專利名稱：癌癥治療和診斷的靶基因ercc6l的制作方法
技術領域：
優先權本申請要求2009年8月25日提交的美國臨時申請No. 61/275，198的權益，通過述及將其完整內容收入本文。摶術領域本發明涉及檢測和診斷癌癥的方法以及治療和預防癌癥，特別是與ERCC6L過表達有關的癌癥諸如肺癌的方法。本發明還涉及篩選用于治療和預防ERCC6L相關癌癥的候選物質的方法。此外，本發明涉及降低ERCC6L基因表達的雙鏈分子及其用途。
背景技術：
肺癌是癌癥的最常見形式，占每年1090萬新癌癥病例中的135萬。它還是癌癥相關疾病所致死亡的首要原因，占全世界670萬癌癥相關死亡中的118萬(NPL I)。在最近十年里，新開發的細胞毒劑包括帕利他賽、多西他賽、吉西他濱、和長春瑞濱已開始為具有晚期NSCLC (非小細胞肺癌)的患者提供多種治療選項；然而，每種新方案僅能提供與基于順鉬的療法相比適度的存活好處(NPL 2)。最近,分子祀向劑,包括抗EGFR或抗VEGF單克隆抗體,西妥昔單抗(Erbitux)或貝伐單抗(Avastin),和EGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑,諸如吉非替尼(Iressa)和埃羅替尼(Tarceva)，已經進行了臨床應用考察和/或被批準應用于臨床(NPL 3,4) 0這些作用劑對復發性NSCLC表現出一定程度的活性，但是能收到存活效益的患者的數目仍然有限。 同時，SCLC(小細胞肺癌)患者對一線多藥化療相應良好，盡管他們常常在短時間里復發。 只有20%具有局限階段疾病(LD)的患者能用聯合用藥療法治愈，而具有廣泛疾病(ED)的患者能在初始診斷之后實現5年存活的不到5% (NPL 5)。因此，迫切需要新的治療策略， 諸如開發更加選擇性的且有效的針對肺癌的分子靶向劑。在篩選用于診斷、治療和預防人癌癥的新穎分子靶的過程中，本發明人使用含有 27，648種基因或表達序列標簽(EST)的cDNA微陣列，偶聯激光顯微解剖，實施了 101例肺癌的基因組范圍表達譜分析，發現了用于肺癌治療的數種候選分子靶和生物標志物(PTL 1-2，NPL 6-9)。在這些中，ERCC6L (切除修復交叉互補嚙齒動物修復缺陷，互補組6樣；也稱作"PICH")特別值得注意。ERCC6L已鑒定為SNF2ATP酶家族的一個成員，它是Plkl的相互作用配偶和底物 (NPLlO)。一項最近的報告證明ERCC6L是檢查點信號傳導的一個至關重要的成分，而且結合鏈接著絲粒相關DNA以監測姐妹動粒之間發生的張力(NPLlO)。然而，至今，尚未建立 ERCC6L和癌發生之間的關系。引用表專利文獻[PTL 1]W02004/031413[PTL 2]W02007/013665
非專利文獻[NPL I] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. CA Cancer J Clin. 2008 ；58 :71-96.[NPL 2]Schiller JH, Harrington D, Belani CP, et al. Eastern Cooperative Oncology Group. N Engl J Med 2002 ；346 :92-8.[NPL 3]DowelI J,Minna JD,Kirkpatrick P. Nat Rev Drug Discov2005 ;4 :13-4.[NPL 4] Pal SK, Pegram M. Anti cancer Drugs 2005 ；16 :483-94.[NPL 5]Chute JP, Chen T, Feigal E, Simon R, Johnson BE J Clin Oncol1999 ； 17 :1794-801.[NPL 6]Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53.[NPL 7]Kikuchi T，Daigo Y, Katagiri T，et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205.[NPL 8]Kakiuchi S,Daigo Y,Tsunoda T,Yano S,Sone S,Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003 ；1 :485-99.[NPL 9]Taniwaki M，Daigo Y,Ishikawa N，et al. Int J 0ncol2006 ;29 :567-75.[NPL 10]Baumann C，et al. Cell 2007 ；128 :101-114.發明概述本發明涉及經由微陣列分析和RT-PCR的下述發現，即ERCC6L在臨床肺癌組織中過表達。如本文中證明的，通過siRNA對癌細胞系中內源ERCC6L的功能性敲低導致癌細胞生長的顯著阻抑，提示ERCC6L在維持癌細胞的存活力中至關重要的作用。由于ERCC6L在成體正常器官中僅極少表達，因此ERCC6L似乎是用于不良效應最小的新治療途徑的一種適宜且有前景的分子靶。因而，本發明的一個目的是提供一種通過測定源自受試者的生物樣品中ERCC6L 的表達水平來在受試者中診斷或確定癌癥、特別是肺癌傾向性的方法。ERCC6L的表達水平與正常對照水平相比的升高指示該受試者罹患或有風險發生癌癥，特別是肺癌。在本發明的方法中，可通過適宜的探針或引物集來檢測ERCC6L基因，或者，可通過抗ERCC6L抗體來檢測ERCC6L蛋白。本發明的又一個目的是提供一種試劑盒，其包括用于檢測ERCC6L基因的轉錄或翻譯產物的試劑。本發明的又一個目的是提供用于診斷或檢測癌癥的試劑，其包含結合ERCC6L基因的轉錄產物的核酸或結合ERCC6L基因的翻譯產物的抗體。本發明的又一個目的是提供結合ERCC6L基因的轉錄產物的核酸或結合ERCC6L基因的翻譯產物的抗體制造用于診斷或檢測癌癥的試劑的用途。本發明的又一個目的是提供鑒定用于抑制過表達ERCC6L基因的細胞生長的候選物質的方法，此類物質可用于治療和/或預防ERCC6L相關疾病，諸如癌癥。本發明的方法可在體外或在體內進行，而且使用對ERCC6L多肽的結合活性、ERCC6L基因的表達水平、 ERCC6L多肽的生物學活性、或在該基因產物的轉錄調節區控制下的報告基因的表達水平或報告基因的活性作為指標。結合ERCC6L多肽或阻抑ERCC6L表達或活性或報告基因表達或活性的物質可鑒定為用于治療和/或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選物質。要檢測的 ERCC6L多肽的生物學活性優選為細胞增殖活性(細胞增殖增強活性)。ERCC6L多肽的生物學活性與在測試物質不存在時的對照水平相比的降低指示該測試物質可用于減輕/減少肺癌的癥狀，或治療和/或預防肺癌癌癥。本發明的又一個目的是提供一種通過施用抑制ERCC6L基因的表達和/或ERCC6L 蛋白的功能的作用劑來治療和/或預防癌癥或抑制過表達ERCC6L的癌性細胞生長的方法。 優選地，該作用劑為抑制性核酸(例如反義、核酶、雙鏈分子、適體)。該作用劑可以為用于提供雙鏈分子的核酸分子或載體。可通過以足以抑制ERCC6L基因表達的量將雙鏈分子導入靶細胞中來抑制該基因的表達。因此，在本發明的一個特別優選實施方案中，該方法包括對受試者施用藥學有效量的針對ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼此類分子的載體的步驟， 其中該雙鏈分子在導入表達ERCC6L基因的細胞中時抑制ERCC6L基因的表達以及細胞增殖。本發明的又一個目的是提供一種藥物組合物，其適合于治療和/或預防ERCC6L相關癌癥，其包括可藥用的擔載體和活性劑，包括一種或多種針對ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼此類分子的載體。在本發明的背景中，針對ERCC6L的雙鏈分子能夠在導入表達ERCC6L 基因的細胞中時抑制ERCC6L基因的表達以及抑制由此誘導的細胞增殖。在優選實施方案中，所治療和/或預防的癌癥為肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC的例子包括肺腺癌(ADC) 和肺的鱗狀細胞癌(SCC)。本發明的雙鏈分子優選包含有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包括與選自SEQ ID NO 7和8的靶序列對應的核苷酸序列，且該反義鏈包括與該有義鏈互補的序列。該分子的有義和反義鏈彼此雜交以形成雙鏈分子。在導入表達ERCC6L基因的細胞中時，本發明的雙鏈分子抑制ERCC6L基因的表達以及細胞增殖。本發明的方法和材料能夠在檢測到癌癥的明顯臨床癥狀之前就鑒定出癌癥，而且可在癌癥治療的背景下使用而沒有不良效應。本領域技術人員會理解，本發明的一個或多個方面能符合某些目的，而一個或多個其它方面能符合某些其它目的。每個目的可以不是在它的所有方面同等適用于本發明的每一個方面。因此，前述目的可視為關于本發明的任何一個的備選。本發明的這些和其它目的和特征在閱讀下面的詳細描述連同附圖和實施例之后會變得更加清楚明白。然而，要理解，上面的發明概述和下面的詳細描述都是優選實施方案，而非對本發明或本發明其它備選實施方案的限制。附圖簡述在考慮下面的附圖簡要描述和發明詳細描述及其優選實施方案之后，本發明的各個方面和應用對熟練技術人員會變得明顯[圖I]圖I展現肺癌和正常組織中的ERCC6L表達。部分A描繪半定量RT-PCR 的結果，證實了 NSCLC(ADC和SCC)和SCLC的臨床樣品中與正常肺組織相比的ERCC6L的過表達。制備每種自肺癌樣品的mRNA制備的單鏈cDNA的適宜稀釋液，使用β -肌動蛋白 (ACTB)表達的水平作為數量對照。部分B描繪半定量RT-PCR的結果，證實了肺癌細胞系中 ERCC6L的表達。部分C描繪ERCC6L的Northern印跡分析的結果，證明數種肺癌細胞系強表達ERCC6 :而大多數正常人組織不然。部分D描繪通過抗myc檢測的C0S-7細胞中外源 ERCC6L蛋白的亞細胞定位。細胞用DAPI共染色。[圖2]圖2證明針對ERCC6L的siRNA對過表達ERCC6L的肺癌細胞的生長的影響。部分A描繪半定量RT-PCR分析的結果，確認SBC-5細胞中響應si_ERCC6L (si_#A或 si-#B)但不響應對照siRNA (LUC或EGFP)而發生ERCC6L表達的敲低效應。部分B描繪用特異性siRNA或對照質粒轉染的SBC-5細胞的集落形成測定的結果。部分C描繪SBC-5細胞響應于si-ERCC6L(si-#A或si_#B)、si-LUC、或si-EGFP的MTT測定的結果。所有測定在一式三份的孔中實施三次。[圖3]圖3證明ERCC6L導入C0S-7細胞對細胞生長的增強。部分A描繪Western 印跡分析的結果，確認C0S-7細胞中ERCC6L的瞬時表達。部分B描繪C0S-7細胞中ERCC6L 的瞬時表達中的生長促進效應。測定在一式三份的孔中實施三次。發明詳述雖然任何與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于實施或測試本發明的實施方案，但是現在描述優選的方法、裝置、和材料。然而，在描述本發明的材料和方法之前，要理解，本發明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案、 等，因為這些可依照常規實驗和優化而變化。還要理解，該描述中使用的術語只是出于描述特定樣式或實施方案的目的，而非意圖限制本發明的范圍，本發明的范圍只會由所附權利要求來限制。通過述及明確地將此說明書中提到的每一篇出版物、專利或專利申請的公開內容完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發明沒有資格憑借發明在先而早于此類公開。如果有沖突，當以本說明書，包括定義為準。另外，該等材料、方法、和實施例只是例示性的，而非意圖限制。定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非
另有明確說明。在本文中與物質(例如多肽、抗體、多核苷酸、等)聯用時，術語“分離的”和 “純化的”表示該物質基本上不含至少一種也可包括于天然來源中的物質。如此，分離的或純化的抗體指基本上不含細胞材料諸如碳水化合物、脂質、或其它來自該蛋白質(抗體)所由來的細胞或組織源的污染性蛋白質的抗體，或當化學合成時基本上不含化學前體或其它化學品的抗體。術語“基本上不含細胞材料”包括其中多肽與用于分離或重組生產它的細胞的細胞成分分開的多肽制備物。如此，基本上不含細胞材料的多肽包括具有少于約30 %、 20%、10%、或5% (按干重計)的異源蛋白質(在本文中也稱作“污染性蛋白質”)的多肽制備物。當多肽重組產生時，其還優選基本上不含培養基，包括具有少于約20%、10%、或 5%的蛋白質制備物體積的培養基的多肽制備物。當多肽通過化學合成產生時，其優選基本上不含化學前體或其它化學品，包括具有少于約30%、20%、10%、5% (按干重計)的蛋白質制備物體積的與該蛋白質合成有關的化學前體或其它化學品的多肽制備物。可例如通過在蛋白質制備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍染色等等之后單一條帶的出現來顯示特定蛋白質制備物含有分離的或純化的多肽。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體是分離的或純化的。“分離的”或“純化的”核酸分子，諸如cDNA分子，當通過重組技術產生時可基本上不含其它細胞材料或培養基，或當化學合成時可基本上不含化學前體或其它化學品。術語“多肽”、“肽”、和“蛋白質”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該等術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經過修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細胞中在翻譯后經過修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎化學結構(α碳與氫、 羧基、氨基、和R基團結合)但具有經過修飾的R基團或經過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結構但發揮與一般氨基酸相似的功能的化學化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號來指稱。除非另有明確陳述，術語“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子” 可交換使用，并且與氨基酸類似，以普遍接受的單字母代碼來表示。類似于氨基酸，它們涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核酸、或核酸分子可包含 DNA、RNA或其組合。除非另有定義，術語“癌癥”指過表達ERCC6L基因的癌癥。過表達ERCC6L的癌癥的例子包括但不限于肺癌，包括SCLC和NSCLC。NSCLC包括但不限于腺癌(ADC)和鱗狀細胞癌(SCC)。如本文中使用的，術語“雙鏈分子”指抑制靶基因表達的核酸分子，包括例如短干擾RNA (siRNA ；例如雙鏈核糖核苷酸(dsRNA)或小發夾RNA (shRNA))和短干擾DNA/ RNA(siD/R-NA ;例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發夾嵌合物 (shD/R-NA))。在本文中，“雙鏈分子”也稱作“雙鏈核酸”、“雙鏈核酸分子”、“雙鏈多核苷酸” 和“雙鏈多核苷酸分子”。ERCC6L 基因或 ERCC6L 蛋白本發明部分基于下述發現，編碼ERCC6L的基因在癌癥中與非癌性組織相比過表達。ERCC6L多核苷酸的核苷酸序列和ERCC6L多肽的氨基酸序列是本領域技術人員知道的，而且得自例如web網站諸如GenBank 上的基因數據庫。ERCC6L多核苷酸的一個例不性核苷酸序列顯不于SEQ ID NO :9，而ERCC6L多肽的一個例不性氨基酸序列顯不于SEQ ID NO =IO0也可例如經GenBank登錄號BC11486或ΝΜ_017669獲得序列數據。技術人員會認識到，ERCC6L序列不必限于這些序列，而且變體(例如功能性等同物和等位變體)也可用于本發明，如下所述。依照本發明的一個方面，認為功能性等同物也是“ERCC6L多肽”。在本文中，蛋白 (例如ERCC6L多肽)的“功能性等同物”為具有與該蛋白等同的生物學活性的多肽。也就是，任何保留ERCC6L蛋白的生物學能力的多肽可用作本發明中的此類功能性等同物。此類功能性等同物包括那些對ERCC6L蛋白的天然存在氨基酸序列替代、刪除、添加、或插入一個或多個氨基酸的。或者，多肽可包含與相應蛋白的序列具有至少約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優選至少約90%至95%同一性，常常為約96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在其它實施方案中，多肽可以由在嚴格條件下與ERCC6L基因的天然存在核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。本發明的多肽可在氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的有無、或形式方面有變化，取決于用于產生它的細胞或宿主，或使用的純化方法。無論如何，只要它具有與本發明的人 ERCC6L蛋白的功能等同的功能，它就在本發明的范圍內。短語“嚴格(雜交)條件”指下述條件，在該條件下，核酸分子會與其靶序列雜交， 通常在核酸復雜混合物中，但沒有與其它序列的可檢測的雜交。嚴格條件取決于序列，而且在不同情況中會有所變化。較長的序列在較高的溫度特異性雜交。對于核酸雜交詳盡指導可見于 Ti jssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地,嚴格條件選擇為在限定的離子強度和pH,比特定序列的熱熔點(Tm)低約5-10°C。Tm是如下的溫度(在限定的離子強度、pH、和核酸濃度下)，其中50%的與靶互補的探針在平衡時與靶序列雜交(因為靶序列過量存在，所以在 Tm，在平衡時50%的探針被占據)。嚴格條件也可以通過添加去穩定劑(諸如甲酰胺)來實現。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優選背景雜交的10倍。例示性的嚴格雜交條件包括如下50%甲酰胺、5x SSC、和1% SDS，在42°C溫育，或5x SSCU% SDS、在 65°C溫育，用 0. 2x SSC 和 0. 1% SDS 在 50°C清洗。在本發明的背景中，用于分離編碼與人ERCC6L蛋白在功能上等同的多肽的 DNA的雜交條件可由本領域技術人員常規選擇。例如，可如下進行雜交在68攝氏度用 “Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)進行30分鐘或更長的預雜交,添加經過標記的探針，并在68攝氏度溫育I小時或更長。下面的清洗步驟可在例如低嚴格度條件中進行。一種例示性的低嚴格度條件可包括42°C、2x SSC、0. 1% SDS，優選50°C、2x SSC.0. 1% SDS。常常優選使用高嚴格條件。一種例示性的高嚴格條件可包括在室溫在2x SSC.0. 1% SDS中清洗3次各20分鐘，然后在Ix SSC、0. 1% SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘， 并在Ix SSC、0. I % SDS中在50攝氏度清洗2次各20分鐘。然而，數種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴格度，而且本領域技術人員可選擇合適的因素以達到所需的嚴格度。一般而言，蛋白中一個、兩個或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白的功能。事實上，已知突變的或經過修飾的蛋白(即包含通過替代、刪除、插入和/或添加而修飾一個、兩個或更多個氨基酸殘基的氨基酸序列的肽)保留原始的生物學活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6 (1984) ；ZoIIer and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982))。因而，本領域技術人員會認識到，對氨基酸序列進行個別添加、刪除、插入、或替代，這改變單個氨基酸或少數氨基酸，或者被認為是“保守修飾”的那些修飾——其中蛋白的改變產生具有相似功能的蛋白，這些都是本發明的背景中可接受的。因此，在一個實施方案中，本發明的肽可具有在ERCC6L序列中添加、插入、刪除、和/或替代一個、兩個或甚至更多個氨基酸的氨基酸序列。只要保持蛋白的活性，氨基酸突變的數目不受特別限制。然而，一般優選改變氨基酸序列的5%或更少。因而，在一個優選的實施方案中，在此類突變體中要突變的氨基酸數目一般為30個氨基酸或更少，優選20個氨基酸或更少，更優選10個氨基酸或更少，更優選 6個氨基酸或更少，更優選3個或4個氨基酸或更少。要突變的氨基酸殘基優選突變為氨基酸側鏈特性保持的另一種氨基酸(稱為保守性氨基酸替代的過程)。氨基酸側鏈特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能團或特征的側鏈脂肪族側鏈(G，A，V，L，I，P);含有羥基基團的側鏈(S，T，Y);含有硫原子的側鏈(C，M);含有羧酸和酰胺的側鏈(D，N，E，Q);含有堿的側鏈(R，K，H);和含有芳香族的側鏈(H，F，Y，W)。 提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領域是公知的。例如，下列8個組各種包含彼此構成保守性替代的氨基酸I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守性修飾多肽包括在本發明的ERCC6L蛋白中。然而，本發明并不僅限于此，而且ERCC6L蛋白包括非保守性修飾，只要ERCC6L蛋白的至少一種生物學活性得以保留即可。另外，經過修飾的蛋白并不排除多態變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼者。此外，本發明的ERCC6L基因涵蓋編碼ERCC6L蛋白的此類功能性等同物的多核苷酸。在雜交之外，可以利用基因擴增方法來分離編碼與ERCC6L蛋白功能等同的多肽的多核苷酸，例如聚合酶鏈式反應(PCR)方法，使用基于蛋白編碼DNA的序列信息(SEQ ID NO 9) 合成的引物。分別構成人類ERCC6L基因和蛋白的功能性等同物的多核苷酸和多肽通常與其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常指40%或更高的同源性，優選 60 %或更高，更優選80 %或更高，甚至更優選90 %至95 %或更高，甚至更優選96 %、97 %、 98%、99%或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 :726-30 (1983) ” 中的算法來確定。診斷癌癥的方法:發現ERCC6L基因的表達在肺癌中特異性的提高(

