi)(p>0.05)，即裸stat3-sirna不能影(ying)響a549細(xi)(xi)胞(bao)stat蛋白(bai)(bai)(bai)的表(biao)(biao)達(da)(da)；100％irv/nc和(he)lipo2000/nc與空白(bai)(bai)(bai)組(zu)相(xiang)比較(jiao)，沒(mei)有(you)明顯性(xing)差異(yi)(p>0.05)，表(biao)(biao)明載體材料對stat蛋白(bai)(bai)(bai)的表(biao)(biao)達(da)(da)沒(mei)有(you)影(ying)響；而(er)100％irv/stat3-sirna與空白(bai)(bai)(bai)組(zu)相(xiang)比有(you)明顯性(xing)差異(yi)(p<0.01)，與lipo2000/stat3-sirna陽性(xing)對照組(zu)相(xiang)比，沒(mei)有(you)明顯性(xing)差異(yi)(p>0.05)，說明100％irv將stat3-sirna遞送進入細(xi)(xi)胞(bao)并成功下調stat蛋白(bai)(bai)(bai)的表(biao)(biao)達(da)(da)。

實施(shi)例5.100％irv/stat3-sirna的(de)mrna水平沉默效率評價

細胞培養

取對數生長期a549細胞，細胞密度達到80％左右時，用pbs洗滌三遍，加入1ml胰酶消化1min30s,離心(2000rpm，3min)，用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×10⁵個/ml，每孔(kong)(kong)加2ml于六孔(kong)(kong)板中，培養24h，設三個復孔(kong)(kong)，棄(qi)去上清(qing)(qing)，加入2ml含(han)有100nmstat3-sirna,100％irv/nc,100％irv/stat3-sirna和lipo2000/stat3-sirna的(de)無(wu)血(xue)清(qing)(qing)1640培養基(ji)，轉染4h，換成新(xin)鮮含(han)血(xue)清(qing)(qing)的(de)1640培養基(ji)，繼續培養44h。

rna的提取

(1)首先棄掉六孔板的上清液，然后用1mlpbs洗滌三次，每孔加入1mltrizol裂解液(每10cm²加(jia)入1mltrizol)。吹打均勻并室溫裂解10min，將(jiang)裂解液(ye)轉移至無(wu)rnaseep管，靜置(zhi)5min。

(2)相(xiang)分離(li)。在每1mltrizol加入0.2ml氯仿，然后劇烈振(zhen)蕩，室溫放置(zhi)3分鐘，離(li)心(4℃，12000rpm，15minutes)。液體(ti)分成三(san)層，下(xia)層的(de)紅(hong)色(se)為苯酚-氯仿相(xiang)，上層是無色(se)的(de)水(shui)相(xiang)。rna存在于水(shui)相(xiang)中(zhong)，水(shui)相(xiang)約占總體(ti)積的(de)50％。

(3)沉淀rna。小心地將上層水相液體(ti)轉移(yi)到(dao)另(ling)一干(gan)凈的無(wu)rnaseep管中(zhong)，然(ran)后每管加入0.5ml異(yi)丙醇(chun)，混(hun)勻,室溫靜置10min，然(ran)后離心(4℃，12000rpm，10min)。離心后在(zai)管的底(di)部可看到(dao)絮(xu)狀半透明膠樣(yang)的rna沉淀。

(4)洗滌rna。小心棄去上清，加入1ml配(pei)制(zhi)好的75％乙醇(depc水(shui)配(pei)制(zhi))，洗滌rna沉(chen)淀，振蕩(dang)器混勻，離心(4℃，12000rpm，10min)，小心棄去上清。

(5)rna的(de)復(fu)溶。將rna沉淀放置(zhi)10min，待rna沉淀干燥。但是注(zhu)意不能將rna沉淀完全(quan)干燥，因(yin)為這會極大地降(jiang)低它的(de)溶解度。用depc水重懸rna沉淀，并且用槍(qiang)頭(tou)反復(fu)吹打幾次，靜置(zhi)10分鐘，55℃水浴10-15min。立即測定。

