一種人重組乙型干擾素融合蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種人重組乙型干擾素融合蛋白。
【背景技術】
[0002] 乙型干擾素（又稱為β干擾素，Interferon-β , IFN-β )是由體內纖維細胞和巨 噬細胞分泌的細胞因子，是一種糖蛋白，含166個氨基酸，分子量約為20, 500道爾頓，具有 抗炎癥功能，抗病毒、抗增殖以及免疫調節活性，其作為藥物可廣泛用于抗感染、抗腫瘤和 拮抗自身免疫性疾病。然而，乙型干擾素血漿半衰期短，只有頻繁給藥才能獲得令人滿意的 療效。但如此頻繁給藥在加上較長的治療周期，使得病人難以承受，迫切需要研制作用時間 長的乙型干擾素。
[0003] 人血清白蛋白（HSA)是人體血液中天然的物質輸送載體，血清中含量最高，其相對 分子量約為65kDa，由585個氨基酸組成的單鏈球型蛋白質，無酶學及免疫學活性，體內半 衰期長達19天。
[0004] 胳騎和S魚類動物體內存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy-chain antibody，HCAb)，這種抗體只包含一個重鏈可變區（variable domain of heavy chain of HCAb，VHH)和兩個常規的CH2與CH3區，單獨克隆并表達出來的VHH區，稱為重鏈單域抗體， 具有很好的結構穩定性與抗原結合活性，分子量只有15kDa，可溶性極高，不易聚集，能耐高 溫等致變性條件。
[0005] 噬菌體表面呈現技術是一種應用最廣泛的抗體庫技術，該技術通過構建抗體文 庫，然后將抗體基因表達于噬菌體表面，用固相化抗原對表達產物的載體進行淘篩，能夠獲 得高度特異性的抗體。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種重組乙型干擾素融合蛋白，該融合蛋白具有較長的半 衰期。
[0007] 本發明所述的一種人重組乙型干擾素融合蛋白，為人乙型干擾素與抗人血清白蛋 白重鏈單域抗體的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 根據本發明述的融合蛋白的進一步特征，所述抗人血清白蛋白重鏈單域抗體的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發明采用羊駝作為免疫動物，運用噬菌體表面呈現技術，從免疫羊駝外周血收 集淋巴細胞，構建了庫容量為5X IO7的抗人血清白蛋白（HSA)重鏈抗體文庫。通過HSA篩 選，獲得1株抗HSA的重鏈抗體。克隆該抗體的VHH獲得重鏈單域抗體，然后構建重鏈單域 抗體與乙型干擾素融合表達克隆，導入到宿主細胞進行表達，獲得具有較長作用時間的重 鏈單域抗體-乙型干擾素融合蛋白。
【附圖說明】
[0010] 圖1為在酵母細胞重組表達重鏈單域抗體-人乙型干擾素融合蛋白流程圖。
[0011] 圖2為pPicZ a -6His-Zipperl-CTHS-VHH-IFN轉化酵母菌后，挑取4單菌落的誘 導表達結果。
[0012] 圖3為重鏈單域抗體-人乙型干擾素融合蛋白細胞病變抑制結果。
【具體實施方式】
[0013] 以下結合具體實施例對本發明做進一步說明，目的在于解釋本發明的內容而非 限制發明的保護范圍。下面實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件， 如 Sambrook 等人著，分子克隆：試驗指南（New York，Cold Spring Habour Laboratory Press)中所述條件，或按照制造廠商建議條件進行。
[0014] 1.抗HSA重鏈單域抗體（VHH)的篩選
[0015] (1)羊駝的免疫
[0016] 用人血清白蛋白（HSA)免疫兩只羊駝，免疫方案如下：
[0017] 免疫羊馬它抗原用量：0· 5mg，0· 5mg，1.0 mg，1.0 mg，2. Omg，2. Omg，4. Omg，4. Omg。
[0018] 免疫間隔時間：2周。
[0019] 免疫方法：
[0020] 第一次免疫：抗原加弗式完全佐劑研磨混勻，皮下多點注射。
[0021] 后續免疫：抗原加弗式不完全佐劑,皮下多點注射,0. 5ml/點，4點/次。每次免疫 前取少量血,用ELISA方法檢測羊駝血中抗HSA抗體的滴度。
[0022] (2)抗HSA免疫噬菌體抗體庫的構建
[0023] 收集免疫羊駝外周血，分離淋巴細胞，提取總RNA，反轉錄合成cDNA。用特異性引 物，采用巢氏PCR方法擴增重鏈可變區片段。構建庫容量為5 X IO7的抗HSA免疫噬菌體抗 體庫，酶切鑒定重組率為90%。