圖1A、B)。Northern印跡分析顯示了 ERCC6L在正常組織中不表達，但是在肺癌細胞系中強表達(圖1C)。因而，本文鑒定出的ERCC6L基因及其轉錄與翻譯產物可以作為標志用于診斷癌癥諸如肺癌，而且，通過測量樣品中ERCC6L的表達進行。可通過在源自受試者的樣品與正常樣品之間比較ERCC6L基因的表達水平來診斷或檢測癌癥。更特別地，本發明提供了通過確定受試者中ERCC6L表達水平檢測、診斷和/或確定癌癥，更特別的是ERCC6L相關癌癥的存在或其發生的傾向性的方法。因而，本發明提供了一種用于檢測或診斷受試者中癌癥的方法，所述方法包括測定源自受試者的生物樣品中ERCC6L基因表達水平的步驟，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示樣品中存在或懷疑存在癌細胞，繼而提示受試者患有或有風險發生癌癥。ERCC6L基因的表達水平可通過任何已知方法來測定，其例子包括(a)檢測 ERCC6L 基因的 mRNA ；
(b)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質；和(c)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質的生物學活性。在優選的實施方案中，要通過本方法診斷的癌癥是肺癌，包括NSCLC和SCLC。 NSCLC包括肺的腺癌(ADC)和肺的鱗狀細胞癌(SCC)。依照本發明，可以提供用于檢查受試者狀況的中間結果。此類中間結果可以與別的信息組合來幫助醫生、護士、或其它從業人員診斷受試者患有疾病。因此，本發明考慮 ERCC6L作為用于癌癥的診斷標志物的用途。或者，本發明可用于檢測或鑒定源自受試者的組織中的癌性細胞，此類細胞特征在于所述表達水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示組織中癌細胞的存在或懷疑。ERCC6L表達結果可以與別的信息組合來幫助醫生、護士、或其它保健從業人員診斷受試者患有疾病。換言之，本發明可以給醫生提供有用信息來診斷受試者患有疾病。例如，依照本發明，當關于自受試者獲得的組織中癌細胞的存在有疑問時，通過考慮ERCC6L基因的表達水平，加上疾病的不同方面，包括組織病理學、血液中的已知腫瘤標志物的水平、和受試者的臨床過程等，能做出臨床決策。例如，一些公知的血液中的診斷性肺腫瘤標志物為IAP、 ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SPI、Span-1、TPA、CSLEX、SLX、 STN和CYFRA。就是說，在本發明的這個具體實施方案中，基因表達分析的結果作為中間結果，用于進一步診斷受試者的疾病狀態。本發明特別感興趣的是了下述[I]到[10]的方法[I] 一種在受試者中檢測或診斷癌癥的方法，包括測定源自受試者的生物樣品中 ERCC6L基因的表達水平，其中所述水平較之所述基因正常對照水平的提高指示所述受試者患有或有風險形成癌癥；[2] [I]的方法，其中所述表達水平比正常對照水平高至少10% ；[3] [I]的方法，其中所述表達水平通過選自下組的方法檢測(a)檢測 ERCC6L 基因的 mRNA ；(b)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質；(c)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質的活性；[4] [I]的方法，其中所述癌癥為肺癌。[5] [3]的方法，其中所述表達水平是通過檢測探針與基因的基因轉錄物雜交來確定的；[6] [3]的方法，其中所述表達水平是通過檢測抗體與基因編碼的蛋白的結合作為所述基因的表達水平來確定的；[7] [I]的方法，其中所述生物樣品包括活檢樣品、痰或血液。[8] [I]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含上皮細胞。[9] [I]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌細胞。[10] [I]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌性上皮細胞。本發明的診斷癌癥的方法在下面更加詳細的加以敘述。需用本方法診斷的患者優選為哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不僅限于，例如，人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、 貓、馬以及牛。為實施診斷，優選從要診斷的受試者采集生物樣品。任何生物學材料均可作為生物樣品用于測定，只要其包括目標的ERCC6L轉錄或翻譯產物。所述生物樣品包括，但不僅限于，想要診斷或懷疑患有癌癥的身體組織與體液，例如活檢樣品，血液，痰與尿液。生物樣品優選含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，較優選癌性上皮細胞或源自懷疑為腫瘤的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織或體液中純化所述細胞，并將其用為生物樣品。在一個優選的實施方案中，生物樣品可包括自要診斷的受試者獲得的肺細胞或肺組織。根據本發明，測定在所述源自患者的生物樣品中ERCC6L的表達水平。表達水平可在轉錄產物(核酸)水平確定，使用本領域熟知的方法。舉例而言，ERCC6L的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。可在芯片或陣列上實施所述檢測。對檢測包括ERCC6L在內的多個基因(例如，多種癌癥特異性基因)的表達水平而言，優選使用陣列。本領域技術人員可利用ERCC6L的序列信息制備上述探針。舉例而言，ERCC6L的cDNA 可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標記，例如染料、熒光或同位素，且所述基因的表達水平可以作為發生了雜交的標記物的強度來檢測。進一步，ERCC6L的轉錄產物可通過基于擴增的檢測技術(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制備。舉例而言，用于實施例的引物 (SEQ ID NO 1和2)可用于通過RT-PCR或Northern印跡的檢測，但本發明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件與低嚴格條件下與ERCC6L的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件， 在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，在不同的環境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發生。一般地，嚴格條件的溫度應選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熔點(Tm)低大約5°C。 Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態下有50%的與靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被占據。 典型地，嚴格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約O. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩定劑， 例如甲酰胺，來實現。或者，可以檢測翻譯產物以進行本發明的診斷。例如，可以測定ERCC6L蛋白的量。 測定作為翻譯產物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段保留對ERCC6L蛋白的結合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，并且在本發明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于ERCC6L的翻譯產物檢測其基因的方法，可利用針對ERCC6L蛋白的抗體通過免疫組織化學分析觀察其染色的強度。意即，觀察到強染色表明所述蛋白質存在量增加，且同時表明ERCC6L的高表達水平。另外，除ERCC6L基因的表達水平外,還可測定其它癌相關基因，例如，已知在癌癥中有差異表達的基因的表達水平，以提高所述診斷的可靠性。對于包括ERCC6L基因的癌標志基因而言，如果該癌標志基因在生物樣品中的表達水平較其相應的癌標志基因的對照水平增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過I. I倍，超過I. 5倍，超過2. O倍，超過
5.O倍，超過10倍或者更多，則認為其表達水平增加。對照水平可以與測試生物樣品同時確定，使用先前從疾病狀態(患癌或未患癌) 已知的患者收集和保存的樣品。或者，對照水平可以借助統計方法，根據通過分析先前測定的來自疾病狀態已知的受試者的樣品的ERCC6L基因表達水平獲得的結果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數據庫。而且，根據本發明的一個方面，可以將生物樣品中ERCC6L基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優選地使用從來自與源自受試者的樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優選地，使用具有已知的疾病狀態的群體中ERCC6L基因表達水平的標準值。 標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如,平均值±2S. D.或平均值±3S. D.的范圍可以用作標準值。在本發明的背景中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平是從癌性生物樣品確定的，則稱作“癌對照水平”。當ERCC6L基因的表達水平相比正常表達水平有所提高或與癌性對照水平相似， 則受試者可診斷為正罹患或有危險罹患癌癥。進一步，當比較多種癌相關基因的表達水平時，樣品與癌性參照之間基因表達模式的相似性表明受試者正罹患或有危險罹患癌癥。測試生物樣品的表達水平與對照水平間的差異可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態改變的對照核酸(例如管家基因)的表達水平加以標準化。示例對照基因包括，但不僅限于，β -肌動蛋白、甘油醛_3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。在本發明中，揭示了 ERCC6L不僅是有用的診斷標志物，而且還是癌癥治療的合適靶物。因此，可通過本發明來實現靶向ERCC6L的癌癥治療。在本發明中，靶向ERCC6L的癌癥治療指阻抑或抑制癌細胞中的ERCC6L活性和/或表達。任何抗ERCC6L劑可用于靶向 ERCC6L的癌癥治療。在本發明中，抗ERCC6L劑包括下述物質或活性組分(a)本發明的雙鏈分子，(b)編碼它的DNA，和(C)編碼它的載體。因而，在一個優選的實施方案中，本發明提供下述方法(i)診斷受試者是否具有要用抗ERCC6L劑治療的癌癥，和/或(ii)為靶向ERCC6L的癌癥治療選擇受試者，該方法包括下述步驟(a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中ERCC6L的表達水平；(b)將ERCC6L的表達水平與正常對照水平比較；(c)如果ERCC6L的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并(d)如果在步驟(C)中將該受試者診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進行癌癥治療。或者，此類方法包括下述步驟(a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中ERCC6L的表達水平；
(b)將ERCC6L的表達水平與癌性對照水平比較；(c)如果ERCC6L的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并(d)如果在步驟(C)中將該受試者診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進行癌癥治療。診斷癌癥的試劑盒:本發明還提供了診斷癌癥的試劑盒，其亦可用于評價和/或監測癌癥療法功效。 本發明還提供用于確定罹患可用本發明雙鏈分子或編碼它的載體來治療的癌癥的受試者的試劑盒，其也可用于評估和/或監測此類癌癥治療的效果。優選地，要用本試劑盒診斷癌癥是肺癌，包括NSCLC和SCLC。更優選地，所述試劑盒包含至少一種在源自受試者的生物樣品中檢測ERCC6L基因表達的試劑，所述試劑可選自下組(a)檢測ERCC6L基因的mRNA的試劑；(b)檢測ERCC6L的蛋白質的試劑；(c)檢測ERCC6L的蛋白質的生物學活性的試劑。適于檢測ERCC6L基因mRNA的試劑包括特異性結合或識別ERCC6LmRNA的核酸，諸如具有與ERCC6L mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對ERCC6L mRNA特異性的引物與探針。可基于本領域眾所周知的方法制備這類寡核苷酸。如果需要， 檢測ERCC6L mRNA的試劑可固定化在固體基質上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測ERCC6L mRNA的試劑。另一方面，適于檢測ERCC6L蛋白質的試劑包括針對ERCC6L蛋白質的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用于檢測，只要所述片段保留與ERCC6L蛋白的結合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領域是眾所周知的，且可在本發明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產生信號的分子通過直接連接或間接標記技術進行標記。標記物與標記抗體以及抗體與其靶結合的檢測在本領域是眾所周知的，且本發明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測ERCC6L蛋白質的試劑。進一步，所述生物學活性可通過，例如，測量所述生物樣品中由于ERCC6L蛋白質表達而導致的細胞增殖活性來確定。舉例而言，可在源自受試者的生物樣品的存在下培養所述細胞，然后通過檢測增殖的速度，或測量細胞周期或集落形成活性，可確定所述生物樣品的生物學活性。如需要，檢測ERCC6L mRNA的試劑可固定化在固體基質上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測ERCC6L蛋白質生物學活性的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。進一步，所述試劑盒可包括固體基質以及用于將探針與ERCC6L基因結合的試劑或針對ERCC6L蛋白質的抗體，用于培養細胞的培養基與容器，陽性與陰性對照試劑，以及用于檢測針對ERCC6L蛋白質的抗體的第二抗體。 舉例而言，從患有或沒有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發明的試劑盒可進一步包括其它從商業或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾紙、 針頭、注射器和帶有使用說明書的裝箱單(例如，書面的、磁帶、⑶_R0M、URL等等)。這些試劑之類的可在標上標簽的容器中提供。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。作為本發明的一個實施方案，當所述試劑是針對ERCC6L mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質上，例如多孔條，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置。此外，對照位置可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在接下來的位置上量較小。在加入樣品之后，顯示可檢測信號位置的數量提供了在樣品中存在的ERCC6L mRNA量的定量指征。所述檢測位置可具有任何合適可檢測的形狀，并通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。本發明所述試劑盒可進一步包括陽性對照和/或陰性對照樣品，和/或ERCC6L 標準樣品。本發明的所述陽性對照樣品可通過收集ERCC6L陽性樣品來制備。此類 ERCC6L陽性樣品可例如自已建立的肺癌細胞系獲得，包括肺的腺癌細胞(ADC)系諸如 A427、NCI-H1781、A549、LC319 等等；肺的鱗狀細胞癌(SCC)細胞系諸如 NCI-H26、EBC-U NCI-H520、NCI-H2170 等等；和 SCLC 細胞系諸如 DMSl 14、DMS273、SBC-3、SBC-5、H196、H446 等等。或者，ERCC6L陽性樣品可自臨床肺癌組織獲得，包括肺的腺癌組織、肺的鱗狀細胞癌組織和SCLC組織。或者，陽性對照樣品可通過確定截留值并制備含有量超過截留值的 ERCC6L mRNA或蛋白的樣品來制備。在本文中，短語“截留值”指在正常范圍和癌性范圍之間區分的值。例如，本領域技術人員可使用接受者運行特征(ROC)曲線來確定截留值。本試劑盒可包括含有截留值量的ERCC6L mRNA或多肽的ERCC6L標準樣品。相反，陰性對照樣品可自非癌性細胞系或非癌性組織諸如正常肺組織制備，或者可以通過制備含有少于截留值的ERCC6L mRNA或蛋白的樣品來制備。或者，本發明提供試劑制備用于診斷癌癥的診斷試劑的用途。在一些實施方案中， 該試劑可選自下組(a)用于檢測ERCC6L基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測ERCC6L蛋白的試劑；和(c)用于檢測ERCC6L蛋白的生物學活性的試劑。具體地，此類試劑是與ERCC6L多核苷酸雜交的寡核苷酸或與ERCC6L多肽結合的抗體。抗癌物質的篩詵:通過本發明，證明了 ERCC6L涉及癌細胞生長。因而，阻抑ERCC6L基因的表達水平和/或ERCC6L多肽的生物學活性的物質預期可用于治療和/或預防癌癥。可使用ERCC6L 基因、由該基因編碼的多肽、或該基因的轉錄調節區來篩選此類物質。如此，本發明還提供使用ERCC6L基因、ERCC6L多肽、或該基因的轉錄調節區篩選用于治療和/或預防癌癥的候選物質的方法。在本發明的背景中，待通過本篩選方法鑒定的物質可以是任何化合物或包含數種化合物的組合物。而且，根據本發明篩選方法暴露于細胞或蛋白的測試物質可以是單種物質或多種物質的組合。當在方法中使用物質組合時，各物質可以順次或同時加以接觸。通過本篩選方法篩選的物質可以是用于治療和/或預防癌癥和/或抑制癌細胞生長的合適候選物質。在本發明中，所述癌癥優選特征在于與ERCC6L過表達的關聯。因而， 所篩選的物質可優選應用于與ERCC6L過表達有關或有關聯的癌癥。在優選的實施方案中，所述與ERCC6L過表達有關或有關聯的癌癥是肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC包括但不限于肺的腺癌(ADC)和肺的鱗狀細胞癌(SCC)。任何測試物質，例如，細胞提取物、細胞培養上清、發酵微生物產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構建體， 例如反義RNA、siRNA、核酶以及適體等等)以及天然化合物，均可用于本發明的篩選方法中。