(6)測(ce)rna濃度：用(yong)depc水校正nanodrop-1000后，取2μl混勻后的rna溶液樣(yang)品(pin)，滴加到測(ce)量臂上(shang)，選擇rna，點擊measure測(ce)量。同法依次(ci)測(ce)量所有(you)rna溶液樣(yang)品(pin)。

逆轉錄

(1)樣(yang)(yang)品準備：逆(ni)轉(zhuan)錄rna上(shang)樣(yang)(yang)量(liang)為(wei)2μg,根據上(shang)一步測得的rna濃度，計(ji)算出我們所需(xu)rna體積。

(2)取microamp^tmoptical96-wellreactionplate，每個反應(ying)孔(kong)加10μl2×rtbuffer,1μl20×rtenzymemix，加入相應(ying)體積的(de)rna溶液，用(yong)depc水補足20μl。用(yong)opticaladhesivefilm將板(ban)子封口(kou)。離(li)心(xin)(4℃，1000rpm，1min)，排出(chu)聚集在反應(ying)孔(kong)底部(bu)的(de)氣泡(pao)。

(3)放入(ru)pcrsystem9700中,設置(zhi)反應條件：94℃-5min,94℃-30s,55℃-30s,72℃-25s,72℃-7min,4℃∞，共30個循環。

(4)測濃度(du)：反應結(jie)束后，首先(xian)用(yong)depc水(shui)校(xiao)正nanodrop-1000，取2μl混(hun)勻后的cdna溶液樣(yang)(yang)品，滴加到測量(liang)(liang)(liang)臂上(shang)(shang)，蓋上(shang)(shang)測量(liang)(liang)(liang)臂，選擇dna-50，點擊measure測量(liang)(liang)(liang)。同法依次測量(liang)(liang)(liang)所有cdna溶液樣(yang)(yang)品，并(bing)記錄下(xia)測量(liang)(liang)(liang)的結(jie)果。按(an)照上(shang)(shang)樣(yang)(yang)量(liang)(liang)(liang)進(jin)行稀釋(shi)(shi)，稀釋(shi)(shi)后用(yong)同樣(yang)(yang)的方法進(jin)行測定(ding)。-20℃下(xia)保存(cun)。

rt-pcr

cdna的上樣量為50ng，據此計算所需加入的各cdna樣品的體積。每個反應孔加入25μlgeneexpressionmastermix、2.5μl探針標記的(de)引(yin)物(wu)(stat3或(huo)gapdh或(huo)vegf或(huo)survivin)、相應體積的(de)cdna樣(yang)品，以depc水補(bu)齊50μl，搖勻。離心(4℃，1000rmp，1min)，使液(ye)體聚集于底部并排出氣泡；放入appliedbiosystems7500real-timepcrsystem中(zhong),設置條件。hold:50℃2min,95℃10min，cycle(40cycles)，95℃15s,60℃1min。數據處理中(zhong)，根據ct值(zhi)以gapdh為(wei)內參，運用2^-△△ct法(fa)相對(dui)定量(liang)各實(shi)驗組mrna的(de)量(liang)。上述實(shi)驗重復三次。

實驗結果

提取(qu)的各組rna濃度

提取的各組rna濃度

逆轉錄(lu)后各(ge)組的(de)(de)cdna的(de)(de)濃度

逆轉錄后各組的cdna的濃度

rt-pcr

rt-pcr后各組2^-△△ct值如下表所示：

genesilencingefficiencyonstat3mrnalevel

從圖7可以看出：

(1)裸的stat3-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的stat3組對stat3-mrna的轉錄沒有影響；

(2)100％irv/nc組組與空白組相(xiang)比，沒(mei)(mei)有顯(xian)著性差異(p>0.05)，說(shuo)明載體(ti)材料對stat3-mrna的轉錄(lu)沒(mei)(mei)有影響；