[0024] 第一輪PCR引物：
[0025] 5,引物：5, -GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG-3, SEQ ID NO. 3
[0026] 5' -GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG-3' SEQ ID NO. 4
[0027] 3' 引物：5' -CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3' SEQ ID NO. 5
[0028] 5' -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3' SEQ ID NO. 6
[0029] 第二輪PCR引物：
[0030] 5,弓丨物：
[0031] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG-3 , SEQ ID NO. 7
[0032] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 8
[0033] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 9
[0034] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 10
[0035] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGCAGCTGGTGGATTCTGG-3 , SEQ ID NO. 11
[0036] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 12
[0037] 3,弓丨物：
[0038] 5, -GGACTAGTGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTG-3, SEQ ID NO. 13
[0039] 5' -GGACTAGTGCGGCCGCTATGAGGAGACGGTGACCTG-3' SEQ ID NO. 14
[0040] 第一輪PCR反應條件：94°C 5分鐘預變性，94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 50秒，35個 循環，72 °C 10分鐘。
[0041] 第二輪PCR反應條件：94°C 5分鐘預變性，94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 50秒，30個 循環，72 °C 10分鐘。
[0042] (3)抗HSA免疫噬菌體抗體庫的富集篩選
[0043] 篩選抗原為HSA，用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，濃度為5 μ g/ml，取2ml包被 免疫試管，對抗體庫進行3輪富集篩選后，用噬菌體-ELASA方法篩選陽性克隆。
[0044] (4)抗HSA免疫噬菌體抗體庫的篩選
[0045] 挑選192個富集篩選后的單菌落，37°C振搖過夜。然后按I :100轉接于新鮮 200ul2YTGA中，37°C振搖2. 5小時，M13K07超感染。3,500rpm，IOmin收集菌體，然后用 2001112￥了641(重懸細菌沉淀。301：振搖過夜，次日11，000印111離心151^11，取上清進行鑒定。 用HSA包被ELISA板，加入上述上清，HRP標記鼠抗噬菌體M13單抗（GE Healthcare)為二 杭，TMB顯色。M13K07為陰性對照，免疫羊駝血清為陽性對照。對抗體庫進行篩選，獲得1 株陽性克隆。然后對陽性克隆進行測序，獲得抗HAS的VHH序列，其序列為SEQ ID NO. 2。
[0046] 2.表達VVH-IFN的酵母表達載體的構建
[0047] His-Zipper2_CTHS的DNA序列通過分別通過EcoRI和XhoI位點插入到 pPicZ α中，再通過BsaI和Xhol位點插入抗HAS的VHH，最后通過XhoI和XbaI位點 插入乙型干擾素 IFN，構建酵母表達質粒pPicZa -6His-Zipperl-CTHS-VHH-IFN，其中， 6His-Zipperl-CTHS-VHH-IFN 的序列為 SEQ ID NO. 1。
[0048] 其中，CTHS是SUMO的C末端（C-SUMO)的簡寫。對應的SUMO的N端簡稱為NTHS (或NT)，Zipper是指亮氨酸拉鏈。