也可使用本領域熟知的很多組合文庫方法中的任何途徑來獲得本發明的測試物質，包括(I)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要解卷積(deconvolution)的合成文庫法，⑷“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文庫法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam,Anticancer Drug Des 1997,12:145-67)。合成分子文庫方法的例子可在現有技術中找到(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 :6909-13 ；Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al. , J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al. , Science 1993,261 :1303-5 ；Care11 et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ； Care 11 et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37 :1233-51)。化合物文庫可提供于溶液中(參見 Houghten, Bio/Techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam, Nature 1991,354: 82-4)、芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、細菌上(美國專利 5，223，409)、孢子上 (美國專利 5，571，698 ;5，403，484 與 5，223，409)、質粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386-90 ; Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ;美國專利申請 2002103360)。通過本發明任一篩選方法篩選到的化合物的一部分結構通過添加、刪除、和/或置換方式被轉換而得到的物質，包括在通過本發明篩選方法鑒定的物質之內。此外，當通過本篩選方法獲得的候選物質是蛋白質時，為了獲得編碼該蛋白的 DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定該編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的DNA。可以對所得的DNA確認其在制備治療或預防癌癥的候選物質中的有用性。在本文描述篩選中使用的測試樣品亦可為特異性結合ERCC6L蛋白或其缺乏原蛋白的體內生物學活性的部分肽的抗體。盡管測試物質文庫的構建是本領域眾所周知的，在下文中還是進一步提供了鑒定測試物質和構建用于本篩選方法的這些測試物質的文庫的指導。(i)分子建模:對具有目標性質的物質的分子結構和/或對ERCC6L蛋白的分子結構的知識為人們構建測試物質文庫提供了便利。預篩選適于進一步評估的受試物質的方法之一，利用對受試物質與其靶標的相互作用進行計算機建模。計算機建模技術為選定分子的三維原子結構的可視化以及會與該分子相互作用的新物質的合理設計提供了可能。三維構建典型地依賴于來源于選定分子的X-射線晶體分析或NMR成像的數據。分子動力學需要力場數據。計算機圖形系統為預測新物質如何連接靶分子，以及實驗操作物質和靶分子的結構以完善結合特異性提供了可能。為了預測當分子和物質之一或二者都發生細小改變時分子-物質相互作用是什么樣的，需要分子力學軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯著分子設計程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅動的界面。上文一般性描述的分子建模系統的一個實例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham, Mass。CHARMm執行能量最小化和分子動力學功能。QUANTA執行構建、圖形建模和分子結構分析。利用QUANTA可進行分子相互行為的互動性構建、修飾、可視化和分析。關于與特異蛋白相互作用的藥物的計算機建模主題已經發表了多篇文獻，其例子包括 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ;Ripka, New Scientist 1988,54-8 ；McKinlay&Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989,29: 111-22 ；Perry&Davies, Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40，141-62 ;以及關于核酸組分模型受體的 Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111 :1082-90。其它可篩選并圖形描述化學物質的計算機程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc. , Pasadena, Calif. , Allelix, Inc 公司、Cambridge, Ontario 的 Hypercube, Inc.等公司獲取。見例如 DesJarlais et al. , J Med Cheml988, 31 722-9 ；Meng et al. , J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al. , Proteins 1993, 17 :266-78 ；Shoichet et al. , Science 1993,259 :1445_50。一旦鑒定出推定的抑制劑，可使用組合化學技術基于鑒定出的推定抑制劑的化學結構構建任何數量的變體，如下所述。對于所得的推定抑制劑，或“測試物質”文庫，可使用本發明的方法篩選，以鑒定適于治療和/或預防癌癥和/或預防癌癥術后復發的物質，特別是所述癌癥是肺癌的情況。(ii)組合化學合成:測試物質的組合文庫可以作為合理藥物設計程序的一部分來制備，合理藥物設計程序涉及有關已知抑制劑中存在的核心結構的知識。這種策略使得文庫可以保持合理的規模，便于進行高通量篩選。或者，可通過簡單地合成構成文庫的分子家族的所有排列，來構建簡單的，特別是短的、聚合物性的分子文庫。后一種方法的一個實例是由所有長度為6個氨基酸組成的肽文庫。這種肽文庫包含所有6氨基酸序列排列。這種類型的文庫稱作線性組合化學文庫。組合化學文庫的制備是本領域技術人員所熟知的，可以通過化學或生物合成來產生。組合化學文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ;Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al. , Naturel991,354 :84-6)。也可以使用其它用于產生化學多樣性文庫的化學。這些化學包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被編碼的肽(例如W093/20242)，隨機生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美國專利5, 288, 514), diversomer如乙內酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多妝(Hagihara et al. , J Amer Chem Soc 1992,114 :6568),具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非妝類妝模擬物(Hirschmann et al. , J Amer Chem Soc 1992,
17114 :9217-8),小化合物文庫的模擬物有機合成(analogous organic synthese) (Chen et al. , J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氛基甲酸鹽(Cho et al. , Sciencel993, 261 1303),和 / 或妝酸勝酸酯(peptidylphosphonates) (Campbell et al. ,J Org Chem 1994, 59 :658),核酸文庫(見 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 補充; Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA),肽核酸文庫(見例如美國專利5，539, 083),抗體文庫(見例如 Vaughan et al. ,Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287),碳水化合物文庫(見例如 Liang et al.，Sciencel996，274 :1520-22 ;美國專利 5，593，853)，和有機小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec I ；6 (6) 624-31 ;類異戍二烯(isoprenoids),美國專利 5, 569, 588 ;噻唑燒酮(thiazoIidinones) 和偏硫雜氮雜環己燒(metathiazanone)，美國專利5, 549, 974 ;卩比咯燒(pyrrolidines)， 美國專利5，525，735和5，519，134 ;嗎啉代化合物，美國專利5，506, 337 ;苯并二氮卓， 5，288，514 ;等)。用于制備組合文庫的設備是可商購的(見例如357MPS, 390MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫本身也是商業可得的(見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。(iii)其它候詵物:另一種手段是使用重組細菌噬菌體來產生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott&Smith，Science 1990, 249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ；Devlin et al. , Science 1990，249 :404-6)，可以構建非常大的文庫 (例如106-108個化學實體)。再一種手段主要使用化學方法，其實例包括Geysen方法 (Geysen et al.,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251:767-73)。Furka 等 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ； Furka, Int J Peptide Protein Resl991, 37 :487-93) ,Houghten (美國專利 4，631，211)和 Rutter等(美國專利5，010，175)記載了產生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動劑或拮抗劑加以測試。適體是由緊密結合特定分子祀的核酸構成的大分子。Tuerk和Gold(Science. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通過指數式富集進行的配體系統性進化)方法來選擇適體。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文庫{例如IO15種不同分子)可用于篩選。I.基于蛋白質的篩詵方法本發明提供了使用ERCC6L多肽篩選可用于治療和/或預防癌癥的候選物質的方法。在本篩選方法的背景中，要使用的ERCC6L多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質、 結合至載體的形式或融合有其它多肽的融合蛋白。另外，ERCC6L多肽可以是重組多肽、自然界來源的蛋白質或其部分肽。除了天然存在的ERCC6L多肽外，該多肽的功能性等同物可包括在用于本篩選的 ERCC6L多肽中，只要經過修飾的肽保留初始多肽的至少一種生物學活性即可。ERCC6L多肽的生物學活性的例子包括但不限于細胞增殖活性、螺旋酶活性、ATP酶活性和Plkl結合活性。此類功能性等同物的優選例描述于上文題為“ERCC6L基因和ERCC6L蛋白”的節。例如，此類功能性等同物的優選例包括含有ERCC6L多肽螺旋酶域的多肽(例如SEQ ID NO 10 的 61 至 631)。所述多肽可進一步連接其他物質，只要連接工藝和連接的物質不干擾初始多肽和 /或片段的生物學活性即可。可利用的物質包括例如肽、脂質、糖和糖鏈、乙酰基、天然和合成聚合物等。可進行這些類型的修飾以賦予該多肽及片段別的功能或使其穩定。用于本發明方法的多肽可作為天然存在蛋白質通過常規純化方法獲得自自然界，或基于所選擇的氨基酸序列通過化學合成獲得。例如，可用于合成的常規肽合成法包括I)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；3)Peptide Synthesis (日語)，Maruzen Co. , 1975 ；4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日語)，Maruzen Co. , 1985 ；5) Development of Pharmaceuticals (第二 卷)(日語)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；6)W099/67288 ;和7) Barany G. &Merrif ield R. B. , Peptides Vol.2, “Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press, New York,1980，100-118。或者，可通過采用用于產生多肽的任何已知基因工程方法來獲得該多肽(例如 Morrison J. , J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；CIark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology (Wu等人編輯)1983,101 :347-62)。例如，首先制備以可表達形式(例如位于包含啟動子的調節序列的下游)包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的適合的載體，然后轉化入合適的宿主細胞，接著培養宿主細胞以產生蛋白質。更具體的說，通過將編碼ERCC6L多肽的基因插入用于表達外來基因的載體諸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. I、pCAGGS或pCD8， 在宿主(例如動物)細胞等中表達該基因。啟動子可用于表達。可使用任何常用的啟動子，包括例如 SV40 早期啟動子(Rigby in Williamson(編)，Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982,83-141)、EF_ α 啟動子(Kim et al. ,Gene 1990,91 217-23)、CAG啟動子(Niwa et al. ,Gene 1991，108 :193)、RSV LTR啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 :684-704)、SR α 啟動子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 1988， 8 :466)、CMV 立即早期啟動子(Seed et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1987,84:3365-9)、 SV40 晚期啟動子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，I :385-94)、腺病毒晚期啟動子(Kaufman et al. ,Mol Cell Biol 1989，9 :946)、HSV TK 啟動子等。可根據任何常規方法將載體導入宿主細胞以表達ERCC6L多肽，例如電穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Resl987，15 :1311-26)、磷酸鈣法(Chen et al. , Mol Cell Biol 1987，7 :2745-52)、DEAE 右旋糖苷法(Lopata et al. ,Nucleic Acids Res 1984,12 :5707-17 ；Sussman et al. ,Mol Cell Biol 1985，4 :1641-3)、脂轉染法(Deri jard B，Cell 1994，7 :1025-37 ;Lamb et al.， Nature Genetics 1993,5 :22-30 ；Rabindran et al. , Sciencel993,259 :230-4)等。還可使用體外翻譯系統在體外產生ERCC6L多肽。(i)ERCC6L結合物質的篩詵:
在本發明的背景中，在肺癌中檢測出ERCC6L基因的過表達，盡管在正常器官中沒有表達(圖I)。因而，本發明提供了使用ERCC6L基因和由其編碼的蛋白來篩選結合ERCC6L 多肽的物質的方法。由于癌癥中ERCC6L的表達，與ERCC6L多肽結合的物質期待可阻抑癌細胞的增殖，并因此對治療和/或預防癌癥是有用的。因此，本發明亦提供了使用ERCC6L多肽篩選阻抑癌細胞增殖的候選物質的方法，以及篩選治療或預防癌癥的候選物質的方法。特別地，此篩選方法的一個實施方案包括以下步驟(a)將測試物質與ERCC6L多肽接觸；(b)檢測所述多肽與所述測試物質之間的結合活性；和(c)選擇結合所述多肽的測試物質。或者，依照本發明，也可評估或估計測試物質對治療和/或預防癌癥的潛在治療效果。在一些實施方案中，本發明提供用于評估或估計測試物質對治療和/或預防癌癥和 /或抑制與ERCC6L過表達相關的癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使測試物質與由ERCC6L多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽和所述測試物質之間的結合活性；并(C)將潛在治療效果與測試物質關聯起來，其中當物質結合所述多肽時顯示潛在治療效果。在本發明的背景中，治療效果可以與測試物質和ERCC6L蛋白的結合活性關聯起來。例如，當某種測試物質結合ERCC6L蛋白時，可將所述測試物質鑒定或選擇為具有要求的治療效果的候選物質。或者，當某種測試物質不結合ERCC6L蛋白時，可將所述測試藥劑鑒定為沒有顯著治療效果。本發明的方法將在下面更加詳細的加以描述。需用于篩選的ERCC6L多肽可為重組多肽，或者是來自自然界的蛋白質，或其部分肽。與測試物質接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質、與載體結合的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。在優選的實施方案中，本發明使用的測試物質可以是蛋白質，諸如抗體或合成化學化合物。作為篩選與ERCC6L多肽結合的物質的方法，可使用本領域技術人員公知的多種方法。上述篩選可通過，例如，免疫沉淀方法進行。在使用免疫沉淀方法時，優選ERCC6L多肽包含抗體識別位點。要用于本篩選方法的ERCC6L多肽可如上所述來制備。或者，對于由ERCC6L基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識別位點(表位)導入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達為包含該表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗體系統(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。能夠利用其多克隆位點表達與例如β-半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S轉移酶和綠色熒光蛋白 (GFP)形成的融合蛋白的載體是可商購的。另外，還報道了如下的融合蛋白，其通過導入僅由數個到十二個(adozen)氨基酸構成的小型表位加以制備,使融合不會改變ERCC6L多肽的性質。可以使用例如多組氨酸(His-標簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標簽)、 E-標簽(單克隆噬菌體上的表位)等表位，和識別它們的單克隆抗體作為篩選與ERCC6L多肽結合的蛋白質的表位-抗體系統(!Experimental Medicine 13 :85-90 (1995))