(3)100％irv/stat3-sirna組分別與空白(bai)組和(he)100％irv/nc相(xiang)比(bi)較，均有(you)明顯性差(cha)異(p<0.01)，而與lipo2000/stat3-sirna組相(xiang)比(bi)，沒(mei)有(you)x統計學差(cha)異(p>0.05)，可以(yi)得出(chu)100％irv/stat3-sirna能(neng)夠下調stat3-mrna的轉錄(lu)水平，并(bing)且效率和(he)陽(yang)性對(dui)照組相(xiang)當。

從圖8中(zhong)可以看(kan)出，100％irv/stat3-sirna能(neng)夠下(xia)調stat3-mrna的(de)轉錄(lu)水平的(de)同時，對下(xia)游基(ji)(ji)因造成(cheng)影響，vegf和(he)survivin基(ji)(ji)因的(de)表(biao)達也(ye)下(xia)調。

實施例6.100％irv/stat3-sirna的體內抗腫瘤(liu)活性研究

實驗分組

實驗共分為5組(zu)(zu)，分別(bie)是生理鹽水組(zu)(zu)(ns)，100％irv/stat3-sirna組(zu)(zu)，裸stat3-sirna組(zu)(zu)，100％irv組(zu)(zu)和鹽酸阿霉素組(zu)(zu)(dox)。每組(zu)(zu)10只小鼠，六組(zu)(zu)共60只。

給藥劑量

(1)100％irv/stat3-sirna組：stat3-sirna劑(ji)量為0.3mg/kg，按照比例(li)配置100％irv/stat3-sirna復合(he)物。

(2)stat3-sirna組(zu)：劑(ji)量為(wei)0.3mg/kg

(3)100％irv組(zu)：劑(ji)量(liang)和100％irv/stat3-sirna組(zu)中使用劑(ji)量(liang)相當

(4)dox組：劑量為2μmol/kg

(5)ns組：等(deng)體積的生理(li)鹽水，即每只0.2ml

給藥(yao)方式(shi)：尾靜脈注(zhu)射

實(shi)驗動物：icr小鼠，雄(xiong)性，體重20±2g(x±sd)，由北京維通利華動物實(shi)驗技術(shu)有限公司提供。

實驗方案

建立荷s180腹水瘤小鼠模型：取1×10⁷個/ml的s180細胞懸液于健康小鼠腋皮下接種，0.2ml/只，小鼠接種瘤液后養7天至瘤體積(長×寬²/2)為150mm³左右，將(jiang)全部小鼠隨(sui)機分組(zu)，分為5組(zu)，并編(bian)號。測量(liang)(liang)體(ti)重，然后開(kai)始給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)，100％irv/stat3-sirna，stat3-sirna組(zu)和100％irv組(zu)按給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)劑量(liang)(liang)每(mei)(mei)天(tian)(tian)尾(wei)(wei)靜脈(mo)(mo)注(zhu)(zhu)射(she)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)一(yi)次(ci)，每(mei)(mei)次(ci)0.2ml/只，連續(xu)(xu)(xu)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)5天(tian)(tian)；陰性對照以等體(ti)積(ji)的生理鹽水(shui)尾(wei)(wei)靜脈(mo)(mo)注(zhu)(zhu)射(she)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)，每(mei)(mei)天(tian)(tian)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)一(yi)次(ci)，0.2ml/只，連續(xu)(xu)(xu)給(gei)(gei)(gei)5天(tian)(tian)；陽(yang)性對照dox組(zu)以尾(wei)(wei)靜脈(mo)(mo)注(zhu)(zhu)射(she)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)，按給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)劑量(liang)(liang)每(mei)(mei)天(tian)(tian)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)一(yi)次(ci)，0.2ml/只，連續(xu)(xu)(xu)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)5天(tian)(tian)，每(mei)(mei)天(tian)(tian)按編(bian)號測量(liang)(liang)小鼠體(ti)重。

