一種利用微生物發酵生產10-脫乙酰巴卡亭iii的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物制藥及醫藥工程領域，具體涉及到一種利用Tolumonasosonensi s生產10-脫乙醜巴卡亭111的方法，該方法以To lumonas osonensis CGMCCN0.7562為菌種，以巴卡亭III為底物，采用微生物ClO-脫乙酰基反應轉化生產10-脫乙酰巴卡亭III的方法。
【背景技術】
[0002]10-脫乙酰巴卡亭III (10-DAB)是紫杉烷類抗腫瘤藥物的典型代表一多烯紫杉醇的前體物質。它廣泛分布于紅豆杉植物的樹葉、根、皮、枝干中，在不同種植物的含量差異較大，但總體含量偏低，一般在0.00513%-0.175%左右。其傳統制備方法是從植物中進行提取，但此過程工藝步驟冗長、需要經過多次層析、梯度洗脫、多次重結晶后才能獲得精制品，不僅造成了 10-DAB的大量損失，降低了收率，而且過程中還大量使用乙腈和石油醚等有機溶劑，對環境造成不良影響。
[0003]微生物轉化是指某一微生物將一種物質(底物)轉化成為另一種物質(產物)的過程，其本質是利用生物體所產生的酶對外源化合物進行酶催化反應，它具有反應選擇性強(位置選擇性、立體選擇性)、反應條件溫和、副產物少和不造成環境污染等優點。Tolumonasosonensis是2011年Matthew等人發現的屬于甲苯單胞菌屬的一個新種，目前利用該菌株轉化巴卡亭III生產10-脫乙酰巴卡亭III的研究還未見報道。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種工藝簡單、副產物少、經濟實用、反應條件溫和且對環境友好的生產10-DAB的方法。
[0005]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0006]—種利用微生物發酵生產10-脫乙酰巴卡亭111的方法，采用To lumonasosonensis為發酵菌種，經一級種子培養、二級發酵培養，在得到的菌體發酵液中投入底物巴卡亭III，進行ClO-脫乙酰基反應轉化，生成10-DAB，所述的Tolumonas osonensis由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC N0.7562。
[0007]而且，所述的在制成的菌體發酵液投入巴卡亭III進行ClO-脫乙酰基反應的方式是:用有機溶劑將巴卡亭III助溶，配制成的溶液加入到菌體發酵液中，巴卡亭III投入的終濃度為0.04-lg/L，有機溶劑加入的體積比例為2-25%。
[0008]而且，所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯的其中一種。
[0009]而且，所述的ClO-脫乙酰基反應的轉化條件是:28-37°C、150-300r/min轉化培養60-144ho
[0010]而且，所述的Tolumonas osonensis的一級種子培養的方式是:將Tolumonasosonensis CGMCC N0.7562在斜面上培養，22°C_30°C下恒溫培養2_5d后，取一滿環至種子培養基中，22°C-30°C、120-280r/min振蕩培養18-30h，得到適于接種的種子培養液。
[0011]而且，所述的Tolumonas osonensis的二級發酵培養的方式是:將種子培養液以5%-15%的接種量接入發酵培養基，22°030°(3、120-28(^/1^11振蕩培養20-3211進行二級發酵培養，得到菌體發酵液。
[0012]一種利用微生物發酵生產10-脫乙酰巴卡亭111的方法，采用To lumonasosonensis為發酵菌種，經一級種子培養、二級發酵培養，得到的菌體，將菌體破碎，在破碎菌體菌懸液中投入底物巴卡亭II I，進行ClO-脫乙酰基反應轉化，生成1-DAB，所述的Tolumonas osonensis由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCN0.7562。
[0013]而且，所述破碎方法為化學破碎法、物理破碎法或干燥破碎。
[0014]而且，所述破碎方法為甲苯破碎、丙酮破碎、異丙醇破碎、超聲破碎、反復凍融破碎、冷熱交替破碎或干燥破碎。
[0015]本發明的有益效果是:
[0016]本發明提供的10-DAB的制備方法，以To lumonas osonensis為菌種，巴卡亭III作為底物采用微生物一步C1-脫乙酰基反應制備10-DAB。本方法具有操作簡單、反應專一性好、成本低、反應條件溫和、產物易于分離純化等優點，克服了現有方法步驟繁瑣、收率低、副產物多、分離純化困難、環境不友好等缺點。
[0017]本發明涉及的微生物轉化方法代替了傳統的從杉科植物中直接提取制備10-DAB的方法，具有操作簡單、反應專一性好、成本低、反應條件溫和、產物易于分離純化等優點。對用微生物轉化方法制備天然藥物具有非常重要的意義。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明中巴卡亭III轉化生成1-DAB的反應方程式；