在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細胞裂解物中而形成免疫復合體。免疫復合體由ERCC6L多肽、包含與該多肽結合的能力的多肽、和抗體組成。除了使用針對上述表位的抗體之外，還可以使用針對ERCC6L多肽的抗體進行免疫沉淀，這樣的抗體可以如上文所述制備。免疫復合體可以被沉淀，例如當抗體是小鼠IgG抗體時，可以通過蛋白A sepharose或蛋白G sepharose將其沉淀。如果將由ERCC6L基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結合這些表位的物質，例如谷胱甘肽-sepharose 4B,按照與使用針對ERCC6L多肽的抗體的相同的方式來形成免疫復合體。可遵循或根據，例如，文獻中的方法來實施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。普遍使用SDS-PAGE分析經免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠,可以利用結合蛋白的分子量來分析該蛋白。由于與ERCC6L多肽結合的蛋白難以通過考馬斯蘭染色或銀染色等普通染色方法檢測到，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養基中培養細胞，標記細胞中的蛋白，并檢測該蛋白。當蛋白的分子量已知時，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測定其序列。作為利用ERCC6L多肽來篩選結合該多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al. , Cell 65:83-90(1991))。特別地，與 ERCC6L 多肽結合的蛋白可以通過如下方法獲得，從預期表達結合ERCC6L多肽的蛋白質的培養細胞利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA文庫，在LB瓊脂糖上表達蛋白，將表達出的蛋白固定在濾膜上，使純化并且標記的ERCC6L多肽與上述濾膜反應，并依照標記物來檢測表達與ERCC6L多肽結合的蛋白的噬菌斑。本發明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結合，或者利用特異結合ERCC6L多肽或與ERCC6L多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體， 來進行標記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法。或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech) ;“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene);參考文獻見“Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)”, “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統中，使本發明的多肽與SRF結合區或GAL4結合區融合，并在酵母細胞中表達。從預期表達與本發明多肽結合的蛋白的細胞制備cDNA文庫，使該文庫在被表達時與VP16或GAL4轉錄激活區融合。然后，將cDNA文庫導入到上述酵母細胞中，并從檢測到的陽性克隆(當酵母細胞中表達出可與本發明多肽結合的蛋白時，兩者的結合激活報告基因，使陽性克隆可檢測)分離源自該文庫的cDNA。通過將上面分離的cDNA導入到大腸桿菌中并表達該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報告基因，除了 HIS3基因之外，還可以使用例如Me2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可以用親和色譜來篩選與ERCC6L多肽結合的物質。例如，可以把ERCC6L多肽固定在親和柱的載體上，而將含有測試物質的組合物施加到該柱上。這里的組合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物、抗體文庫等。在加載測試物質之后，沖洗柱子，從而可以收集得到結合于ERCC6L多肽的物質。當測試物質是蛋白質時，對所得蛋白質的氨基酸序列進行分析，根據該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼該蛋白的 DNA。利用表面等離子體共振現象的生物傳感器可以在本發明中用作檢測或定量結合物質的裝置。當使用這種生物傳感器時，可以僅使用微量并且沒有標記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia),以表面等離子體共振信號的形式對ERCC6L多肽與測試物質間的相互作用進行實時的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，就有可能對ERCC6L多肽與測試物質間的結合進行評估。用于篩選當固定的ERCC6L多肽暴露于合成化學物質或天然物質文庫或隨機噬菌體肽展示文庫時發生結合的分子的方法，以及使用基于組合化學技術的高通量篩選方法(ffrighton et al.，Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384:11-13(1996)； Hogan, Nature 384 :17-9(1996)),以不僅分離與ERCC6L蛋白結合的蛋白質，而且分離與 ERCC6L蛋白結合的物質(包括激動劑和拮抗劑)的方法，是本領域技術人員眾所周知的。(ii)陽抑ERCC6L牛物學活件的物質的篩詵:在本發明的背景中，ERCC6L蛋白特征在于具有促進癌細胞的細胞增殖的活性(圖 3)。本發明提供了利用此生物學活性作為指標，篩選可阻抑表達ERCC6L的癌細胞增殖的物質的方法，以及篩選用于治療和/或預防癌癥，特別是ERCC6-L相關癌癥，諸如肺癌的物質的方法。因此，本發明提供了使用由ERCC6L基因編碼的多肽來篩選治療和/或預防癌癥的候選物質的方法，其包括下列步驟(a)將測試物質與由ERCC6L多核苷酸編碼的多肽(ERCC6L多肽)或其片段接觸；(b)檢測步驟(a)所述多肽或片段的生物學活性；并(c)選擇與測試物質不存在時該多肽的生物學活性相比，阻抑由ERCC6L多核苷酸編碼的多肽(ERCC6L多肽)或片段的生物學活性的測試物質。依照本發明，可評估測試物質阻抑ERCC6L的生物學活性(例如細胞增殖活性)或候選物質治療和/或預防癌癥的治療效果。因此，本發明亦提供了使用ERCC6L多肽或其片段來篩選阻抑ERCC6L的生物學活性的候選物質或用于治療和/或預防癌癥的候選物質的方法，其包括以下步驟a)將測試物質與ERCC6L多肽或其功能性片段接觸；并b)檢測步驟a)的所述多肽或片段的生物學活性；并c)將b)的生物學活性與所述測試物質的治療效果關聯起來。或者，在一些實施方案中，本發明提供一種用于評估或估計測試物質治療和/或預防癌癥和/或抑制與ERCC6L過表達有關的癌癥生長的治療效果的方法，該方法包括以下步驟(a)將測試物質與ERCC6L多肽或其功能性片段接觸；(b)檢測步驟(a)所述多肽或片段的生物學活性；并(c)將潛在治療效果與測試物質關聯起來，其中當較之測試物質不存在下檢測到的由ERCC6L基因的多核苷酸編碼的多肽的生物學活性，該物質阻抑所述多肽的生物學活性時顯示潛在治療效果。此類癌癥包括肺癌。在本發明的背景中，治療效果可以與ERCC6L多肽或其功能性片段的生物學活性
22關聯起來。例如，當與某種測試物質不存在下檢測到的水平相比該測試物質阻抑或抑制 ERCC6L多肽或其功能性片段的生物學活性時，可將所述測試物質鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質。或者，當與某種測試物質不存在時檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不阻抑或抑制ERCC6L多肽或其功能性片段的生物學活性時，可將所述測試物質鑒定為沒有顯著治療效果的物質。本發明所述方法將在下面更加詳細的加以描述。任何ERCC6L多肽均可用于篩選，只要它們阻抑ERCC6L蛋白的生物學活性即可。 這樣的生物學活性包括ERCC6L蛋白的細胞增殖活性(在本文中也稱作“細胞增殖增強活性”或“細胞增殖促進活性”)、螺旋酶活性、ATP酶活性和Plkl結合活性。舉例而言，可使用ERCC6L蛋白，亦可使用與這些蛋白功能上等價的多肽。上述多肽可由細胞內源或外源地表達。在另一個方面，本發明還提供遵循上文“篩選”一節中描述的方法進行的篩選方法，此類方法包括下述步驟a)使測試物質與ERCC6L多肽或其片段接觸；b)檢測所述多肽或片段和所述測試物質之間的結合；c)選擇與所述多肽結合的測試物質；d)使步驟c)中選擇的測試物質與ERCC6L多肽或其片段接觸；e)將所述多肽或片段的生物學活性與在所述物質不存在下檢測到的生物學活性比較；并f)選擇阻抑所述多肽的生物學活性的物質作為用于治療或預防肺癌的候選物質。通過本篩選分離的物質是ERCC6L基因編碼的多肽的拮抗劑的候選者。術語“拮抗劑”是指通過結合多肽而抑制多肽功能的分子。該術語還指可降低或抑制編碼ERCC6L的基因的表達的分子。而且，通過本篩選分離的物質是如下物質的候選物，所述物質抑制ERCC6L 多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內相互作用。當本方法中要檢測的生物學活性是細胞增殖時，可以通過例如如下方法進行檢測制備表達ERCC6L多肽的細胞，在測試物質的存在下培養細胞，確定細胞增殖速度，測量細胞周期等，以及通過測量存活細胞或集落形成能力，例如圖3所示。選擇降低表達ERCC6L 的細胞的增殖速度的物質作為治療或預防癌癥的候選物質。更具體而言，該方法包括以下步驟(a)使測試物質與過表達ERCC6L的細胞接觸；(b)測量細胞增殖活性；并(C)選擇與測試物質不存在下的細胞增殖活性相比降低細胞增殖活性的測試物質。在優選的實施方案中，本發明的方法可進一步包括以下步驟(d)選擇對很少或不表達ERCC6L的細胞沒有影響的測試物質。短語“阻抑生物學活性”在此定義為較之不存在所述物質時，對ERCC6L生物學活性的優選至少10%的阻抑，更優選至少25%、50%或75%的阻抑，且最優選至少90%的阻抑。在優選的實施方案中，使用不表達ERCC6L多肽的對照細胞。因而，本發明還提供了使用ERCC6L多肽或其片段來篩選抑制細胞生長的候選物質或用于治療和/或預防ERCC6L相關疾病的候選物質的方法，包括下列步驟a)在測試物質存在下培養表達ERCC6L多肽或其功能性片段的細胞和不表達 ERCC6L多肽或其功能性片段的對照細胞；b)檢測表達所述蛋白的細胞和對照細胞的生物學活性；并c)選擇與對照細胞中及所述測試物質不存在下檢出的增殖相比抑制表達所述蛋白的細胞中的生物學活性的測試物質。如本文中揭示的，阻抑ERCC6L的生物學活性則降低細胞生長。如此，通過篩選抑制ERCC6L生物學活性的候選物質，可鑒定出可用于治療和/或預防癌癥的候選物質。可通過二次和/或更進一步篩選來評估這些候選物質治療或預防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療性物質、化合物或作用劑。例如，當抑制ERCC6L蛋白生物學活性的物質也抑制癌癥的活性時，可得出此類物質具有ERCC6L特異性治療效果的結論。II.改奪ERCC6L表汰的物質的篩詵在本發明的背景中，通過siRNA降低ERCC6L表達導致對癌細胞增殖的抑制(圖 2ABC)。因而，本發明提供了篩選抑制ERCC6L表達的物質的方法。抑制ERCC6L表達的物質可望能夠阻抑癌細胞增殖，并因此對治療或預防癌癥，特別是ERCC6L相關癌癥，諸如肺癌有用。因此，本發明亦提供了篩選阻抑癌細胞增殖的物質的方法，以及篩選治療或預防癌癥的候選物質的方法。在本發明的背景中，上述篩選可包括，例如，下列步驟(a)將測試物質與表達ERCC6L的細胞接觸；(b)選擇與對照相比降低ERCC6L表達水平的測試物質。在本發明的背景中，此類篩選方法可包括例如下述步驟a)將測試物質與表達ERCC6L基因的細胞接觸；b)檢測ERCC6L基因的表達水平；并c)將b)的表達水平與所述測試物質的治療效果關聯起來。在本發明的背景中，治療效果可以與ERCC6L基因表達水平關聯起來。例如，當與某種測試物質不存在下檢測到的水平相比該測試物質降低ERCC6L基因的表達水平時，可將所述測試物質鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質。或者，當與某種測試物質不存在下檢測到的水平相比該測試物質不降低ERCC6L基因表達水平時，可將所述測試物質鑒定為沒有顯著治療效果的物質。下面將更加詳細地描述本發明的方法。表達ERCC6L的細胞包括，例如，自肺癌建立的細胞系或經ERCC6L表達載體轉染的細胞系；任何這樣的細胞可用于上述本發明的篩選。可用本領域技術人員眾所周知的方法， 例如，RT-PCR> Northern印跡分析、Western印跡分析、免疫染色與流式細胞分析來估計表達水平。在此定義的短語“降低表達水平”優選為較之在所述物質不存在時的表達水平，至少使ERCC6L表達水平降低至少10%，更優選降低至少25%、50%或75%，最優選降低至少 95%的水平。本文中的物質包括化學化合物、雙鏈核苷酸等等。下面會描述雙鏈核苷酸的制備。在篩選方法中，可選擇降低ERCC6L表達水平的物質作為候選物質用來治療或預防癌癥。或者，本發明的所述篩選方法可包括下列步驟(a)將測試物質與導入了包含ERCC6L轉錄調控區域與在該轉錄調控區域控制下表達的報道基因的載體的細胞接觸；
(b)測量所述報道基因的表達或活性；并(C)選擇降低所述報道基因的表達或活性的測試物質。合適的報道基因和宿主細胞在本領域是眾所周知的。例示性報道基因包括但不限于螢光素酶、綠色突光蛋白(GFP)、香燕珊瑚(Discosoma sp.)紅色突光蛋白(DsRed)、 氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)、Laz與beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶S)，而宿主細胞為C0S7、 HEK293、HeLa等。所述篩選所需的報道構建體可通過將報道基因序列與ERCC6L基因轉錄調控區域連接來制備。本文所述的ERCC6L基因轉錄調控區域是從轉錄起始位點至至少500bp 上游的區域，優選lOOObp，更優選5000或IOOOObp上游。含有所述轉錄調控區域的核苷酸片段可從基因組文庫中分離出來，或可通過PCR擴增。所述篩選所需的報道構建體可通過將報道基因序列與所述基因的轉錄調控區域連接來制備。鑒別轉錄調控區域的方法，以及其測定法規程都是眾所周知的(Molecular Cloning,第三版,第17章,2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。將含有所述報道構建體的載體轉導入宿主細胞，且用本領域眾所周知的方法檢測報道基因的表達或活性(例如，使用照度計(luminometer)、吸收光譜儀、流式細胞儀等等)。在此定義的“降低表達或活性”優選較之在所述測試物質不存在時，報道基因的表達或活性優選地被降低至少10 %，更優選地，降低25 %、50 %或75 %，最優選地，降低至少95 %。或者，在一些實施方案中，本發明還提供一種用于評估或估計測試物質治療或預防癌癥或抑制與ERCC6L過表達有關的癌癥的治療效果的方法，該方法包括以下步驟(a)使測試物質與其中導入了載體的細胞接觸，該載體包含ERCC6L的轉錄調節區和在該轉錄調節區控制下表達的報道基因；(b)測量所述報道基因的表達水平或活性；并(C)將潛在治療效果與測試物質關聯起來，其中當測試物質降低所述報道基因的表達水平或活性時顯示潛在治療效果。依照本發明，可評估測試物質抑制細胞生長或候選物質治療或預防ERCC6L相關疾病的治療效果。因此，本發明還提供用于篩選阻抑癌細胞增殖的候選物質的方法，及篩選用于治療或預防ERCC6L相關疾病的候選物質的方法。依照另一個方面，本發明提供了一種方法，其包括以下步驟(a)使測試物質與其中導入了載體的細胞接觸，該載體包含ERCC6L基因的轉錄調節區和在該轉錄調節區控制下表達的報道基因；(b)檢測所述報道基因的表達水平或活性；并(C)將(b)的表達水平與測試物質的治療效果關聯起來。在本發明中，治療效果可以與所述報道基因的表達水平或活性關聯起來。例如，當與某種測試物質不存在下檢測到的水平相比該測試物質降低所述報道基因的表達水平或活性時，可將所述測試物質鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質。或者，當與某種測試物質不存在下檢測到的水平相比該測試物質不降低所述報道基因的表達水平或活性時，可將所述測試物質鑒定為沒有顯著治療效果的物質。通過篩選⑴結合ERCC6L多肽；(ii)阻抑/降低ERCC6L多肽的生物學活性(例如細胞增殖活性)；或(iii)降低ERCC6L基因的表達水平的候選物質，可鑒定出有可能治療或預防癌癥(例如肺癌)的候選物質。可通過二次和/或更進一步篩選這些候選物質來評估治療效果以鑒定用于癌癥的治療性物質。例如，當與ERCC6L多肽結合的物質抑制癌癥的上述活性時，可得出此類物質具有ERCC6L特異性治療效果的結論。雙鏈分子:如本文中使用的，術語“分離的雙鏈分子”指抑制靶基因表達的核酸分子，而且包括例如短干擾RNA (siRNA ;例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發夾RNA (shRNA))和短干擾 DNA/RNA (siD/R-NA ;例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發夾嵌合物(shD/R-NA))。如本文中使用的靶序列”是基因的mRNA或cDNA序列內的下述核苷酸序列，如果將本發明的雙鏈核酸分子導入表達該基因的細胞內的話，會導致整個mRNA的翻譯受到阻抑。對于基因的mRNA或cDNA序列內的某個核苷酸序列，若包含與靶序列對應的序列的雙鏈多核苷酸抑制表達該基因的細胞中該基因的表達，則可確定為靶序列。阻抑基因表達的雙鏈多核苷酸可以由靶序列和長度為2至5個核苷酸的3’突出端(例如im)的組成。當靶序列通過cDNA序列來顯示時，使用雙鏈cDNA的有義鏈序列(即將mRNA序列轉換成DNA序列而得到的序列)來限定靶序列。雙鏈分子包含有義鏈(其具有與靶序列對應的序列)和反義鏈(具有與靶序列互補的序列)，而且該反義鏈與該有義鏈在互補序列處雜交以形成雙鏈分子。在本文中，短語“與…對應”表示依照構成雙鏈分子有義鏈的核酸的種類來轉換靶序列。例如，當靶序列以DNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有RNA區時，將該RNA區內的堿基“t”替換為堿基“U”。另一方面，當靶序列以RNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有 DNA區時，將該DNA區內的堿基“u”替換為“t”。在本發明的背景中，靶序列主要以DNA顯示。換言之，本發明還提供如下的雙鏈分子，其靶序列包括或限于以DNA顯示的SEQ ID NO 7或SEQ ID NO :8，但可以替換為RNA。還有，對于雙鏈分子的反義鏈，與靶序列互補的序列可依照構成反義鏈的核酸的種類來限定。除與靶序列對應的序列及其互補序列之外，雙鏈分子還可具有一個或兩個長度為 2至5個核苷酸的3’突出端(例如im)和/或連接有義鏈和反義鏈的環序列以形成發夾結構。本文中使用的術語“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導入細胞的標準技術，包括其中以DNA為模板轉錄RNA的那些。所述siRNA包括ERCC6L有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、ERCC6L反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。 所述siRNA可如此構建使得單個轉錄物具有靶基因的有義核酸序列與其互補的反義核酸序列，例如，發夾結構。所述siRNA可為dsRNA或shRNA。本文中使用的術語“dsRNA”指包含相互互補序列的兩個RNA分子的構建體，所述兩個RNA分子通過所述互補序列退火以形成雙鏈RNA分子。所述兩條鏈的核苷酸序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因非編碼區域的核苷酸序列的RNA分子。在本說明書中使用的術語“shRNA”是指具有莖-環結構的siRNA，其包含彼此互補的第一區和第二區(即有義鏈和反義鏈)。兩個區的互補程度和方向足以使兩個區之間發生堿基配對，所述第一區和第二區通過環區連接在一起，而所述環是因為環區內的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shRNA的環區是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區，也可以稱作“間插單鏈.ntervening single-strand) ”在本說明書中使用的術語“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA 二者的雙鏈多核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說明書中，雜合體表示這樣的分子，其中由DNA組成的多核苷酸和由RNA組成的多核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導入細胞的常規技術。