實體瘤(liu)抑瘤(liu)率及臟器指數的測定

每組(zu)連續給藥(yao)5天后，于第6天脫(tuo)頸椎處(chu)死小鼠，處(chu)死前(qian)稱取(qu)體重(zhong)，然后將小鼠解剖，取(qu)出(chu)瘤、腦、心、肝、脾、腎，并稱重(zhong)，按如下公式計算抑瘤率(lv)及臟器指數。

抑瘤率％＝[(生理鹽水組(zu)平均(jun)(jun)瘤重(zhong)－給藥(yao)組(zu)平均(jun)(jun)瘤重(zhong))/生理鹽水組(zu)平均(jun)(jun)瘤重(zhong)]×100％，臟(zang)(zang)器指數(％)＝臟(zang)(zang)器重(zhong)/處死前體重(zhong)。數據(ju)統計均(jun)(jun)采(cai)用t檢驗和方差(cha)分(fen)析(xi)，以(mean±sdg)表示。

從圖9中我們可(ke)以看(kan)出，100％irv/stat3-sirna組(zu)(zu)等各組(zu)(zu)對(dui)動物的心、肝、脾、肺、腎、腦(nao)都(dou)沒有(you)(you)毒(du)性。從圖10中可(ke)以看(kan)出，裸stat3-sirna組(zu)(zu)與空(kong)白(bai)(bai)組(zu)(zu)相(xiang)(xiang)比，沒有(you)(you)顯(xian)著(zhu)(zhu)性差異(yi)(yi)(p>0.05)，說明裸的stat3-sirna對(dui)腫瘤的生長(chang)無抑制(zhi)(zhi)作用；100％irv/stat3-sirna與空(kong)白(bai)(bai)組(zu)(zu)相(xiang)(xiang)比較(jiao)，有(you)(you)顯(xian)著(zhu)(zhu)性差異(yi)(yi)(p<0.01)，與dox組(zu)(zu)相(xiang)(xiang)比,沒有(you)(you)顯(xian)著(zhu)(zhu)性差異(yi)(yi)(p>0.05)，說明100％irv/stat3-sirna明顯(xian)抑制(zhi)(zhi)腫瘤的生長(chang)，抑瘤率接近于陽性藥(yao)dox。100％irv組(zu)(zu)與空(kong)白(bai)(bai)組(zu)(zu)有(you)(you)統計學差異(yi)(yi)(p<0.05)，但與100％irv/stat3-sirna組(zu)(zu)相(xiang)(xiang)比，有(you)(you)統計學差異(yi)(yi)(p<0.05),說明載體材料(liao)有(you)(you)較(jiao)弱的抗腫瘤作用。

100％irv/stat3-sirna的靶向性研究

將上(shang)一步取(qu)出的(de)瘤、腦、心(xin)、肝、脾、腎(shen)各組織(zhi)，精密稱重(zhong)，先用pbs洗一遍，洗至無血水(shui)。然后(hou)加入(ru)一定體積(ji)(m：v＝1:3)的(de)pbs(ph7.4)，勻漿，離心(xin)(6000rpm,10min)，取(qu)上(shang)層(ceng)離心(xin)液200μl，加入(ru)400μl甲(jia)醇(chun)，渦(wo)旋(xuan)混(hun)勻，離心(xin)(10000rpm，10min)，取(qu)上(shang)清600μl，濃(nong)縮干燥，加入(ru)200μl色譜(pu)甲(jia)醇(chun)復溶，測(ce)定ft-ms。

[m+1]⁺rgdv的理論值為446.23632，由圖11我們可以看出在空白組的組織提取液中沒有發現rgdv,而在100％irv/stat3-sirna組的腫瘤組織提取液中發現rgdv的[m+1]⁺峰(446.23250)。由此我們得出(chu)100％irv/stat3-sirna具有靶向(xiang)性，能夠靶向(xiang)到腫(zhong)瘤部位發揮抗腫(zhong)瘤作用。