一種生物法制備可可堿的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物藥物技術領域，尤其涉及一種生物法制備可可堿的方法。
【背景技術】
[0002] 可可喊（Theobromine ;3, 7-Dimethylxanthine)為甲基黃噪呤類生物喊，別名： 3, 7-二甲基黃嘌呤。化學名稱：3, 7-二氫-3, 7-二甲基-1H-嘌呤-2, 6-二酮。存在于可 可樹和巧克力中。同屬這一類的還有茶堿和咖啡因。白色單斜形針狀結晶性粉末。微溶于 水、中度溶于胺，不溶于苯、醚、四氯化碳和氯仿。溶于堿、濃酸和20%堿式磷酸鈉水溶液。 與咖啡因的區別在于1位是否甲基化。可可堿具有較強和持久的利尿作用，有較強的擴張 冠狀動脈、興奮心肌及松弛氣管平滑肌的作用，對中樞的興奮作用較弱。對橫紋肌有直接 作用，具有增高肌肉的興奮性，增強骨骼肌的機能。可可堿在國內主要作為復方制劑銷售， 可以制成止咳平喘類藥物：復方茶堿片和肺寶三效片，其中復方茶堿片所占份額最大。
[0003] 可可堿的主要功效體現在以下幾個方面：1、強效的減肥原料。2、磷酸二酯酶抑制 劑，弱腺苷受體拮抗劑，平滑肌松弛劑。3、利尿、心肌興奮、血管舒張、平滑肌松弛等作用。
[0004] 可可堿的生產方法主要是化學法。如下所述：1、一甲脲法生產可可堿：主要涉及 到縮合、環合等多個步驟的全化學合成反應，會有甲基黃嘌呤以及丙酮等副產物產生。反應 過程中廢水排放量高，環保壓力巨大。化學反應步驟較多，其中縮合、環合、亞化收率約為 75%，還原、酰化閉環收率為75%，甲化收率75%，精制收率為85%。該方法為目前可可堿 生產主流方法，成本較高。2、咖啡因法生產可可堿：以咖啡因為底物生產可可堿的方法涉及 到2步化學開環反應，中間產物生成咖啡啶（油狀），會有分層現象。最終產物中有一定數 量的咖啡因污染到產物可可堿中去，需要再次分離等步驟。此方法毒性大，成本高，收率為 48%〇
[0005] 目前國內外關于生物法、酶法合成可可堿的相關報道很少。CN1088259A公開了從 假單胞菌菌中分離出來的一段具有咖啡因脫甲基化酶的DNA片段。通過將該片段中編碼 的基因在重新轉化回敲除該基因的原始假單胞菌的方法來驗證其脫甲基酶活性。但是未 表明此條基因在大腸桿菌表達系統中表達與活性情況。CN1495261A公開了一種咖啡因生 物合成體系基因組的聯合利用，其要求保護一種生產7-甲基黃嘌呤、可可堿或咖啡因的方 法，該方法保護一種由黃嘌呤底物基因串聯合成可可堿以及咖啡因的方法。2012年Ryan M. Summers等從實驗室分離的P. putida CBB5菌株中克隆到一系列的黃噪呤代謝途徑相關 基因，并初步對其表達活性進行研究，隨后申請專利。CN1143115A公開了一種生產3-甲 基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法，其要求保護生產由式（II)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌 呤的方法，該方法包括在含有由式（I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營養培養基中 培養用重組DNA轉化的宿主的假單胞菌屬轉化體，以培養物中產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤 并從培養物中回收所產生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
[0006] 酶法合成可可堿理論可行，但由于咖啡因脫甲基化酶的特殊反應需求：其需要耦 合專一配對的還原酶對其進行供氫研究并大量消耗輔酶NADH，作為單加氧酶是需要氧氣參 與反應。去甲基化酶與還原酶含有一個或多個Fe-S中心簇，常規分離表達困難，并且耦合 輔酶循環用酶對其整個催化體系要求更高。因而無法直接應用于實際工業化生產轉化研 究。
[0007] 生物法生產雖然對技術以及設備要求高。但由于此方法具有環保壓力小、反應專 一性高、產物分離純化容易突出等優勢已經成為未來可可堿研發生產的主流方向。其中篩 選、構建出可以應用于工業化生產的高活性、基因工程菌株，降低生產成本更顯得尤為重 要。研發關鍵在于尋找到可以應用于工業化生產的含有高活性、高專一性C1位咖啡因脫甲 基酶基因菌株，并進一步提高底物濃度獲得最佳可可堿轉化率與收率，提高酶活力，降低生 產成本。最終實現利用基因工程大腸桿菌全細胞代謝耦合的方法制備可可堿。