[0049] 實施例2.酵母表達和蛋白純化
[0050] 將質粒pPicZ a -6His-Zipperl-CTHS-IFN轉化到畢赤酵母，挑取單克隆，接種至 含100ml BMGY培養基的IL隔板搖瓶中。在搖床中28-30°C，250-300rpm生長至0D600=2-6， 以1500-3000g離心5min收集細胞，去除上清，用1/5-1/10原培養基體積的BMMY重懸細胞 (約10-20ml )，在接種于100mL隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床 繼續培養。每隔24小時，加入甲醇至終濃度為0. 5%以誘導。
[0051] 誘導結束后，以12, OOOrpm離心30min,取上清,用孔徑為0. 45 μ m濾膜過濾,然后 進行Ni-NTA親和層析，采用連續梯度洗脫方式(平衡液：50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl, 2.5%Glycerol;洗脫液：50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl，2.5%Glycerol，500mM Imidazol)， 按峰收集，每個收集樣品進行SDS-PAGE電泳檢測。
[0052] 將含有目的蛋白的收集樣品合并，加入6His-NTHS-Zipper2蛋白混勻， 6His-Zipperl-CTHS和6His-NTHS-Zipper2能夠重建SUMO蛋白分子（該方法見專利 ZL200810036879. X)。然后將混合物進行SUMO酶切，切除重組成為完整的SUMO分子酶切的 反應條件是按照Genecopoeoia公司CoolcutTM protease產品說明書建議進行。
[0053] 然后，將酶切產物進行Ni-NTA親和層析(平衡液：50mM Tris(pH8. 0)，50mM NaCl， 2.5%Glycerol，洗脫液：50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl，2.5%Glycerol，500mM Imidazol)， 收集穿透液，隨后進行SDS-PAGE電泳檢測，獲得了 VHH-IFN蛋白。
[0054] 實施例3.乙型干擾素細胞病變抑制法（cytopathic effect inhibition, CPEI)
[0055] 將不同稀釋度的乙型干擾素樣品加入96孔平底培養板中，100 μ 1/孔；將不同稀 釋度的標準品加入96孔平底培養板中，100 μ 1/孔；每孔加4X106/ml Wish細胞，100 μ 1/ 孔；除Wish細胞對照孔外，每孔加 VSV病毒，50 μ 1/孔；置5%C02, 37°C培養箱培養48-52小 時；鏡下觀察病毒對照孔出現細胞病變時，棄上清，加入結晶紫染液染色5分鐘；用流水沖 洗培養板，直到沖洗液無色為止，晾干培養板；每孔加入70%乙醇150 μ 1/孔。使結晶紫充 分溶解；酶標儀上比色，讀取600nm波長的數值。
[0056] 米用Avonex (美國BIOGEN公司生產的乙型干擾素）作為對照，該藥于1995年通 過美國FDA批準使用的用于多發性硬化病的治療藥，結果顯示，本發明所述的人重組乙型 干擾素融合蛋白（VHH-IFN蛋白）具有與對照相似的活性。
【主權項】
1. 一種人重組乙型干擾素融合蛋白，為人乙型干擾素與抗人血清白蛋白重鏈單域抗體 的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述抗人血清白蛋白重鏈單域抗體 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【專利摘要】本發明涉及一種人重組乙型干擾素融合蛋白。所述人重組乙型干擾素融合蛋白為人乙型干擾素與抗人血清白蛋白重鏈單域抗體的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗人血清白蛋白重鏈單域抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明通過構建抗人血清白蛋白的重鏈單域抗體與乙型干擾素融合表達克隆，導入到宿主細胞進行表達，獲得具有較長作用時間的重鏈單域抗體-乙型干擾素融合蛋白。
【IPC分類】C07K19/00
【公開號】CN104974263
【申請號】CN201410140796
【發明人】李華平, 張金闊, 錢柳青, 范名俊, 朱苗苗
【申請人】廣州復能基因有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月9日