所述siD/R-NA包括ERCC6L有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、ERCC6L反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。siD/R-NA可以這樣構建， 使單個轉錄物同時具有來自靶基因的有義核酸序列和互補反義核酸序列，例如發夾。siD/ R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術語“dsD/R-NA”是指這樣兩個分子的構建體，所述兩個分子包含彼此互補的序列并且已經藉由所述互補序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因非編碼區的核苷酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA的兩個分子中的一個或兩個由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者一個分子由RNA組成而另一個由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術語“shD/R-NA”是指具有莖-環結構的siD/R-NA，其包含彼此互補的第一區和第二區，即有義鏈和反義鏈。所述區的互補程度和方向足以使它們之間發生堿基配對，第一區和第二區通過環區連接，所述環是因為在環區內的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shD/R-NA的環區是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區，也可以稱作“間插單鏈”。本說明書中使用的“分離的核酸”是指從本來的環境(例如自然出現時的自然環境)中被取出，與其自然狀態相比發生了合成性的改變的核酸。在本發明的背景中，分離的核酸包括DNA、RNA和它們的衍生物。與靶mRNA雜交的針對ERCC6L的雙鏈分子通過與正常單鏈mRNA基因轉錄物結合， 干擾其翻譯，抑制蛋白質表達，來降低或抑制由ERCC6L基因編碼的ERCC6L蛋白的產生。如本文中證明的，數種癌細胞系中ERCC6L的表達通過dsRNA得到抑制(圖2)。因此，本發明提供了能夠在導入表達ERCC6L基因的細胞后抑制該基因表達的分離雙鏈分子。所述雙鏈分子的靶序列可通過siRNA設計算法來設計，例如下述的。ERCC6L靶序列的例子包括例如SEQ ID NO 7和8的核苷酸。本發明中特別感興趣的是下列雙鏈分子[I]至[18][I] 一種分離的雙鏈分子，它當被導入細胞后，抑制ERCC6L的體內表達和細胞增殖，所述分子包括有義鏈以及與之互補的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子；[2] [I]中所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與靶序列 SEQ ID NO :7 或 8 匹配；[3] [2]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈包括對應于靶序列SEQ ID NO :7或8 的核苷酸序列；[4] [3]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約100個核苷酸對的長度；[5] [4]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約75個核苷酸對的長度；[6] [5]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約50個核苷酸對的長度；[7] [6]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約25個核苷酸對的長度；[8] [7]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有約19到約25個核苷酸對的長度；[9] [I]中所述的雙鏈分子，其由單一多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A, ]_3'，其中，[A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補的序列的反義鏈；[11] [I]中所述的雙鏈分子，其由RNA構成；[12] [I]中所述的雙鏈分子，其由DNA和RNA構成；[13] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[14] [13]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈分別由DNA與RNA構成；[15] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子為DNA與RNA的嵌合體；[16] [15]中所述的雙鏈分子，其中反義鏈3’端側翼的區域為RNA，或者有義鏈5’ 端側翼的區域與反義鏈3’端側翼的區域均為RNA ；[17] [16]中所述的雙鏈分子，其中所述側翼區域由9到13個核苷酸組成；[18] [2]中所述的雙鏈分子，其中所述分子包含3’突出端。本發明所述的雙鏈分子將在下面更詳細描述。設計具有抑制細胞內靶基因表達能力的雙鏈分子的方法是已知的(見例如，美國專利No. 6，506，559，本文通過提述并入其全部內容)。例如，可以從 Ambion 網站(//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_ finder, html)訪問用于設計siRNA的計算機程序。該計算機程序可以根據如下的規程選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。靶點的詵擇:I.從轉錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描搜尋AA雙核苷酸序列。記錄每個 AA的出現及其3’側相鄰的19個核苷酸作為潛在siRNA靶點。Tuschl等不建議針對5’和 3’非翻譯區(UTR)以及鄰近起始密碼子的區域(75個堿基之內)設計siRNA，因為這些區域可能更富含調節蛋白質的結合位點，而UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合物可能干擾s i RNA 核酸內切酶復合物的結合。2.將潛在靶點與合適的基因組數據庫(人、小鼠、大鼠等)進行比較，將任何與其他編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外。主要使用BLAST(Altschul SF等， Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可見于 NCBI 服務器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著待評估的基因的長度選擇幾個靶序列。使用上述規程，設計本發明的用于ERCC6L基因的分離的雙鏈分子的靶序列為SEQID NO 7 和 8。分別對以上述靶序列為目標的雙鏈分子檢查其阻抑表達靶基因細胞生長的能力。 因此，本發明提供用于ERCC6L基因的以SEQ ID NO :7和8的序列為靶標的雙鏈分子。本發明的雙鏈分子可以針對一種靶ERCC6L基因序列或者可以針對多種靶ERCC6L基因序列。靶向上文所述ERCC6L基因靶序列的本發明雙鏈分子包括含有靶序列的核酸序列和/或與靶序列互補的序列的分離的多核苷酸。靶向ERCC6L基因的多核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO :7或8的序列和/或與這些核苷酸互補的序列的多核苷酸；然而，本發明并不僅限于這個例子，且上述核酸序列中次要修飾是可以接受的，只要所述經修飾分子保留阻抑ERCC6L基因表達的能力。本文中，短語“次要修飾”當用于和核酸序列相關時表示對所述序列替換、缺失、添加或插入一個、兩個或數個核酸。在一個實施方案中，雙鏈分子由兩條多核苷酸構成，一條多核苷酸具有與祀序列對應的序列，即有義鏈，而另一條多核苷酸具有與靶序列互補的序列，即反義鏈。有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。此類雙鏈分子的例子包括dsRNA和 dsD/R-NA。在另一個實施方案中，雙鏈分子由一條多核苷酸構成，其具有與祀序列對應的序列(即有義鏈)和與靶序列互補的序列(即反義鏈)二者。一般地，有義鏈和反義鏈通過間插鏈連接，且彼此雜交以形成發夾環結構。此類雙鏈分子的例子包括shRNA和shD/R-NA。換言之，本發明的雙鏈分子包含有義鏈多核苷酸(其具有靶序列的核苷酸序列) 和反義鏈多核苷酸(其具有與靶序列互補的核苷酸序列)，而且這兩種多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。在包含所述各多核苷酸的雙鏈分子中，兩條鏈任一或二者的多核苷酸的一部分可以是RNA，而且當靶序列用DNA序列來限定時，靶序列及其互補序列內的核苷酸 “t”用“u”替換。在本發明的一個實施方案中，本發明的此類雙鏈分子包含莖-環結構，其由有義鏈和反義鏈構成。有義鏈和反義鏈可通過環連接。因而，本發明還提供包含單一多核苷酸的雙鏈分子，該多核苷酸含有有義鏈和反義鏈二者，該有義鏈和反義鏈通過間插單鏈連接或側翼為間插單鏈。在本發明中，靶向ERCC6L基因的雙鏈分子可具有選自SEQ ID NO :7或8的序列作為靶序列。因而，本發明的雙鏈分子的優選例包括多核苷酸及其互補序列，和具有與SEQ ID NO 7和8對應的序列及其互補序列的多核苷酸。在本發明的背景中，術語“數個”當用于核酸替換、缺失、添加和/或插入時可意指 3-7個，優選3-5個，更優選3-4個，進一步更優選是3個核酸殘基。根據本發明，本發明的雙鏈分子可用實施例中使用的方法檢測其能力。在本文中下述的實施例中，在體外對包含ERCC6L基因的mRNA不同部分的有義鏈或其互補的反義鏈的雙鏈分子測驗其在癌細胞系中降低ERCC6L基因產物產生的能力。進一步，例如，較之在沒有候選分子情況下培養的細胞，在與候選雙鏈分子接觸的細胞中ERCC6L基因產物的減少可由，例如，使用在實施例I “半定量逆轉錄RT-PCR”項中的針對ERCC6L mRNA的引物的 RT-PCR來加以檢測。然后，可對在體外基于細胞的分析中減少ERCC6L基因產物的序列檢測其針對細胞生長的抑制作用。然后可對在體外基于細胞的分析中抑制細胞生長的序列使用患癌癥動物檢測其體內的相應能力，以證實ERCC6L基因產物的產生降低與癌細胞生長降低，所述動物的例子包括裸小鼠異種移植模型。當所述分離多核苷酸是RNA及其衍生物時，核苷酸序列中的“t”應替換為“U”。本文中使用的術語“互補”指多核苷酸中核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，且術語結合意指兩個多核苷酸間物理的或化學的相互作用。當所述多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯酶聯接時，這些多核苷酸亦可以同樣地發生相互結合。一般而言，互補多核苷酸序列在合適條件下雜交以形成包含很少或沒有錯配的穩定雙鏈體。進一步，本發明中所述分離多核苷酸的有義鏈與反義鏈可通過雜交形成雙鏈分子或發夾環結構。在優選實施方案中，上述雙鏈體在每10個匹配中包含不超過一個錯配。在特別優選的實施方案中，雙鏈體的鏈完全互補，這樣的雙鏈體不包含錯配。對ERCC6L所述多核苷酸長度優選少于7006個核苷酸。舉例而言，對所述的基因， 多核苷酸長度小于500、200、100、75、50或25個核苷酸。本發明中所述分離多核苷酸對形成針對ERCC6L基因的雙鏈分子，或制備編碼雙鏈分子的模板DNA是有用的。當所述多核苷酸用于形成雙鏈分子時，所述多核苷酸可長于19個核苷酸，優選長于21個核苷酸，且更加優選長度在約19與25個核苷酸之間。因而，本發明提供了包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈是與靶序列對應的核苷酸序列。在優選的實施方案中，有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為19 至25個核苷酸對的雙鏈分子。當將雙鏈分子導入細胞中時，雙鏈分子充當RISC復合物識別mRNA中同源序列的向導。被識別的靶RNA受到Dicer核酸酶活性切割和降解，由此雙鏈分子最終降低或抑制由該RNA編碼的多肽的生成(表達)。因此，本發明的雙鏈分子可通過其生成在嚴格條件下與ERCC6L基因的mRNA特異性雜交單鏈的能力來定義。在本文中，mRNA中與自雙鏈分子生成的單鏈雜交的部分稱作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本發明的背景中，“靶序列”的核苷酸序列不僅可使用mRNA的RNA序列來顯示,而且還可以使用自mRNA合成的cDNA 的DNA序列來顯示。本發明中所述雙鏈分子可包含一個或更多修飾核苷酸和/或非磷酸二酯連接。本領域眾所周知的化學修飾具有增加所述雙鏈分子的穩定性、可用性和/或細胞攝入的能力。一般技術人員明白本發明分子可包含的其它類型的化學修飾(W003/070744 ; W02005/045037)。在一個實施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。 上述修飾的例子包括但不僅限于，硫代磷酸酯聯接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、 5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉脫氧脫堿基殘基的摻入(US20060122137)。另一個實施方案中，可以使用修飾來增強雙鏈分子的穩定性或增加尋靶效率。這樣的修飾包括但不限于雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學交聯、雙鏈分子一條鏈的3’或5’ 末端的化學修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸(W02004/029212)。在另一個實施方案中，修飾可以用于增加或減少針對靶 mRNA中和/或互補雙鏈分子鏈中互補核苷酸的親和力(W02005/044976)。例如，未修飾的喃唳核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5_甲基或5-丙炔基(5-propynyl)喃唳替代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一個實施方案中，當雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15，15(2) :188-200)。 關于進一步的細節，可以利用公開文獻如US20060234970。本發明不限于這些實例，可以將任何已知化學修飾應用于本發明的雙鏈分子，只要所得分子保留抑制靶基因表達的能力。此外，本發明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現出提高的穩定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸) 組成的雜合型雙鏈分子、或在任一單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，諸如此類，來增強所述雙鏈分子的穩定性。DNA鏈和RNA鏈的雜合體可以是這樣的，其中有義鏈是DNA而反義鏈是RNA，或者相反，只要它在導入表達靶基因的細胞中后能夠抑制該基因表達。優選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可以是這樣的，其中有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要在導入表達靶基因的細胞中時，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩定性，分子中優選包含盡可能多的DNA ;而為了誘導靶基因的表達抑制，要求分子在一定范圍內是RNA，以充分地誘導表達抑制。作為嵌合型雙鏈分子的一個優選實例，雙鏈分子的上游部分區域(即位于有義鏈或反義鏈內的靶序列或其互補序列之側翼的區域)為RNA。優選地，所述上游部分區表示有義鏈的5’側(5，端)和反義鏈的3’側(3’端)。或者，將位于有義鏈5’末端側翼或者反義鏈3’末端側翼的區域稱為上游部分區域。就是說，在優選實施方案中，反義鏈3’末端側翼的區域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側翼的區域和反義鏈3’末端側翼的區域均由 RNA組成。例如，本發明的嵌合型或雜合型雙鏈分子包含以下組合。有義鏈
5，-[DNA]-3，
3， -(RNA)-[DNA]-5’
:反義鏈，
有義鏈
5， -(RNA)-[DNA]-3’
3， -(RNA)-[DNA]-5’
:反義鏈，和
有義鏈
5， -(RNA)-[DNA]-3’
3，-(RNA)-5，
:反義鏈。
上游部分區優選是由9-13個核苷酸組成的域，從雙鏈分子的有義鏈或反義鏈內
的靶序列或其互補序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的優選實例包括這樣的實例鏈長為19-21個核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半區(對于有義鏈為5’側區域而對于反義鏈為3’側區域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達的效果比反義鏈整體為RNA時強得多(US20050004064)。 在本發明的背景中，雙鏈分子可以形成發夾結構，例如短發夾RNA(ShRNA)以及由
31DNA與RNA組成的短發夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成緊密的發夾轉彎，可以用來通過RNA干擾來沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA 在單一鏈上包含有義靶標序列和反義靶標序列，其中所述序列被環序列隔開。通常，發夾結構被細胞機制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進一步與RNA誘導的沉默復合物(RISC)結合。這種復合物結合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶標序列匹配的 mRNA ο為了形成發夾環結構，可以在有義序列與反義序列之間設置由任意核苷酸序列構成的環序列。因此，本發明還提供具有通式5’ _[A]-[B]-[A’ ]-3’的雙鏈分子。式中，[A] 為有義鏈，包含與靶序列對應的核苷酸序列；[B]為間插單鏈；W ]為反義鏈，包含與靶序列互補的序列。靶序列可以選自例如用于ERCC6L的SEQ ID NO 7和8。本發明不限于這些實例，在雙鏈分子保持抑制作為靶標的ERCC6L基因的表達的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在這些實例的基礎上修飾而得到的序列。區域[A] 與[A']雜交而形成由區域[B]構成的環。間插單鏈部分[B]、即環序列，長度優選可以為 3 23個核苷酸。例如,環序列可以選自由以下的序列組成的組(//www. ambion. com/ techlib/tb/tb_506. html)。此外，由23個核苷酸組成的環序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al. , Nature 2002Jul 25,418 (6896) :435-8, Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8, Epub 2002 Jun 26 ；UUCG Lee NS et al. ,Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5 ；Fruscoloni P et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) :1639-44，Epub 2003 FeblO -MUUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6) 457-67。優選的具有本發明的發夾環結構的雙鏈分子實例如下所示。在下面的結構中，環序列可以選自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 組成的組； 但本發明不限于此CUGCACAACCAACUCUUUG- [B] -CAAAGA ⑶ UG ⑶腳 GCAG(對于靶序列SEQ ID NO :7)。AUGUUAAUCAAUAACUGGC-[B]-GCCAGUUAUUGAUUAACAU(對于革巴序列SEQID NO :8)。此外，為了增強雙鏈分子的抑制活性，可以將數個核苷酸添加到靶序列的有義鏈和/或反義鏈的3’末端，作為3’突出端。