[0019]圖2為本發明菌株Tolumonasosonensis CGMCC N0.7562轉化巴卡亭III生成 10-DAB的TLC結果。1:菌體對照，2:轉化液樣品，3:巴卡亭III標準品(0.3mg/mL) ,4: 10-DAB標準品(0.lmg/mL)；
[0020]圖3為本發明菌株Tolumonasosonensis CGMCC N0.7562轉化巴卡亭III生成 10-DAB的HPLC結果。圖3-1:巴卡亭III(0.3mg/mL)和 10_DAB(0.lmg/mL)的混合標準品；圖3_2:轉化液樣品；
[0021 ] 圖4為本發明菌株Tolumonas osonensis CGMCC Νο.7562轉化巴卡亭III反應的轉化產物的LC-MS圖，圖4-1:TOF MS負離子掃描模式，圖4-2:TOF MS正離子掃描模式。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖并通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
[0023]本發明所涉及的菌株TolumonasOsonensis P2-A-1 (以下簡稱T.0sonensis P2-A-1 )，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7562，所涉及公開文獻包括CN103509735A。
[0024]以下實施例中所用到的培養基與緩沖液為:
[0025]所用培養基:
[0026]①胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)(L—O:胰蛋白胨17.0g、大豆蛋白胨3.0g、NaCl
5.0g、K2HP04 2.5g、葡萄糖2.5g、pH=7.3，115°C滅菌20min。
[0027]②LB(Luria-Bertani)液體培養基(L—1):胰蛋白胨1g，酵母提取物5g，NaCl 1g，調節 pH=7.2。121°C 滅菌 20min。
[0028]所用緩沖液:
[0029]50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2):配制50mmol/L磷酸氫二鉀溶液300mL，用50mmol/L磷酸二氫鉀溶液將pH調至7.2。
[0030]具體論述如下:
[0031]一、菌株?\Osonensis P2-A-1轉化巴卡亭III實驗主要步驟如下:
[0032]⑴一級種子培養
[0033]將T.0sonensis P2-A-1作為生產菌株從TSB斜面培養基上接一滿環到50mL LB液體培養基的250mL三角瓶中，22°C200r/min振蕩培養ld，得到適于接種的種子培養液。
[0034]⑵二級發酵培養
[0035]將種子培養液以5%的接種量接種到裝有50mLLB液體培養基的250mL三角瓶中，22°C200r/min 振蕩培養 Id
[0036]⑶轉化實驗
[0037]向二級發酵培養液中加入I.5mg/mL的巴卡亭III甲醇溶液2mL，37°C200r/min繼續振蕩培養3d。實驗中，以不投加底物溶液的培養液作為空白對照。
[0038]轉化結束后加入50mL氯仿，37°C200r/min振蕩萃取lh，然后經5000r/min離心5min，得到氯仿萃取液。用等體積的氯仿萃取三次，合并萃取液，旋蒸以揮干有機溶劑。蒸干后的樣品用ImL甲醇復溶，用0.22μπι濾膜進行過濾，濾液即為待測樣品溶液，用高液相色譜法計算轉化率和產物生成率。
[0039]轉化產物分析
[0040]①薄層層析分析(TLC)
[0041]展開劑采用丙酮:石油醚= 2:3(ν/ν)，顯色劑采用硫酸:乙醇=1:9(v/v)，105°C下烘烤顯色l-3min，觀察斑點的顏色并計算比移值。
[0042]②高效液相色譜分析(HPLC)
[0043]色譜條件為:PhenomenexC18(5ym,250mmX4.6mm)；流動相:甲醇:乙臆:水(10:33:57，v/v/v)；檢測波長:227nm ；流速:0.8mL/min ；柱溫:30°C ；進樣量:10yL。
[0044]③高效液相色譜質譜聯用分析(LC-MS)
[0045]利用制備型硅膠板對轉化產物進行分離，展開劑為丙酮:石油醚=2:3(v/v)，顯色劑為硫酸:乙醇=1:9(v/v)，105°C下烘烤顯色l_3min后，在254nm紫外燈下觀察層析板，用鉛筆在轉化產物斑點所在位置處劃出范圍，用刀片小心刮下并收集此范圍內的硅膠于2.0mL Eppendorf管中，用ImL甲醇將產物從娃膠中反復洗脫下來，進行LC-MS分析。
[0046]色譜條件為:WatersC18色譜柱(100mm X 2.lmm)；流動相:5-95% 乙腈(0.I %FA-乙腈)，0-10min;流速:0.4mL/min;柱溫:40°C，進樣量10yL。質譜條件:電離源:電噴霧電離(ESI)；檢測模式:多反應監測；毛細管電壓:3kV;脫溶劑氣溫度:400°C ；脫溶劑氣流量:800L/h ；錐孔氣流量:30L/h ；離子源溫度:350°C ；碰撞氣流速0.12mL/min。
[0047]⑷按此方法進行實驗，結果發現在TLC板上菌株T.0sonensiSΡ2-Α-1的轉化液樣品中