【發明內容】

[0008] 本發明提供了一種生物法制備可可堿的方法，本發明利用分子生物學手段，開發 了一種利用基因工程大腸桿菌全細胞生物法催化咖啡因去甲基化生成可可堿的方法。該方 法在極大程度上提高了可可堿的表達量與酶活力。
[0009] 為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：
[0010] 本發明提供了一種生物法制備可可堿的方法，所述方法是在C1咖啡因脫甲基化 酶CDMw或其突變體CDMm的催化作用下，進行咖啡因專一的C1位脫甲基化，從而得到可可 堿。
[0011] 本發明中，所述C1咖啡因脫甲基化酶CDMw具有如序列表的序列號1所示的核酸 序列。
[0012] 本發明中，所述C1咖啡因脫甲基化酶突變體序列CDMm具有如序列表的序列號2 所示的氨基酸序列。
[0013] 作為優選的技術方案，本發明所述的制備可可堿的方法包括：利用含有C1咖啡因 脫甲基化酶CDMw或其突變體CDMm的基因工程重組菌，進行咖啡因專一的C1位脫甲基化， 從而得到可可堿。
[0014] 作為任選的技術方案，本發明所述的制備可可堿的方法包括：利用含有輔酶循環 用酶和C1咖啡因脫甲基化酶CDMw和/或其突變體CDMm的基因工程重組菌，進行咖啡因專 一的C1位脫甲基化，從而得到可可堿。
[0015] 本發明中，所述基因工程重組菌中咖啡因脫甲基化酶基因來源優選但不限于假單 胞菌，例如還可以是枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌等等。
[0016] 優選地，所述輔酶循環用酶為葡萄糖脫氫酶，底物為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
[0017] 本發明中，所述基因工程重組菌的宿主細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母、假 單胞菌等，優選但不限于上述宿主細胞。由于咖啡因脫甲基化酶在不同宿主細胞中酶活力 表現差異較大，因而優選酶活力最高的大腸桿菌。
[0018] 本發明中，所述C1咖啡因脫甲基化酶CDMw或其突變體CDMm的表達載體包括 PET-22b、pET-28a(+)、pET-29a、pwb980、pA0815 或 Ppic9k 等等。例如可以采用包括所有含 有必須表達元件（啟動子、多克隆位點、終止子等）的任何載體，例如Novagen公司的原核 表達pET系列的氨節抗性載體、枯草芽孢桿菌表達載體pwb980、畢赤酵母表達載體pA0815， pPIC9k等等以及多種自殺質粒。
[0019] 作為進一步優選的技術方案，本發明所述的制備可可堿的方法可以為：利用Cl咖 啡因脫甲基化酶CDMw或其突變體序列CDMm與大腸桿菌自身電子傳遞鏈耦合配合的大腸桿 菌，進行咖啡因專一的C1位脫甲基化，從而得到可可堿。
[0020] 作為任選的技術方案，本發明所述的制備可可堿的方法還可以為：利用含有輔酶 循環用酶GH和C1咖啡因脫甲基化酶CDMw和/或其突變體序列CDMm多基因串聯與大腸桿 菌自身電子傳遞鏈耦合配合的大腸桿菌，進行咖啡因專一的C1位脫甲基化，從而得到可可 堿。
[0021] 本發明中，C1脫甲基化酶CDMw、CDMm、GH與全細胞耦合方式可以通過其他類型的 基因串聯方式耦合，例如可以是：不同的基因串聯順序，不同的RBS序列類型等，達到基因 串聯重組表達的最終目的。
[0022] 與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果：
[0023] 本發明的催化反應體系具備成分較為簡單，無毒性化學試劑污染，利于產物可可 堿的分離和純化等優點，提高了可可堿的轉化率和收率，其中，可可堿的轉化率可以達到 85%，為生物法催化咖啡因生產可可堿路線奠定基礎。
【附圖說明】
[0024] 圖1是C1咖啡因脫甲基化酶CDMw的瓊脂凝膠電泳圖譜；
[0025] 其中，圖1中Ml為Trans 2K Marker，從上到下大小（bp)分別為100、250、500、 750、1000、2000、3000、5000、8000 ;圖1