構成3’突出端的核苷酸的優選例包括但不限于 “t”和“U”。添加的核苷酸的數目為至少2個，通常為2-10個，優選為2-5個。添加的核苷酸在雙鏈分子的反義鏈的3’末端形成單鏈。在雙鏈分子由單一多核苷酸組成以形成發夾環結構的情況中，可以將3’突出端添加至單一多核苷酸的3’末端。對于雙鏈分子的制備方法沒有特殊限制，但優選采用本技術領域公知的化學合成方法。根據化學合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當的方法使它們退火到一起，來獲得雙鏈分子。退火的具體例子包括其中將合成的單鏈多核苷酸以優選至少約3 7、更優選約4 6、最優選基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈分子解離的溫度，再緩慢冷卻。經退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術領域公知的常用方法來純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剩余的單鏈多核苷酸(例如利用適當的酶進行降解)的方法。所述位于ERCC6L序列側翼的調控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達能夠獨立地，或者以時間性或空間性方式被調控。所述雙鏈分子可通過將ERCC6L基因模板克隆入載體(例如含有來自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III轉錄單元或人類HlRNA啟動子的載體)以在胞內進行轉錄。或者，雙鏈分子可在胞內轉錄，即將其編碼序列克隆入含有與編碼區相鄰的指導雙鏈分子在適當細胞中表達的調節序列(例如來自小核RNA(snRNA) U6的RNA poly III轉錄單元或人HlRNA啟動子)的載體中。雙鏈分子的編碼序列側翼的調節序列可以相同或不同，使得它們的表達可獨立調控，或者以時間或空間方式調控。下面會描述能夠生成雙鏈分子的載體的詳情。含有本發明雙鏈分子的載體:如上所述，本發明包括含有一種或多種本文所述的雙鏈分子的載體、以及包含該載體的細胞。本發明中特別感興趣的是下列載體[I]至[10]。[I] 一種載體，它編碼當被導入細胞后，抑制ERCC6L的體內表達和細胞增殖的雙鏈分子，其中所述分子包含有義鏈以及與之互補的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子。[2] [I]中所述的載體，它編碼對mRNA作用的雙鏈分子，所述mRNA與靶序列SEQ ID NO :7或8匹配；[3] [I]中所述的載體，其中有義鏈包括對應于靶序列SEQ ID NO :7或8的序列；[4] [3]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約100個核苷酸對的雙鏈分子；[5] [4]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約75個核苷酸對的雙鏈分子；[6] [5]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約50個核苷酸對的雙鏈分子；[7] [6]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約25個核苷酸對的雙鏈分子；[8] [7]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為約19個至約25個核苷酸對的雙鏈分子；[9] [I]中所述的載體，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；和[10] [9]中所述的載體，它編碼具有通式5' -[A]-[B]-[A, ]_3'的雙鏈分子，其中，[A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應的序列的有義鏈，[B]為由3個至23個核苷酸構成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補的序列的反義鏈；本發明的載體優選編碼處于可表達的形式的本發明的雙鏈分子。在本說明書中， 術語“處于可表達的形式”，是指該載體當被導入細胞中時，將表達該分子。在優選的實施方案中，載體包含雙鏈分子表達所必需的調節元件。本發明的這種載體可以用于產生本發明的雙鏈分子，也可以直接用作癌癥治療的活性成分。
本發明的載體可通過下述方法生成例如，將ERCC6L序列克隆入表達載體中，使調控序列可操作性地連接于ERCC6L序列，以允許兩條鏈的表達(通過DNA分子的轉錄) (Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，與 mRNA 反義的 RNA 分子由第一啟動子(例如位于克隆DNA的3’末端側翼的啟動子序列)轉錄，對mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動子(例如位于克隆DNA的5’末端側翼的啟動子序列)轉錄。有義和反義鏈在體內雜交，產生用于沉默該基因的雙鏈分子構建體。或者，使用分別編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個載體構建體來分別表達有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構建體。而且，克隆的序列可編碼具有二級結構(例如發夾)的構建體，即，載體的單一轉錄物同時包含靶基因的有義序列和互補反義序列二者。也可以配置本發明的載體使得其實現在靶細胞的基因組中的穩定插入(關于同源重組盒載體的說明，參見Thomas KR&Capecchi MR7Cell 1987,51:503-12)。可以參考例如=Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ;美國專利第 5，580，859 號、第 5，589，466 號、第 5，804，566 號、第 5，739，118 號、第 5，736，524 號、第 5，679，647 號和 WO 98/04720。基于 DNA的輸送技術的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導型) 輸送、陽離子脂質復合體、和粒子介導型投遞(“基因槍”)或壓力介導型輸送(例如參照美國專利第5，922，687號)。本發明的載體包括，例如，病毒載體或細菌載體。表達載體的例子包括牛痘或雞痘等減毒病毒宿主(參照美國專利第4，722，848號)。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來表達編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導入表達靶基因的細胞時即表達該分子并由此抑制細胞的增殖。可使用的載體的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG載體在 Stover等，Nature 1991, 351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈分子的治療性施用與生產，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等。可以參照例如Shata等，Mol Med Today 2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ;以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。使用本發明雙鏈分子抑制或降低癌細胞生長及治療癌癥的方法:在本發明中，測試針對ERCC6L的dsRNA抑制細胞生長的能力。針對ERCC6L的 dsRNA(圖2B，C)有效敲低了該基因在數種癌細胞系中的表達，這與對細胞增殖的阻抑一致。因而，本發明提供了抑制癌細胞生長的方法，所述方法通過抑制ERCC6L的表達來誘導ERCC6L基因的功能障礙。ERCC6L基因表達可通過任何上文所述特異性靶向ERCC6L基因的本發明雙鏈分子來抑制。上述本發明雙鏈分子及載體抑制癌性細胞的細胞生長的能力提示其可用于治療癌癥，諸如肺癌的方法。因此，發明提供通過施用針對ERCC6L基因的雙鏈分子或表達所述分子的載體來治療罹患癌癥患者而無不良作用的方法，因為正常器官中幾乎檢測不到 ERCC6L 基因(圖 1C)。本發明中特別感興趣的是下列[I]至[32]的方法[I] 一種用于抑制癌細胞生長或治療癌癥的方法，其中所述癌細胞或癌癥表達至少一種ERCC6L基因，該方法包括施用至少一種抑制過表達ERCC6L基因的細胞中該基因表達和細胞增殖的分離的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體的步驟，其中該雙鏈分子包含有義鏈及其互補反義鏈，它們彼此雜交以形成該雙鏈分子；[2] [I]的方法，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與靶序列SEQ ID NO 7或8匹配；[3] [2]的方法，其中有義鏈包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應的序列；[4] [I]的方法，其中要治療的癌癥是肺癌；[5] [3]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸對；[6] [5]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸對；[7] [6]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸對；[8] [7]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸對；[9] [8]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度為大約19個至大約25個核苷酸對；[10] [I]的方法，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[11] [10]的方法，其中所述雙鏈分子具有通式5' _[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補的序列的反義鏈；[12] [I]的方法，其中所述雙鏈分子是RNA ；[13] [I]的方法，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[14] [13]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[15] [14]的方法，其中所述有義與反義鏈多核苷酸分別由DNA與RNA構成；[16] [13]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[17] [16]的方法，其中反義鏈3’端側翼的區域由RNA構成，或者有義鏈5’端側翼的區域與反義鏈3’端側翼的區域均由RNA構成；[18] [17]的方法，其中所述側翼區域由9到13個核苷酸組成；[19] [I]的方法，其中所述雙鏈分子包含3’突出端；[20] [I]的方法，其中所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉染增強劑和可藥用的擔載體。[21] [I]的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[22] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與革巴序列SEQ ID NO :7或8匹配；[23] [22]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與選自SEQ ID NO 7和8的靶序列對應的序列；[24] [23]的方法，其中要治療的癌癥是肺癌；[25] [23]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸對；[26] [25]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷 酸對；[27] [26]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷 酸對；[28] [27]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷 酸對；[29] [28]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度為大約19個至大約 25個核苷酸對；[30] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由單一多核苷酸構成，所 述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[31] [30]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子具有通式 5' -[A]-[B]-[A/ ]-3/，其中，[A]為包含與靶序列SEQ ID N0 :7或8對應的序列的有義 鏈，[B]為由3個至23個核苷酸構成的間插單鏈，[A']為包含與靶序列互補的序列的反 乂鏈；[32] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組 合物除所述分子外還包括轉染增強劑和可藥用的擔載體。本發明方法將在下面更加詳細的加以描述。可通過將細胞與針對ERCC6L基因的雙鏈分子、表達該分子的載體或包含同樣分 子的組合物接觸來抑制表達ERCC6L基因的細胞的生長。可進一步將所述細胞與轉染劑接 觸。合適的轉染劑在本領域是已知的。短語“抑制細胞生長”表示所述細胞較之未暴露于 所述分子的細胞，以較低速率增殖或具有降低的存活力。細胞生長可通過本領域已知技術 測定，例如使用MTT細胞增殖測定。任何種類的細胞的生長均可根據本方法進行阻抑，只要 所述細胞表達或過表達本發明所述雙鏈分子的靶基因。可作為例子的細胞包括肺癌細胞。因此，對于正罹患或有風險發生與ERCC6L有關的疾病的患者，可通過施用本發明 的雙鏈分子、表達所述分子的至少一種載體或包含所述分子的組合物進行治療。舉例而言， 罹患癌癥的患者可根據本發明的方法進行治療。癌癥類型可通過根據所診斷的特定類型腫 瘤的標準方法來進行鑒定。更優選地，用本發明所述方法治療的患者是用這樣的方法選出 的在來自患者的活檢中通過RT-PCR或免疫測定法檢測ERCC6L的表達。優選地，在本發明 的治療之前，對于來自受試者的所述活檢標本通過本領域所知的方法，例如，免疫組織化學 分析或RT-PCR，證實ERCC6L基因的過表達。根據本發明的方法，為抑制細胞生長并藉此治療癌癥，通過施用多種所述雙鏈分 子(或表達多種所述雙鏈分子的載體或含有多種所述雙鏈分子的組合物)，每個所述分子 可具有不同結構，但作用于與相同ERCC6L靶序列匹配的mRNA。或者，多種雙鏈分子可作用 于與相同基因的不同靶序列匹配的mRNA。或者，例如，本方法可利用針對ERCC6L的一種、兩 種或更多種靶序列的雙鏈分子。為抑制細胞生長，本發明的雙鏈分子可直接以可實現該分子與對應mRNA轉錄物 結合的形式導入細胞。另外，如上所述，編碼雙鏈分子的DNA可作為載體導入細胞。為 將雙鏈分子和載體導入細胞，可使用轉染增強劑，例如FuGENE (Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)與 Nucleofector (Wako pure Chemical)。當治療導致臨床效益，諸如ERCC6L基因表達的減少、受試者中癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、或轉移潛力的降低，可以認為該治療是“有效”的。當預防性地適用治療時，“有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性結合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來加以確定。就本發明的方法和組合物可用于“預防”和“防范”的背景而言，此類術語在本文中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發病率負擔的任何活動。預防和防范可發生于 “一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病的進展與癥狀的出現、以及通過恢復功能和減輕疾病相關并發癥來降低已建立的疾病的負面影響的活動。或者，預防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴重性(例如降低腫瘤的增殖和轉移等)的廣泛的預防性療法。治療和/或預防癌癥和/或預防其手術后復發包括任何下述步驟，諸如手術去除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和阻抑癌癥發生、腫瘤消退、及降低或抑制轉移。癌癥的有效治療和/或預防可降低患癌個體死亡率及改善其預后，降低其血液中腫瘤標志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構成有效治療和/或預防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩定。應理解，本發明的所述雙鏈分子降解亞化學計量的ERCC6L mRNA。雖不愿拘于任何理論，認為本發明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規的癌癥療法相比，本發明中為實施治療效應而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領域技術人員在考慮了受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎上，能夠容易地確定本發明的雙鏈分子的有效量。一般而言，本發明雙鏈分子的有效量是在癌癥部位或其附近胞間濃度為大約I納摩爾(nM)到約ΙΟΟηΜ，優選大約2nM到大約50nM，更優選大約2. 5nM到大約ΙΟηΜ。 考慮可使用更多或更少量的雙鏈分子。本領域一般技術人員可方便地及常規地確定特定情況下所需的確切劑量。本發明的方法可用于抑制表達ERCC6L基因的癌癥，例如肺癌的生長或轉移。具體而言，含有ERCC6L基因的靶序列(例如SEQ ID NO 7和8)的雙鏈分子特別優選用來治療癌癥。為了治療癌癥，還可以將本發明的雙鏈分子與不同于所述雙鏈分子的藥物組合物組合來施用于受試者。或者，本發明的雙鏈分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來施用于受試者。舉例而言，本發明所述雙鏈分子可與現在用于治療癌癥或預防癌癥轉移的治療方法(例如，放射療法，外科手術，以及使用化療劑，如順鉬、卡鉬、環磷酰胺、 5_氟尿喃唳、阿霉素、柔紅霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治療)組合施用。在本發明的方法中，雙鏈分子可以裸雙鏈分子的形式、以與投遞試劑相組合的形式，或者以表達雙鏈分子的重組質粒或者病毒載體的形式施用于受試者。用于與本發明的雙鏈分子組合施用的合適的投遞試劑包括Mirus Transit TKO親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚陽離子(例如聚賴氨酸)、或脂質體。一種優選的投遞試劑是脂質體。脂質體能夠幫助將雙鏈分子投遞至特定的組織如肺腫瘤組織中，還能夠增加雙鏈分子的血中半衰期。適合在本發明的背景中使用的脂質體可以是由常規的囊泡形成性脂質 (vesile-forming lipids)形成的,囊泡形成性脂質通常包括中性或帶負電荷的磷脂，以及甾醇，諸如膽固醇。對一些因素的考慮通常可以為脂質的選擇提供指導，如期望的脂質體大小以及在血流中的脂質體的半衰期等。有多種制備脂質體的方法是公知的，例如Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ;美國專利第 4，235，871 號；第 4，501，728 號；第 4，837，028號；第5，019，369號；將上述文獻的全部內容援引并入本說明書。優選地，封裝本發明的雙鏈分子的脂質體包含能夠將脂質體輸送至癌癥部位的配體分子。優選的配體是與腫瘤或血管內皮細胞中常見的受體結合的配體，例如與腫瘤抗原或內皮細胞表面抗原結合的單克隆抗體。特別優選地，封裝本發明的雙鏈分子的脂質體經過了修飾以免被單核巨噬細胞和網狀內皮系統清除，例如，由于其結構的表面結合有調理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一個實施方案中,本發明的脂質體可以同時包括調理作用抑制部分和配體。用于制備本發明的脂質體的調理作用抑制部分通常是與脂質體膜結合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當調理作用抑制部分化學地或物理地搭接在脂質體膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質的活性基團直接結合，則調理作用抑制部分與脂質體膜“結合”。這些調理作用抑制性親水性聚合物形成保護性表層，該表層顯著地減少巨噬-單核細胞系統(“MMS”)和網狀內皮系統(”RES”) 對脂質體的攝入；在例如美國專利第4，920，016號中對此有記載，后者的全部公開內容援引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質體相比，被調理作用抑制部分修飾過的脂質體能夠保留在血液循環中的時間顯著更長。出于以上理由，這樣的脂質體有時也被稱為“隱形”(stealth)脂質體。已知隱形脂質體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質體會高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的攝入的減少阻止隱形脂質體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質體的毒性。因此，用調理作用抑制部分修飾的本發明的脂質體能夠將本發明的雙鏈分子輸送至腫瘤細胞。適用于修飾脂質體的調理作用抑制部分優選為分子量約500 約40，000道爾頓、更優選約2,000 約20,000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine);聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols),諸如化學結合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經節苷脂，諸如神經節苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質酸、果膠酸、神經氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應而生成了羧基結合的羧基化多糖類或寡糖。優選地，調理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質體有時稱為“PEG化脂質體”。調理作用抑制部分可以通過許多公知技術中的任何一種結合到脂質體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨 (lipid-soluble anchor)結合,然后再結合到膜上。相似地,可以通過還原性氨基化,用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。上文討論了表達本發明的雙鏈分子的載體。這樣的表達至少一種本發明的雙鏈分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質體。將表達本發明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區域的方法在本技術領域的技術范圍內。本發明的雙鏈分子可以通過適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內施用途徑來施用。合適的腸內施用途徑包括口腔、直腸、或鼻內遞送。合適的非消化道施用途徑包括膀胱內和血管內施用(例如靜脈內推注、靜脈內輸注、動脈內推注、動脈內輸注和針對血管網絡的導管滴注)，組織周圍和組織內注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或其附近的區域，例如借助導管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。優選通過注射或輸注將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發明的雙鏈分子可以以單一劑量或分多個劑量來施用。當本發明的雙鏈分子的施用為輸注方式時，輸注可以是單個持續劑量，或者通過多次輸注來施用。優選的是將雙鏈分子直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優選的是將雙鏈分子多次注射到癌癥部位或其附近的組織中。本領域技術人員可以容易地確定用于對給定受試者施用本發明雙鏈分子的合適劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近。或者，雙鏈分子可以在約3 約28日、更優選約7 約10日的期間內每日一次或二次地施用給受試者。在優選的劑量方案中，雙鏈分子可以在7日期間內一日一次地注射到癌癥部位或其附近。當劑量方案要求多次施用時，應該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量，可以包含在整個劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。在本發明中，可以用至少一種選自下組的活性成分來治療過表達ERCC6L的癌癥(a)本發明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。所述癌癥包括但不限于肺癌。因而，在施用本發明的雙鏈分子作為活性成分之前， 優選確認要治療的癌細胞或組織中ERCC6L的表達水平是否與相同器官的正常細胞相比升
39高。如此，在一個實施方案中，本發明提供了一種治療(過)表達ERCC6L的癌癥的方法，該方法包括下列步驟i)檢測自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中ERCC6L的表達水平；ii)將所述ERCC6L表達水平與正常對照比較；并iii)對具有與正常對照相比過表達ERCC6L的癌癥的受試者施用至少一種選自下組的成分(a)本發明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。或者，本發明還提供了一種藥物組合物，其包含至少一種選自下組的成分，用于施用于具有過表達ERCC6L的癌癥的受試者(a)本發明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。換言之，本發明進一步提供了一種用于鑒定要用下述各項治療的受試者的方法(a)本發明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(C)編碼它們的載體，該方法可包括測定源自受試者的癌細胞或組織中ERCC6L的表達水平的步驟，其中所述水平與該基因正常對照相比的升高指示該受試者具有可治療的癌癥。下面會更加詳細地描述本發明治療癌癥的方法。要用本方法治療的受試者優選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據本發明，測定在自受試者獲得的癌細胞或組織中ERCC6L的表達水平。使用本領域已知方法，可在轉錄(核酸)產物水平上確定表達水平。舉例而言，ERCC6L的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。可在芯片或陣列上實施所述檢測。 對檢測ERCC6L的表達水平而言，優選使用陣列。本領域技術人員可利用ERCC6L的序列信息制備上述探針。舉例而言，ERCC6L的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標記，例如染料、熒光物質和同位素，且所述基因的表達水平可以作為發生了雜交的標記物的強度檢測。進一步，ERCC6L的轉錄產物(例如SEQ ID NO 9)可通過基于擴增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制備。 具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件或低嚴格條件下與ERCC6L的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件， 在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，而且在不同的環境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探針被占據。典型地，嚴格條件會是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約 O. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，對于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩定劑，例如甲酰胺，來實現。或者，可以檢測翻譯產物以進行本發明的診斷。例如，可以確定觀察到的蛋白(SEQ ID NO 10)的量。測定作為翻譯產物的蛋白量的方法包括免疫測定法，其使用特異識別所述蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測,只要該片段或經修飾抗體保留對ERCC6L 蛋白的結合能力即可。制備這些種類的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的， 并且在本發明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于ERCC6L的翻譯產物檢測ERCC6L基因表達水平的方法，可利用針對ERCC6L蛋白的抗體通過免疫組織化學分析測量染色的強度。意即，在此測量中，強染色表明所述蛋白質的存在/水平增加，且同時表明ERCC6L基因的高表達水平。對于靶基因(例如ERCC6L基因)在癌細胞中的表達水平而言，如果該水平較之靶基因的對照水平(例如在正常細胞中的水平)增加了例如10%、25%或50%，或增加到超過I. I倍、超過I. 5倍、超過2. O倍、超過5. O倍、超過10. O倍或者更多的話，可以確定該水平是增加的。對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區獲得的正常細胞可用作正常對照。或者，對照水平可以借助統計方法，基于通過分析先前測定的來自疾病狀態已知的受試者的樣品的ERCC6L基因表達水平獲得的結果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達樣式數據庫。而且，根據本發明的一個方面，可以將生物樣品中ERCC6L基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優選地使用從來自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優選地，使用具有已知的疾病狀態的群體中ERCC6L基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如,平均值±2S. D.或平均值±3S. D.的范圍可以用作標準值。在本發明的背景中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，若對照水平從癌性生物樣品確定，則它稱作“癌性對照水平”。若ERCC6L基因的表達水平相比于正常對照水平提高了或與癌性對照水平相似/ 等同，則可診斷受試者為具有要治療的癌癥。包含本發明雙鏈分子的組合物:除上述外，本發明亦提供了包含本發明的雙鏈分子或編碼該分子的載體的藥物組合物。本發明中特別感興趣的是下述[I]至[32]的組合物[I] 一種用于抑制癌細胞生長或治療癌癥的組合物，其中所述癌癥和癌細胞表達 ERCC6L基因，該組合物包括至少一種抑制ERCC6L基因表達和細胞增殖的分離的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，且其中該分子包含有義鏈及其互補反義鏈，它們彼此雜交以形成該雙鏈分子；
[2] [I]中的組合物，其中所述雙鏈分子作用于mRNA，所述mRNA與靶序列SEQ ID NO :7或8匹配；[3] [2]的組合物，其中所述雙鏈分子，其中有義鏈包含與靶序列SEQ ID NO :7或8 相應的序列。[4] [I]的組合物，其中要治療的癌癥是肺癌；[5] [3]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸對；[6] [5]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸對；[7] [6]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸對；[8] [7]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸對；[9] [8]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度為大約19個到大約25個核苷酸對；[10] [I]的組合物，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[11] [10]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A/ ]_3'，其中， [A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應的序列的有義鏈序列，[B]為由3個 23個核苷酸構成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補的序列的反義鏈；
體；
RNA組成[I]的組合物，其中所述雙鏈分子是RNA ;[I]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA和/或RNA ；[13]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合[14]的組合物，其中所述有義鏈多核苷酸與反義鏈多核苷酸分別由DNA與[13]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[14]的組合物，其中反義鏈3’端側翼的區域由RNA組成，或者有義鏈5’端側翼的區域與反義鏈3’端側翼的區域均由RNA組成；[18] [17]的組合物，其中所述側翼區域由9到13個核苷酸組成；[19] [I]的組合物，其中所述雙鏈分子包含3’突出端；[20] [I]的組合物，其中所述組合物包括轉染增強劑和可藥用的擔載體。[21] [I]的組合物，其中所述雙鏈分子由載體編碼并包含于組合物中；[22] [21]中的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子作用于mRNA，所述 mRNA與靶序列SEQ ID NO :7或8匹配；[23] [22]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與靶序列 SEQ ID NO :7或8相應的序列；[24] [21]至[23]任一的組合物，其中要治療的癌癥是肺癌；[25] [23]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約100個核苷
[26] [25]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[27] [26]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[28] [27]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[29] [28]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度為大約19個至大約25 個核苷酸；[30] [21]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由單一多核苷酸構成， 所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈二者；[31] [30]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構成的間插單鏈，[A']為包含與靶序列互補的序列的反義鏈；和[32] [21]的組合物，其中所述組合物包含轉染增強劑和可藥用的擔載體。本發明合適的組合物將在下面更加詳述地加以描述。本發明的所述雙鏈分子優選在施用于受試者之前根據本領域眾所周知的技術配制為藥物組合物。本發明的藥物組合物特征為至少是無菌且不含熱原的。本文中所使用的“藥物組合物”包括適用于人類與獸醫用的組合物。制備本發明藥物組合物的方法屬于本領域一般技術，例如，描述于 Remington’ s Pharmaceutical Science, 17th ed. ，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公開內容通過引用包含于本文中。本發明的藥物組合物包含本發明的雙鏈分子或編碼它的載體(例如，以重量計為 0. 到90% )，或所述分子的可藥用鹽，與生理上可接受的載體介質混合。制藥學上可接受的載體介質優選水、緩沖水、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質酸及類似物。根據本發明，所述組合物可包含多種雙鏈分子，其中每一種分子可針對相同靶序列或ERCC6L的不同靶序列。舉例而言，所述組合物可包含針對ERCC6L的雙鏈分子。或者， 例如，所述組合物可包含針對ERCC6L的一種、兩種或更多種靶序列的雙鏈分子。而且，本組合物可以包含編碼1個或多個雙鏈分子的載體。例如，所述載體可以編碼1種、2種或數種本雙鏈分子。或者，本組合物可以包含多種載體，而各載體編碼不同的雙鏈分子。而且，本雙鏈分子可以作為脂質體的形式包含在本組合物中。脂質體的詳細內容可以參照題為“使用雙鏈分子治療癌癥的方法”的小節。本發明的藥物組合物中還可以包含傳統的藥用賦形劑和/或添加劑。合適的藥用賦形劑包括穩定化劑、抗氧化劑、浸透壓調節劑、緩沖劑、和PH調節劑。合適的添加劑包括 生理學生物相容性的緩沖劑(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補加螯合劑(例如DTPA或DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地，補加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發明的藥物組合物可以進行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。對于固體組合物，可以使用常規的無毒固態載體；例如，藥物級的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、 碳酸鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物中可以包含上述列舉的任意載體和賦形劑，以及10-95%，優選25-75%的本發明的一種或多種雙鏈分子。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可以包含0.01-20重量％、優選1-10重量％的包被于上述脂質體中的一種或多種本發明的雙鏈分子，以及推進劑。還可以根據需要包含載體，例如用于鼻內投遞的卵磷脂等。除上述之外，本組合物中還可以包含其它藥學活性成分，只要它們不抑制本發明雙鏈分子的體內功能。例如，上述組合物中可以包含常規用于癌癥治療的化療藥物。在另一個實施方案中，本發明提供本發明的雙鏈核酸分子在制備用于治療以表達ERCC6L基因為特征的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發明涉及下述雙鏈核酸分子在制備用于治療表達ERCC6L基因的癌癥的藥物組合物中的用途該分子在細胞內抑制 ERCC6L基因的表達，且該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以序列SEQ ID NO :7或8為靶標。本發明進一步提供在治療表達ERCC6L基因的癌癥中使用的本發明雙鏈核酸分子。或者，本發明還提供生產用于治療以表達ERCC6L基因為特征的癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將藥學或者生理學可接受的載體與作為活性成分的下述雙鏈核酸分子一起制劑化的步驟，其中所述雙鏈核酸分子抑制過表達ERCC6L基因的細胞內該基因的表達，且該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以序列SEQ ID NO :7或8為靶標。在另一個實施方案中，本發明提供生產用于治療以表達ERCC6L基因為特征的癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法或工藝包括將活性成分與藥學上或生理學上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是這樣的雙鏈核酸分子，其在過表達ERCC6L 基因的細胞中抑制ERCC6L的表達，該分子包含有義鏈與與其互補的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以序列SEQ ID NO :7或8為靶標。下面，本發明將參考實施例進行更加詳細的介紹。然而，下面的材料、方法和實施例僅僅是舉例說明本發明的多個方面，并不意圖對本發明的范圍進行限制。因此，與這里所述相似或等價的方法和材料也可以用于實施或測試本發明。除非特別定義，否則這里使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域普通技術人員所共同理解的相同的意思。下面描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實踐或測試本發明。本文通過提述并入本文中提及的所有出版物、專利申請、專利及其他參考文獻的全部內容。如果有沖突，當以本說明書包括定義在內為準。此外，所述材料、方法和實施例均只是例示的目的，而不意在構成限制。
實施例本發明將于下列實施例中進一步加以描述，其并不對權利要求中描述的本發明范圍進行限定。實施例1 通用方法肺癌細胞系和組織樣品。此項研究中使用的人肺癌細胞系如下肺腺癌A427，NCI-H1781, AM9，和LC319 ； 肺鱗狀細胞癌(SCC) NCI-H226，EBC-I, NCI-H520，和 NCI-H2170 ；和 SCLC DMS114, DMS273, SBC-3，SBC-5, H196，和H446。所有細胞在補充有10% FCS的適宜培養基中以單層培養并在含5% CO2的增濕空氣的氣氛中于37°C維持。人小氣道上皮細胞(SAEC)在購自Cambrex Bio Science, Inc的經過優化的培養基中培養。原發性肺癌組織樣品在知情同意下獲得， 如先前所述(Kikuchi T, et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205. , Taniwaki M et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75.)。此項研究和所有臨床材料的使用得到了各個科研倫理委員會批準。半定量逆轉錄-PCR。使用該TRIzol試劑(Life Technologies, Inc.)依照制造商的方案自培養的細胞提取總RNA。用DNA酶I (Nippon Gene)處理提取的RNA并使用寡(dT)引物和 superscript II進行逆轉錄。用下述合成ERCC6L特異性引物或作為內部對照的β -肌動蛋白(ACTB)特異性引物進行半定量逆轉錄-PCR(RT-PCR)實驗ERCC6L，5，-AAAAATCCAG GAGGCCCTAA-3'(SEQ ID NO 1)和 5，-AGATCTTTCTTGCCTTAAGCCTG-3，(SEQ ID NO 2) ；ACTB, 5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQ ID NO :4)。優化PCR反應循環數以確保產物強度在擴增的線性期內。Northern 印跡分析。將人多組織印跡(BD Biosciences Clontech)與ERCC6L的32P標記的PCR產物雜交。使用上文所述引物通過RT-PCR制備ERCC6L的cDNA探針。預雜交、雜交、和清洗依照供應商的推薦進行。將印跡于室溫用增強BAS屏(Bio-Rad)放射自顯影30小時。免疫熒光分析。將細胞涂布在玻璃蓋玻片(Becton Dickinson Labware)上，用4%低聚甲醛固定，并通過用含0.1 ^Triton X-100的PBS于室溫處理3分鐘使得其可通透。用 CASBL0CK(ZYMED)于室溫封閉非特異性結合10分鐘。然后把細胞與作為一抗的在含有3% BSA的PBS中稀釋的小鼠單克隆抗myc抗體一起于室溫溫育60分鐘。用PBS清洗后，細胞用 Alexa Fluor 488綴合的二抗(Molecular Probes)于室溫染色60分鐘。再次用PBS清洗后，每個標本用含有4’，6’ -二脒-2’ -苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的Vectashield(Vector Laboratories, Inc.)豸固并用 Spectral Confocal Scanning Systems (TSC SP2A0BS Leica Microsystems)顯現。RNA干擾測定法。本發明人先前建立了基于載體的RNA干擾系統，psiHlBX3.0，其設計成在哺乳動物細胞中合成小干擾 RNA(siRNA) (Suzuki C et al. Cancer Res2003 ;63 :7038-41.)。使用30微升LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)將10微克siRNA表達載體轉染入肺癌細胞系SBC-5中。將經過轉染的細胞在適宜濃度的遺傳霉素(G418)存在下培養7天；通過吉姆薩染色對集落數目計數；并在處理后7天通過溴化3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2， 5-二苯基四唑測定法評估細胞存活力。簡言之，將細胞計數試劑盒-8溶液(Doiindo) 以1/10體積的濃度添加至每個盤，并將平板于37°C再溫育2小時。然后用Microplate Reader 550 (Bio-Rad)測量490nm的和作為參照的630nm的吸光度。為了確認對ERCC6L mRNA表達的阻抑，依照標準方案用下述合成ERCC6L特異性引物進行半定量RT-PCR實驗。 用于RNA干擾的合成寡核苷酸的靶序列如下對照1 (螢光素酶/LUC 螢火蟲(W1Otinus pyralis)螢光素酶基因)，5，-CGTACGCGGAATACTTCGA-3，(SEQ ID NO 5)；對照 2(EGFP:基因，水母(Aequorea victoria)GFP 的突變體)，5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQ ID N0:6) ;siRNA-ERCC6L-#A，5，-CTGCACAACCAACTCTTTG-3，(SEQ ID NO 7) ；siRNA_ERCC6L_#B， 5，-ATGTTAATCAATAACTGGC-3，(SEQ ID NO :8)。Western 印跡。細胞用含有蛋白酶抑制劑混合物組III (Calbiochem)的放射免疫沉淀測定緩沖液[50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0), 150mmol/L NaCl，1 % NP40，0· 5%脫氧膽酸鈉，0· 1 % SDS] 裂解。將蛋白質樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠來分開并電印跡到Hybond-ECL硝酸纖維素膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上。將印跡與小鼠單克隆抗myc抗體一起溫育。使用綴合有辣根過氧化物酶的二抗(GE Healthcare Bio-Sciences)來檢測抗原-抗體復合物。 通過增強型化學發光Astern印跡檢測試劑(GE Healthcare Bio-Sciences)來顯現蛋白質條帶。細胞生長測定。將ERCC6L的完整編碼序列克隆入pcDNA3. Imyc-His質粒載體(Invitrogen)的適宜位點。將用表達帶myc-His標簽的ERCC6L的質粒或用模擬質粒轉染的C0S-7細胞在含有10% FCS的DMEM中在適宜濃度的遺傳霉素(G418)存在下培養8天。通過MTT測定來評價細胞存活力；簡言之，將細胞計數試劑盒-8溶液(D0JIND0)以1/10體積的濃度添加至每個盤，并將平板于37°C再溫育12小時。然后用Microplate Reader 550 (BIO-RAD)測量作為參照的450nm的吸光度。實施例2 肺腫瘤和正常組織中的ERCC6L表達。為了搜索用于開發肺癌的治療劑和/或診斷性生物標志物的新靶分子，首先通過cDNA微陣列分析篩選在101份肺癌樣品的過半數中顯示3倍或更高的表達水平的基因(Daigo Y, et al. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53. ；Kikuchi T, et al.Oncogene 2003 ；22 :2192-205. ；Kakiuchi S，et al. Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99.； Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004 ； 13 :3029-43. ；Kikuchi Τ, et al. Int J Oncol 2006；28 :799-805. ；Taniwaki Μ, et al. Int J 0ncol2006 ；29 :567-75.)。在篩選的27，648種基因中，在絕大多數檢查的肺癌中鑒定出ERCC6L過表達，并通過半定量RT-PCR實驗確認了它在10/15份另外的肺癌組織中和13/14種肺癌細胞系中的的反式激活(圖IA和IB)。Northern印跡分析顯示了 ERCC6L在正常組織中不表達，但是在肺癌細胞系中強表達(圖1C)。實施了免疫熒光分析來檢查外源ERCC6L在C0S-7細胞中的亞細胞定位。ERCC6L主要在細胞質中檢測到，而在細胞核中微弱檢出(圖1D)。實施例3 針對ERCC6L的siRNA對肺癌細胞生長的抑制。為了評估ERCC6L對于肺癌細胞的生長或存活是否是必需的，構建了表達針對 ERCC6L的siRNA的質粒(si_ERCC6L-#A和-#B)以及對照質粒(用于螢光素酶(LUC)和 EGFP的siRNA)并將它們轉染入強表達ERCC6L的SBC-5和A549細胞中。用si_ERCC6L_#A 或_#B轉染的細胞中的ERCC6L-mRNA水平與用任一對照siRNA轉染的細胞相比顯著降低 (圖2A)。觀察到可存活細胞數的顯著降低(圖2B和2C)。實施例4 :ERCC6L的生長促進效應。為了披露ERCC6L在腫瘤發生中的潛在作用，制備了設計成表達ERCC6L的質粒 (pcDNA3. 1/myc-His A載體)或模擬載體來測定ERCC6L對哺乳動物細胞生長的影響，使用幾乎不表達內源ERCC6L的C0S-7細胞生成了瞬時轉染子。瞬時表達外源ERCC6L的細胞揭示了與模擬轉染的細胞相比顯著的生長促進(圖3A和3B)。討論近來，用于癌癥治療的新分子靶的鑒定和表征的加快使相當大的興趣聚焦于新型抗癌劑的開發(Daigo Y, et al. Gen Thorac Cardiovasc Surg2008 ；56 :43-53. ；Kikuchi T, et al.Oncogene 2003；22 :2192-205. ；Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003 ； 1 485-99. ；Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet2004 ； 13 :3029-43. ；Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006 ；28 :799-805. ；Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75.)。迄今，眾多靶向療法正在對肺癌進行調查，但是有響應的腫瘤類型的范圍以及治療的有效性仍然非常有限。由于它的作用機制明確，分子靶向性藥物預期對惡性細胞具有高度的特異性，而且不良效應最低。作為針對該目的的一種途徑，一種有希望的策略是將在癌細胞中過表達的有效鑒定基因的基因組范圍表達分析的力量與借助RNAi技術的功能喪失效應高通量篩選結合起來(Suzuki C, et al. Cancer Res 2003 ；63 :7038-41.； Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004 ； 10 :8363-70. ；Kato Τ, et al. Cancer Res 2005 ；65 :5638-46. ；Furukawa C, et al. Cancer Res 2005 ；65 :7102-10. ；Ishikawa N, et al.Cancer Res2005 ；65 :9176-84. ；Suzuki C, et al. Cancer Res 2005 ；65 :11314-25.； Ishikawa N, et al.Cancer Sci 2006 ；97 :737-45. ；Takahashi K, et al.Cancer Res2006 ； 66 :9408-19. ；Hayama S, et al. Cancer Res 2006 ；66 :10339-48.)。使用這種組合手段，已經證明ERCC6L在臨床肺癌癥樣品和細胞系中頻繁過表達， 且其基因產物在肺癌細胞的生長和進展中發揮不可缺少的作用。在本發明中，用特異性SiRNA處理肺癌細胞以敲低ERCC6L表達，導致對癌細胞生長的阻抑。本發明人還顯示了別的證據來支持這種途徑在癌發生中的意義；例如，在體外， ERCC6L的表達導致對細胞生長的顯著促進。獲得的結果強烈提示ERCC6L有可能是肺癌細胞的重要生長因子，盡管許多癌細胞中ERCC6L表達水平升高背后的分子機制仍然有待澄清。因為ERCC6L應當歸類為癌癥特異性抗原之一，所以通過分子靶向劑選擇性抑制ERCC6L 活性將會是一種有希望的治療策略，預期其可具有強的抗癌癥生物學活性，并且不良事件的風險最低。總之，ERCC6L的激活對癌細胞的生長具有特異性的功能作用。數據強烈暗示設計特異性靶向ERCC6L的致瘤活性的新抗癌藥物用于治療肺癌患者的可能性。工業應用性本文中提供的數據增加對癌癥的綜合理解，便于開發新穎診斷策略，并為鑒定治療藥和預防劑的分子靶提供線索。此類信息有助于更加深刻地理解腫瘤發生，并為開發用于診斷、治療、和最終預防癌癥的新穎策略提供指標。特別地，本文中描述的使用激光捕捉解剖和基因組范圍cDNA微陣列的組合的癌癥的基因表達分析鑒定出ERCC6L為在癌癥中與正常器官相比顯著升高的基因。因此，它可用于癌癥預防和治療的背景。例如，鑒于它的差異表達，ERCC6L可方便地作為分子診斷標志物用于鑒定和檢測癌癥，特別是肺癌。因而，ERCC6L基因及由其編碼的蛋白可用于癌癥的診斷試劑盒和測定法。本發明進一步證明細胞生長可受到特異性靶向ERCC6L基因的雙鏈核酸分子阻抑。因此，該雙鏈核酸分子可用于開發抗癌藥物。另外，ERCC6L多肽是用于開發抗癌藥物的有用靶標。例如，阻斷ERCC6L蛋白的表達或阻止其活性的物質可在治療上用作抗癌劑， 特別是用于治療肺癌的抗癌劑。通過述及將本文中引用的所有出版物、數據庫、序列、專利、和專利申請收入本文。雖然已經詳細地且參照其具體實施方案描述本發明，要理解，前面的描述在性質上是例示性的和解釋性的，而且意圖例示本發明及其優選實施方案。通過常規實驗，本領域技術人員會容易地認識到可以在其中進行各種改變和修改，不偏離本發明的精神和范圍。 如此，本發明意圖不受上文描述限定，而是由所附權利要求及其等同方案限定。
權利要求
1.一種在受試者中檢測或診斷癌癥或發生癌癥的傾向性的方法，包括測定源自受試者的生物樣品中ERCC6L基因的表達水平的步驟，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示所述受試者罹患或有風險發生癌癥，其中該表達水平是通過選自下組的任何一種方法測定的(a)檢測ERCC6L基因的mRNA；(b)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質；和(c)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質的生物學活性。
2.權利要求I的方法，其中所述升高比所述正常對照水平高至少10%。
3.權利要求I的方法，其中所述源自受試者的生物樣品為活檢樣品。
4.權利要求I的方法，其中所述癌癥為肺癌。
5.一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包含選自下組的試劑(a)用于檢測ERCC6L基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質的試劑；和(c)用于檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質的生物學活性的試劑。
6.權利要求5的試劑盒，其中該試劑為針對ERCC6L的基因轉錄物的探針或引物組，或針對由ERCC6L基因編碼的蛋白質的抗體。
7.一種篩選用于治療和/或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選物質的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與ERCC6L多肽或其片段接觸；(b)檢測該多肽或該片段和該測試物質之間的結合活性；并(c)選擇結合該多肽或該片段的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。
8.一種篩選用于治療和/或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選物質的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與表達ERCC6L基因的細胞接觸；(b)檢測步驟(a)的細胞中ERCC6L基因的表達水平；并(c)選擇與在該測試物質不存在時檢測到的ERCC6L基因的表達水平相比降低步驟(b) 中檢測到的表達水平的測試物質。
9.一種篩選用于治療和/或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選物質的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與ERCC6L多肽或其片段接觸；(b)檢測步驟(a)的該多肽或該片段的生物學活性；并(C)選擇與在該測試物質不存在時檢測到的生物學活性相比阻抑步驟(b)中檢測到的該多肽或該片段的生物學活性的測試物質。
10.權利要求9的方法，其中該生物學活性為細胞增殖活性。
11.一種篩選用于治療和/或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選物質的方法，所述方法包括下述步驟a)使測試物質與其中導入有載體的細胞接觸，該載體包含ERCC6L基因的轉錄調節區和在該轉錄調節區控制下表達的報告基因，b)測量步驟(a)中所述報告基因的表達或活性；并c)選擇與在該測試物質不存在時的表達和/或活性水平相比降低步驟(b)中檢測到的所述報告基因的表達和/或活性水平的物質。
12.權利要求7、8、9和11中任一項的方法，其中所述癌癥為肺癌。
13.一種分離的雙鏈分子，其包含有義鏈及與之互補的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子，其中該有義鏈包含與選自SEQ ID NO 7和8的靶序列對應的核苷酸序列，且其中所述雙鏈分子在導入表達ERCC6L基因的細胞中時抑制該基因的表達以及細胞增殖。
14.權利要求13的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈在所述靶序列處雜交以形成該雙鏈分子，該雙鏈分子的長度為19-25個堿基對。
15.權利要求13的雙鏈分子，其中該雙鏈分子在所述有義鏈和/或所述反義鏈的3’端具有一個或兩個3’突出端。
16.權利要求13的雙鏈分子,其中所述雙鏈分子為單一多核苷酸,該單一多核苷酸包含經由單鏈核苷酸序列連接的所述有義鏈和所述反義鏈。
17.權利要求16的雙鏈分子，其中所述多核苷酸具有通式5’-[幻-[8]-[么’]-3’，其中 [A]為有義鏈；[B]為由約3至約23個核苷酸組成的核苷酸序列；且[A’ ]為反義鏈。
18.權利要求17的雙鏈分子，其中[A]包含與選自SEQID NO 7和8的核苷酸序列對應的核苷酸序列。
19.一種載體，其編碼權利要求13至18中任一項的雙鏈分子。
20.一種在受試者中治療和/或預防癌癥的方法，所述方法包括對所述受試者施用藥學有效量的針對ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體、以及可藥用的擔載體的步驟，其中該雙鏈分子在導入表達ERCC6L基因的細胞中時抑制ERCC6L基因的表達以及細胞增殖。
21.權利要求20的方法，其中該雙鏈分子為權利要求13的雙鏈分子。
22.權利要求20的方法，其中該載體為權利要求19的載體。
23.權利要求20的方法，其中要治療的癌癥為肺癌。
24.一種用于治療和/或預防癌癥的組合物，所述組合物包含藥學有效量的針對 ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，以及可藥用的擔載體，其中該雙鏈分子在導入表達ERCC6L基因的細胞中時抑制ERCC6L基因的表達以及細胞增殖。
25.權利要求24的組合物，其中該雙鏈分子為權利要求13的雙鏈分子。
26.權利要求24的組合物，其中所述載體為權利要求19的載體。
27.權利要求24的組合物，其中要治療的癌癥為肺癌。
全文摘要
本文中描述用于診斷癌癥，特別是肺癌發生傾向性的客觀方法。本發明提供利用ERCC6L的表達水平作為癌癥的指標的診斷方法。本發明進一步提供篩選可用于治療ERCC6L相關疾病，諸如癌癥，例如肺癌的治療性物質的方法。本發明進一步提供抑制細胞生長和治療或緩解ERCC6L相關疾病的一種或多種癥狀的方法。本發明的特征還在于雙鏈分子，以及含有該雙鏈分子的載體和組合物。
文檔編號C12N15/113GK102597236SQ20108004821
公開日2012年7月18日 申請日期2010年8月24日 優先權日2009年8月25日
發明者中村佑輔, 角田卓也, 醍醐彌太郎 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司